SIRPα-GFP真核表达载体构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的：构建信号调节蛋白α-绿色荧光蛋白（SIRPα-GFP）真核表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达SIRPα-GFP融合蛋白的细胞系,研究SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞的膜定位。方法：将SIRPα质粒和带有GFP的表达载体分别用限制性内切酶MluⅠ和SgfⅠ进行双酶切,将SIRPα基因克隆到pLenti-GFP载体中,构建pLenti-SIRPα-GFP质粒;将pLenti-SIRPα-GFP质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对重组质粒pLenti-SIRPα-GFP进行DNA测序;采用Lipofectamine 3000转染试剂将pLenti-SIRPα-GFP质粒转染到HEK293T细胞中,通过荧光显微镜观察SIRPα-GFP在稳定转染HEK293T细胞中的表达,采用Western blotting法检测HEK293T细胞中SIRPα-GFP融合蛋白的表达。结果：酶切鉴定和DNA测序,重组质粒pLenti-SIRPα-GFP构建成功。荧光显微镜检测,SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞膜上表达。Western blotting法检测,SIRPα蛋白在pLenti-SIRPα-GFP质粒转染的HEK293T细胞中成功表达。结论：成功构建了pLenti-SIRPα-GFP质粒。通过在HEK293T细胞中转染pLenti-SIRPα-GFP质粒,成功制备了稳定表达SIRPα-GFP的细胞系。SIRPα-GFP蛋白定位于HEK293T细胞的细胞膜上。     

miR-137过表达慢病毒的包装和鉴定

目的：构建miR-137过表达慢病毒载体并进一步包装慢病毒,探讨miR-137在HEK293T细胞中的感染效率和表达水平。方法：化学合成miR-137序列并克隆到慢病毒载体GV209,得到并鉴定含有目的片段的重组质粒,采用Lipofectamine 2000共转miR-137重组质粒与慢病毒辅助包装质粒到HEK293T细胞中生产慢病毒。以感染复数（MOI）值为40感染HEK293T细胞48h后,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达,采用荧光定量PCR法检测HEK293T细胞中miR-137的表达水平。结果：测序结果,目的基因序列与GenBank公布的miR-137基因序列完全一致。在感染的HEK293T细胞中观察到GFP的表达。过表达慢病毒感染细胞中miR-137表达水平是对照细胞的12.74倍。结论：成功包装miR-137过表达慢病毒,并可高效感染HEK293T细胞。     

人类pEGFP/H2B真核表达质粒的构建及表达

目的:构建人H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HEK293细胞中表达.方法:通过RT-PCR从HEK293细胞总RNA中扩增获得H2B基因的部分cDNA序列,与载体pEGFP-C1连接构建H2B基因与GFP融合表达的真核表达质粒pEGFP/H2B,经酶切和测序鉴定;应用脂质体转染技术将重组质粒转染HEK293细胞观察融合蛋白的表达.结果:成功构建H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达载体,与对照组中转染空载体pEGFP-C1的HEK293细胞中的弥漫荧光相比,转染重组质粒的细胞中可观察到绿色荧光蛋白集中表达在细胞核内,分裂期细胞中可见与染色体形态一致的绿色荧光.结论:该载体的成功构建为研究染色体的分离机制建立了有效的观察体系.     

人TLR9真核表达载体在HEK293T细胞中的表达

目的 构建人Toll样受体9(TLR9)全长序列与绿色荧光蛋白GFP的重组质粒,观察融合蛋白在HEK293T细胞内表达并检测其应答CpG DNA的能力.方法 PCR法扩增TLR9全长,限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切绿色荧光真核表达质粒pcDNA3/GFP和TLR9全长,构建重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP,脂质体转染人胚肾293T细胞(HEK293T),荧光显微镜下观察绿色荧光融合蛋白在细胞内的表达与分布;将重组质粒与NF-κB荧光素酶报告质粒pGL2-luc共转染HEK293T细胞,CpG DNA(10 mg/L)刺激后,化学发光法检测细胞内荧光素酶活性.结果 成功构建pcDNA3-TLR9/GFP质粒,经酶切及测序分析证实载体构建正确;转染细胞后,在荧光显微镜下观察到TLR9/GFP融合蛋白大量表达;重组质粒与pGL2-luc共转染细胞,应用荧光报告系统检测显示,CpG DNA刺激后荧光素酶活性显著高于生理盐水对照组(P<0.01).结论 重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP在HEK293T细胞中表达的TLR9/GFP绿色荧光融合蛋白,能够识别CpG DNA并诱导增加胞内NF-κB转录活性.     

磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基p55PIK表达载体的构建及单克隆株的筛选

目的 构建表达载体pEGFP-N1-p55PIK,在人胚胎肾细胞株HEK293中筛选其稳定表达的细胞株.方法 PCR扩增p55PIK基因全长,经过Xho1和Xma1酶切、T4 DNA连接酶连接、DH5α转化,酶切和测序鉴定以确定构建质粒正确.转染人胚胎肾细胞株HEK293,G418筛选稳定表达p55PIK的单克隆细胞株,应用Western blot方法检测p55PIK蛋白的表达.结果 pEGFP-N1-p55PIK质粒经PCR、酶切、测序鉴定正确,经过G418筛选后获得稳定细胞株,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白在HEK293细胞中的表达,Western blot检测结果显示稳定转染pEGFP-N1-p55PIK的细胞中p55PIK表达水平增高.结论 正确构建表达载体pEGFP-N1-p55PIK,并在HEK293细胞中成功筛选出稳定表达p55PIK的细胞株,为进一步探讨p55PIK的功能提供了良好的工具.     

miR-186过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞（HEK）293T细胞系中的感染效率和表达水平。方法：以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin的慢病毒载体FV040中,经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切及测序鉴定后获得重组慢病毒载体。利用Lipofectamine 2000将重组慢病毒质粒FV040 Vector和FV040 miR-186分别与辅助质粒通过共转染至HEK293T细胞中,48 h后收集慢病毒,以FV040 Vector慢病毒作为对照组,FV040 miR-186作为实验组,分别感染HEK293T细胞。感染48 h后,观察HEK293T细胞中绿色荧光的分布情况,并采用实时荧光定量PCR法检测miR-186的表达水平。结果：测序分析,miR-186过表达慢病毒与GenBank上公布的miR-186序列完全一致。与对照组（0.8387±0.1456）比较,实验组HEK 293T细胞中miR-186表达水平（12.6400±0.7884）明显升高（t=14.72,P<0.01）,约为对照组的15.07倍。结论：成功构建miR-186过表达慢病毒载体并包装出慢病毒,miR-186慢病毒成功感染HEK293T细胞,miR-186表达水平在HEK293T细胞中明显升高。     

人STAT4基因真核表达载体构建和在HEK293细胞中表达

目的 构建STAT4基因的真核表达载体,在人胚肾细胞系HEK293中表达.方法 设计引物、采用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中获得STAT4的cDNA全长序列,在PCR产物两端加上SalI和BamHI限制性内切酶识别序列,将pEGFP-C1载体和PCR产物用SalI和BamHI进行双酶切,将STAT4 cD-NA定向克隆到pEGFP-C1中,从而构建了重组质粒pEGFP-STAT4;经酶切和测序鉴定正确后,将pEGFP-STAT4体外转染HEK293细胞,瞬时表达带有GFP标签的STAT4融合蛋白;采用荧光显微镜技术和免疫印迹技术检测融合蛋白的表达.结果 RT-PCR扩增了2 247 bp的STAT4 cDNA全长,经测序分析与GenBank中已知序列一致;重组质粒pEGFP-STAT4转染HEK293细胞中,可检测到瞬时表达的GFP-STAT4融合蛋白.结论 成功构建重组质粒pEGFP-STAT4,在真核细胞HEK293中能被表达.     

LAG3慢病毒质粒构建及其稳定转染细胞系的建立

目的:构建淋巴细胞活化因子3(LAG3)-mCherry红色荧光蛋白的LAG3-mCherry慢病毒表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达LAG3-mCherry融合蛋白的细胞系,探讨LAG3-mCherry融合蛋白在HEK293T细胞中的定位.方法:将LAG3质粒和带有mCherry的慢病毒载体分别用限制性内切...     

pNTAP-MK2真核表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立

目的 构建pNTAP-MK2真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系.方法 将MK2亚克隆至串联亲和纯化载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-MK2,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用脂质体PolyFect介导将其转染至HEK293细胞中,再通过G418筛选建立稳定表达TAP tag-MK2融合蛋白的HEK293细胞系;利用Western blotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAP tag-MK2的表达及细胞内定位情况.结果 重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达,表达产物TAP tag-MK2主要分布在核内.结论 成功构建pNTAP-MK2真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系,TAP标签未对MK2定位产生明显影响.     

人THAP11慢病毒载体的构建及表达研究

目的 构建人死亡相关蛋白11(THAP11)基因的慢病毒载体,并建立其慢病毒表达系统.方法 PCR方法获得人THAP11基因,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒pBPLV-THAP11-myc,并通过转染HEK293细胞观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达以及Western blot检测其表达.在脂质体介导下将重组质粒与包装质粒pLP1和pLP2、包膜质粒pLP/VSVG共转染293FT细胞包装产生慢病毒.结果 构建的质粒经PCR,酶切及测序鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293FT细胞获取的5.5×106TU/ml慢病毒滴度.结论 成功构建了人THAP11基因慢病毒载体质粒THAP11-myc-pBPLV,并建立了其慢病毒表达系统,为后续的应用研究奠定了基础.     

p38丝裂原激活蛋白激酶基因重组慢病毒载体的构建及其在建立人前列腺癌稳定细胞株中的应用

目的构建p38丝裂原激活蛋白激酶基因(MAPK)重组慢病毒载体并建立表达外源性p38基因的人前列腺癌稳定细胞株。方法采用限制性内切酶酶切、T4 DNA连接酶连接等方法,将EGFP/p38融合基因插入慢病毒载体pTYF-EF1α-IRES-EGFP中,构建启动子EF1α调控的EGFP/p38共表达慢病毒载体pTYF-EF1α-EGFP/p38,经酶切鉴定后,利用慢病毒三质粒系统,通过脂质体法转染包装细胞HEK 293T细胞,收集病毒上清后转导人前列腺癌DU145细胞株,经有限稀释法筛选重组EGFP/p38稳定细胞株,用Western blotting检测细胞总p38的表达,用计数法绘制细胞的生长曲线。结果经酶切鉴定,成功构建EGFP/p38重组慢病毒载体,并包装慢病毒,检测病毒悬液的滴度为4.7×106 TU/ml,利用此病毒悬液感染DU145细胞,成功筛选到EGFP/p38稳定表达细胞株,Western blotting显示该细胞株能稳定表达外源性EGFP/p38融合蛋白,这种过表达p38的细胞株的生长速度明显低于对照组。结论成功构建p38 MAPK重组慢病毒载体并建立了表达外源性p38 MAPK基因的稳定细胞株EGFP/p38-DU145,细胞内p38过表达能够抑制DU145细胞的增殖。     

RHBDF2-shRNA慢病毒载体的构建和Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系的建立

目的：构建RHBDF2-shRNA慢病毒载体,建立Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,并检测稳转细胞株中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平。方法：根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成针对RHBDF2基因干扰靶点的shRNA-oligo,退火后将其连接到经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒载体FV067-RNAi-EGFP-Puro中,构建FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒,通过PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。使用HEK293T细胞和Neuro-2a细胞作为实验材料,FV067 Vector作为对照组,FV067-RHBDF2-shRNA作为实验组。通过Lipofectamine 2000将FV067 Vector和FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒分别与慢病毒辅助质粒psPAX2和pMD2G共转染至HEK293T细胞中,转染48 h收集并纯化慢病毒,分别将对照组FV067 Vector和实验组FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒在感染复数（MOI）为50时感染Neuro-2a细胞,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达,采用2 mg·L^-1嘌呤霉素筛选出RHBDF2基因稳定沉默的细胞系。实时荧光定量PCR法检测2组细胞中RHBDF2 mRNA表达水平,免疫印迹法检测2组细胞中RHBDF2蛋白表达水平。结果：PCR和测序,RHBDF2-shRNA慢病毒载体中的干扰序列与设计合成的RHBDF2-shRNA-oligo序列完全一致。FV067 Vector慢病毒的滴度为5×10⁸ TU·mL^-1,FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒的滴度为3×10⁸ TU·mL^-1。实时荧光定量PCR检测,实验组稳转细胞株中RHBDF2 mRNA表达水平比对照组降低了52.26%（t=11.44,P=0.0076）。免疫印迹法检测,与对照组比较,实验组RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2蛋白表达水平降低了47%（t=6.374,P=0.0078）。结论：成功构建了FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒载体并建立了Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,且Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2mRNA和蛋白表达水平明显降低。     

灵长类动物限制性因子SAMHD1的生物学功能分析

目的：探讨不同灵长类动物限制因子不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1（SAMHD1）的抗病毒、抑制逆转录转座子LINE-1和减弱干扰素（IFN）产生信号通路等作用,为灵长类动物SAMHD1的研究提供依据。方法：构建稳定表达不同灵长类动物SAMHD1蛋白的U937细胞系,以空载体构建的细胞作为阴性对照组,以稳定表达不同灵长类动物SAMHD1蛋白的U937细胞系为实验组。经佛波酯（PMA）刺激分化成巨噬样细胞后,流式细胞术分析各组HIV-1病毒感染率。以单独转染SAMHD1表达质粒的HEK293T细胞为对照组,共同转染SAMHD1与HIV-2/SIV Vpx表达质粒的细胞为实验组,转染后48 h收获细胞,采用Western blotting法检测SAMHD1蛋白表达水平,免疫荧光检测法观察不同SAMHD1蛋白的细胞内定位。以单独转染LINE-1-GFP报告质粒的HEK293T细胞作为对照组,以共同转染LINE-1-GFP与SAMHD1表达质粒的细胞为实验组,采用流式细胞术检测GFP阳性细胞率,代表SAMHD1对LINE-1转座子的活性。以单独转染IFN-luc报告质粒的HEK293T细胞为对照组,共同转染IFN-luc和SAMHD1表达质粒的细胞为实验组,采用化学发光仪检测HEK293T细胞中荧光素酶的表达水平。结果：与阴性对照组比较,灵长类动物SAMHD1稳定表达的实验组HIV-1病毒感染率明显降低（P<0.01）。与对照组比较,实验组灵长类动物SAMHD1蛋白表达水平降低（P<0.05或P<0.01）。免疫荧光检测,灵长类动物SAMHD1蛋白均定位于细胞核中。与对照组比较,实验组GFP阳性细胞率明显降低,即SAMHD1对LINE-1转座子活性降低（P<0.05或P<0.01）。与对照组比较,实验组灵长类动物HEK293T细胞中荧光素酶表达水平明显降低（P<0.05）。结论：不同灵长类动物SAMHD1蛋白具有抵抗HIV-1病毒感染、抑制逆转录转座子LINE-1以及拮抗天然免疫系统产生IFN的作用。     

腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间质干细胞的比较

目的比较腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间质干细胞（rMSCs）的荧光病毒基因表达的稳定性及持续时间。方法将含有绿色荧光蛋白（GFP）基因的慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染293T细胞,重组包装;将慢病毒和腺病毒载体分别感染rMSCs,培养5周,分别在1、3、5周通过流式细胞仪检测GFP的表达情况。从GenBank中调出人骨形态发生蛋白2（hBMP2）基因序列,设计带有NheⅠ、AgeⅠ双酶切位点引物。从人肝脏组织中抽提总RNA,再逆转录成cDNA,扩增出hBMP2基因的全长序列。测序验证后克隆到慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上,通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒载体。将该重组慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染293T细胞,通过重组而包装成能表达hBMP2基因的有活性的慢病毒。结果两种病毒载体感染后1周,绿色荧光蛋白表达分别是90％和71％,到5周时,慢病毒载体的绿色荧光蛋白表达明显高于腺病毒载体,分别是79％和0．05％。扩增出1．2kb左右的hBMP2全长基因与GeneBank中的hBMP2阅读框架序列完全一致;成功克隆和构建了含hBMP2基因的慢病毒载体pHIV-hBMP2;对慢病毒载体进行了成功包装和分析。结论含hBMP2基因的慢病毒载体可成功构建。慢病毒载体对大鼠骨髓间质干细胞的转染效率明显优于腺病毒载体。     

mTIGIT-mLumin跨膜融合蛋白慢病毒载体和真核表达载体的构建及体外的稳定表达

目的: 构建以mLumin荧光蛋白为指示系统的小鼠T细胞免疫球蛋白和结构域蛋白(mouse T cell Ig and ITIM domin,mTIGIT)胞外区真核表达载体,并表达mTIGIT-mLumin融合蛋白。方法: 分别设计mTIGIT和mLumin的特异性引物,通过PCR技术扩增两个目的基因序列,经酶切、连接,克隆至plenti-puro和pcDNA3.1载体。将构建的plenti-puro-mTIGIT-mLumin慢病毒载体进行病毒包装并感染HEK-293T细胞,而pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin真核表达质粒转染非洲绿猴肾成纤维Cos7细胞,利用两种表达载体的药物抗性进行筛选感染或转染的细胞,检测融合蛋白的表达情况。结果： 通过PCR顺利扩增获得mTIGIT和mLumin,经酶切、连接插入至载体,基因测序结果证实克隆的mTIGIT和mLumin片段序列正确,并成功正确插入到plenti-puro载体和pcDNA3.1载体中;荧光显微镜和共聚焦显微镜观察显示,转染的HEK-293T细胞和Cos7细胞经过筛选能够稳定表达mTIGIT-mLumin融合蛋白。 结论： 成功构建plenti-puro-mTIGIT-mLumin慢病毒载体和pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin真核表达载体,且能够在目的细胞中稳定表达mTIGIT-mLumin融合蛋白。     

过表达TrxR1重组HEK293细胞株的构建和鉴定

目的 构建稳定过表达硫氧还蛋白还原酶1（TrxR1）的HEK293细胞株,为TrxR1的功能研究以及靶向TrxR1药物筛选提供细胞模型。方法 通过PCR扩增,连接转化以及Sanger双脱氧测序构建并筛选出TrxR1的重组慢病毒表达载体pLVX-PuroTXNRD1,转染HEK293细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定转染细胞株。后续研究分为3组进行：①TrxR1过表达HEK293细胞：pLVX-Puro-TXNRD1载体稳定转染细胞;②对照HEK293细胞：pLVX-Puro空载病毒载体稳定转染细胞;③正常HEK293细胞;通过RT-qPCR、Western blot实验检测上述3组细胞中TrxR1的mRNA以及蛋白表达情况;通过胰岛素终点法以及TRFS-green探针成像检测上述3种细胞内TrxR1的酶活力;通过CCK8实验检测上述3种细胞对TrxR1特异性抑制剂auranofin的敏感性。结果 构建载体经DNA测序,成功获得插入TrxR1的重组慢病毒表达载体pLVX-Puro-TXNRD1。与HEK293以及HEK293-NC细胞相比,HEK293-TrxR1-OE细胞中TrxR1的mRNA和蛋白高表达,且酶活力也同样显著上升（P<0.005）;而与HEK293以及HEK293-NC细胞相比,auranofin对HEK293-TrxR1-OE细胞中TrxR1酶活力以及细胞增殖的抑制效率均显著下降（P<0.005）。结论 通过构建pLVX-Puro-TXNRD1慢病毒载体,成功获得过表达TrxR1酶的HEK293细胞株,该细胞对特异性靶向TrxR1的抑制剂的抗增殖作用具有抵抗,因而可用于靶向TrxR1药物的筛选。     

Has-mir-335慢病毒表达载体的构建及其靶基因鉴定

目的构建过表达miR-335的稳定细胞株SW620并筛选和初步鉴定miR-335的靶基因。方法扩增包含hsa-miR-335前体序列在内的基因片段,并将其亚克隆至PLVTHM慢病毒载体;扩增包含RASA1 3’UTR种子区域的基因片段并将其亚克隆至psiCHECK-2载体,并对此重组载体进行定点突变构建psiCHECK-2-RASA1-Mut;检测萤火虫荧光素值(F)和海肾荧光素值(R),以R/F表示相对荧光素酶活性。流式细胞仪筛选建立稳定表达miR-335的细胞株,利用荧光定量PCR检测miR-335及其靶基因RASA1的表达,Western Blot检测RASA1蛋白水平的表达。结果质粒双酶切以及测序鉴定PLVTHM-miR335、psiCHECK-2-RASA1、psiCHECK-2-RASA1-Mut重组质粒构建成功。荧光定量PCR显示结直肠癌细胞中miR-335与RASA1表达趋势成负相关。双荧光素酶报告基因分析证实hsa-miR-335能够作用于RASA1的3’UTR。稳定过表达miR-335的细胞中,miR-335的表达明显高于对照组和未处理组,蛋白质水平有所下降。结论成功构建了PLVTHM-miR-335慢病毒重组质粒,构建过表达miR-335的细胞株SW620,初步证实RASA1是miR-335的靶基因。     

人生发中心激酶基因克隆及其转基因细胞的构建

目的克隆人生发中心激酶（GCK）基因,并构建含有该目的基因的pIRES2-EGFP重组质粒载体,获得稳定表达GCK分子的基因转染细胞。方法采用RT-PCR法从pCMV5-GCK质粒载体上克隆GCK基因,通过双酶切（BglⅡ,SalI）装入pIRES2-EGFP质粒载体中,脂质体法共转染HEK293细胞,24 h后加入G418进行筛选,挑选出能稳定表达GCK蛋白的HEK293细胞株。结果构建了用于表达的含GCK基因的pIRES2-EGFP质粒载体,继而经RT-PCR、Western blot检测筛选出稳定表达人GCK蛋白的HEK293转基因细胞。结论构建了含人GCK基因重组pIRES2-EGFP质粒载体和稳定表达人GCK蛋白的细胞株,为该基因功能的后续研究奠定了基础。