Wnt/β-catenin信号通路在多发性骨髓瘤中的机制研究进展

多发性骨髓瘤（MM）是一种以骨髓浆细胞恶性增殖为特征的血液肿瘤,其发生机制与相关的信号通路异常有着密切关系。Wnt/β-catenin信号通路可参与调节细胞的增殖、分化和凋亡等生物学过程,且与细胞癌变相关。在MM中,异常表达的非编码RNAs、转录因子、蛋白酶和分泌蛋白等可激活Wnt/β-catenin信号通路,进而加速MM的发生和发展。因此,Wnt/β-catenin信号通路在MM的发病机制中具有重要地位。整理总结MM中相关非编码RNAs、转录因子、蛋白酶和分泌蛋白等影响Wnt/β-catenin信号通路的研究进展,以期为相关研究提供参考。     

circMTO1调控Wnt/β-catenin抑制乳腺癌细胞增殖和转移能力的机制研究

目的 研究环状RNA MTO1（circMTO1）对乳腺癌细胞增殖和转移的影响及其可能机制。方法 收集102例浸润性乳腺癌患者的癌组织及癌旁组织,选用乳腺癌细胞系MDA-MB-231、HCC-70、MCF-7和人乳腺正常细胞系MCF-10A,采用荧光定量PCR（qPCR）检测circMTO1在乳腺癌组织和细胞系中的表达水平。分别构建circMTO1过表达和circMTO1敲减质粒转染乳腺癌细胞系,分为NC组、oe-circMTO1组和sh-circMTO1组,qPCR检测转染效果。MTS实验检测各组细胞增殖能力,Transwell实验检测各组细胞转移能力。TOP/FOP荧光素酶实验检测各组细胞Wnt/β-catenin信号通路活性,Western blot检测各组细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白Wnt3a、β-catenin、cMyc、Cyclin D1和基质金属蛋白酶7（MMP7）的表达。结果 与癌旁组织和人正常乳腺细胞系相比,circMTO1在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中的相对表达量降低（P<0.05）。有淋巴结转移和TNM分期为Ⅲ期的乳腺癌患者组织中circMTO1的相对表达水平较低（P<0.05）。与NC组相比,oe-circMTO1组circMTO1相对表达量增加,细胞的增殖、转移能力以及Wnt/β-catenin信号通路活性减弱,Wnt3a、β-catenin、cMyc、Cyclin D1和MMP7蛋白表达水平降低（P<0.05）;sh-circMTO1组circMTO1相对表达量降低,细胞的增殖、转移能力以及Wnt/β-catenin信号通路活性增强,Wnt3a、β-catenin、cMyc、Cyclin D1和MMP7蛋白表达水平增加（P<0.05）。结论 circMTO1在乳腺癌细胞中呈低表达,circMTO1通过抑制Wnt/β-catenin信号通路活性,从而抑制乳腺癌细胞的增殖和转移能力。     

γ-分泌酶抑制剂在肺纤维化上皮间质转化中的作用

目的 检测体外转化生长因子（TGF）-β1诱导肺纤维化上皮间质转化（EMT）的形成情况并检测Notch信号特异性抑制剂γ-分泌酶抑制剂（DAPT）对其影响及可能机制。方法 将A549细胞分成对照组（RPMI 1640完全培养基培养）、TGF-β1组（在含有10 μg/L TGF-β1的RPMI 1640培养基中培养）、TGF-β1+DAPT组（在含有10 μg/L TGF-β1和2 μmol DAPT的RPMI 1640培养基中培养）、DAPT组（在含有2 μmol DAPT的RPMI 1640培养基中培养）。通过倒置显微镜观察细胞形态,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测肺泡上皮细胞特异性蛋白E-钙黏合素以及间质细胞特异性蛋白α-肌动蛋白（α-SMA）mRNA相对表达水平,Western blot检测E-钙黏合素以及α-SMA蛋白表达水平。结果 倒置显微镜检查示,对照组细胞呈多边形,铺路石样,细胞间连接紧密;TGF-β1组细胞呈梭行,纺锤状,细胞间连接减少;TGF-β1+DAPT组仅有少量细胞呈梭形,多数细胞形态与对照组相似;DAPT组细胞形态大致同对照组。与对照组相比,TGF-β1组α-SMA蛋白及mRNA表达增加,而E-钙黏合素蛋白及mRNA表达减弱（P<0.05）;与TGF-β1组比较,TGF-β1+DAPT组α-SMA蛋白及mRNA表达水平降低,而E-钙黏合素蛋白及mRNA表达水平增加（P<0.05）;DAPT组与对照组2指标的蛋白与mRNA相对表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。结论 TGF-β1可诱导肺上皮间质转化,而Notch信号抑制剂DAPT能够阻断、部分或全部逆转这一过程。     

石蒜碱通过TLR4/NF-κB途径抑制LPS诱导的原代小胶质细胞炎症反应

目的 观察石蒜碱（LYC）对脂多糖（LPS）诱导的原代小胶质细胞炎症反应和表型变化的影响,并探讨其作用机制。方法 将培养的原代小胶质细胞分为对照组、LYC组（0.1、0.5、1和5 μmol/L LYC）、LPS组（0.1 mg/L LPS）和LPS（0.1 mg/L LPS）+LYC组（5 μmol/L LYC）。倒置显微镜观察细胞形态变化;流式细胞术检测原代小胶质细胞的纯度及LPS诱导原代小胶质细胞向两种表型转化的情况;CCK-8法检测细胞活性;实时荧光定量PCR（qPCR）检测白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）以及不同表型小胶质细胞表面标志物mRNA表达;Griess法检测一氧化氮（NO）含量;免疫印迹法检测细胞TLR4、p-NF-κB p65蛋白表达情况。结果 原代小胶质细胞纯度达95%以上。对照组及各浓度LYC组细胞活性差异无统计学意义。后续实验以5 μmol/L的LYC为药物浓度。与LPS组相比,LPS+LYC组的阿米巴样小胶质细胞数量明显减少,IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达水平以及NO含量降低,CD86 mRNA表达水平和表型比例降低,CD206 mRNA表达水平和表型比例升高,TLR4和p-NF-κB p65蛋白表达水平降低（P<0.01）。结论 LYC通过TLR4/NF-κB信号通路抑制LPS诱导的原代小胶质细胞炎症反应,并促进其向“抑炎型”极化。     

内毒素血症通过下调HNF4α表达加剧肝损伤

目的 探讨内毒素血症下调肝细胞核因子4α（HNF4α）表达介导肝损伤进展的机制。方法 144只BALB/c小鼠采用随机数字表法分组进行以下实验：（1）四氯化碳（CCl₄）诱导小鼠急性肝损伤。对照组和0.5 mL/kg、1.0 mL/kg、2.0 mL/kg CCl₄组。（2）筛选脂多糖（LPS）干预小鼠的剂量。对照组和0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、2.5 mg/kg LPS组。（3）LPS干预CCl₄（1.0 mL/kg）诱导急性肝损伤模型小鼠。对照组、CCl₄组、0.1 mg/kg LPS+CCl₄组、0.5 mg/kg LPS+CCl₄组。每组12只。诱导24 h后处死小鼠,采用酶速率法检测血清丙氨酸转氨酶（ALT）,重氮法检测总胆红素（TBil）水平;Western blot法检测肝组织HNF4α、胱天蛋白酶3剪切体（Cleaved caspase-3）蛋白表达;原位末端标记法检测肝细胞凋亡情况。结果 0.5、1.0、2.0 mL/kg CCl₄组的血清ALT、TBil及肝组织HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表达水平高于对照组,且呈剂量依赖性增高。2.5 mg/kg LPS组血清ALT、TBil及肝组织Cleaved caspase-3蛋白表达水平高于对照组和0.1、0.5 mg/kg LPS组,肝组织HNF4α蛋白表达水平低于对照组和0.1、0.5 mg/kg LPS组（P<0.05）。CCl₄组和0.1、0.5 mg/kg LPS+CCl₄组的血清ALT、TBil,肝组织HNF4α、Cleaved caspase-3蛋白表达水平及肝细胞凋亡指数均高于对照组（P<0.05）;0.1、0.5 mg/kg LPS+CCl₄组的血清ALT、TBil,肝组织Cleaved caspase-3蛋白表达水平及肝细胞凋亡指数高于CCl₄组,HNF4α蛋白表达水平低于CCl₄组（P<0.05）。结论 内毒素血症通过下调HNF4α表达增加肝细胞凋亡,可能是其介导肝损伤进展的机制之一。     

吡非尼酮通过miRNA-425-5p调控TGF-β/Smad通路对大鼠心肌纤维化的影响

目的 探讨吡非尼酮通过调控miRNA-425-5p及转化生长因子（TGF）-β/Smad通路改善心肌梗死大鼠心肌纤维化程度的作用。方法 将60只雄性SD大鼠分为3组：假手术组（不结扎冠状动脉）、模型组、吡非尼酮组（吡非尼酮0.3 g/kg灌胃）。造模4周后采用心脏多普勒超声评价各组大鼠心脏功能; 酶联免疫吸附试验检测血浆中白细胞介素6（IL-6）、Ⅰ型胶原蛋白α2（COL1α2）、Ⅲ型胶原蛋白α1（COL3α1）的水平;采用Masson染色法评价大鼠心肌纤维化程度,使用Image-Pro Plus 6.0分析各组心肌胶原容积分数;Western blot检测心肌组织中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达水平;实时荧光定量PCR（qPCR）检测心肌组织中TGF-β1和miRNA-425-5p表达水平。同时在体外分离、培养乳鼠心肌成纤维细胞,分为对照组（不加任何物质）、miRNA-425-5p mimic组（加入转染miRNA-425-5p mimic）、吡非尼酮组（加入1.5 g/L的吡非尼酮）。采用qPCR检测各组miRNA-425-5p和TGF-β1 mRNA表达水平。结果 模型组大鼠与假手术组相比心脏左心室舒张末期内径（LVEDd）、左心室收缩末期内径（LVESd）增大,左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（FS）降低（P<0.05）;Masson染色及定量分析结果显示心肌纤维化加重;炎性因子IL-6、COL3α1、COL1α2水平明显升高（P<0.05）;心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达升高,miRNA-425-5p表达水平降低（均P<0.05）。吡非尼酮组与模型组相比,LVEDd、LVESd缩小,LVEF、FS升高（P<0.05）,Masson染色及定量分析结果示心肌纤维化程度减轻,血浆炎性因子IL-6、COL3α1、COL1α2水平明显降低（P<0.05）;心肌组织TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达水平降低,miRNA-425-5p表达水平升高（均P<0.05）。体外细胞实验结果表明,miRNA-425-5p mimic组与对照组相比,miRNA-425-5p表达水平升高,TGF-β1 mRNA表达水平降低（P<0.05）。吡非尼酮组与对照组相比,miRNA-425-5p表达水平升高,TGF-β1 mRNA表达水平降低（P<0.05）。结论 吡非尼酮可通过调节miRNA-425-5p表达水平调控TGF-β/Smad信号通路,减轻心肌纤维化,改善心肌梗死后心力衰竭大鼠心脏功能。     

新药替莫唑胺酯抗原发性耐药胶质瘤机制研究

目的 以替莫唑胺(temozolomide,TMZ)为阳性对照,研究新药替莫唑胺酯(temozolomide hexyl ester,TMZ-HE)在体外抑制脑胶质瘤T98G细胞生长并诱导凋亡的作用及其机制。方法 MTT比色法和克隆形成实验比较TMZ和TMZ-HE对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测TMZ-HE和TMZ对细胞凋亡率及细胞周期的影响;Western blot检测TMZ和TMZ-HE对Bax、Bcl-2以及O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O⁶-methyl-oguanine-DNA-methyltransferase,MGMT)、γH2AX蛋白表达的影响。结果 TMZ-HE较TMZ明显抑制T98G细胞的生长,呈浓度及时间依赖性,长期作用时效果更加明显;TMZ-HE诱导T98G细胞凋亡率高于TMZ;TMZ-HE能够导致T98G细胞发生G2期阻滞;TMZ-HE能够增加Bax/Bcl-2的比值,诱导发生凋亡,TMZ-HE比TMZ更明显地消耗MGMT,产生更强的DNA损伤。结论 TMZ-HE对胶质瘤T98G细胞的增殖抑制及诱导凋亡的作用优于TMZ,消耗MGMT以及DNA损伤能力强于TMZ。     

Wnt10b、β-catenin与鼻咽癌放射敏感性的关系

目的 探讨Wnt/β-catenin信号通路与鼻咽癌细胞放射敏感性的关系.方法 收集对数生长期以及经直线加速器6MV X射线0、2、4、6 Gy照后48 h的鼻咽癌CNE2细胞和放射抗拒的CNE-2 (R743)细胞,RT-PCR方法检测Wnt10b基因、β-catenin基因mRNA的表达,Western blot检测Wnt10b、β-catenin蛋白的表达.结果 放射抗拒株CNE-2(R743)细胞的Wnt10b和β-catenin基因mRNA及蛋白的表达均高于放射敏感的CNE 2细胞(P＜0.05).经照射后CNE 2细胞和CNE-2 (R743)细胞的Wnt10b和β-catenin的mRNA及蛋白表达量随着照射剂量的增加而增加;在相同照射剂量下放射抗拒株CNE-2 (R743)细胞Wnt10b和β-catenin的表达量均高于CNE 2细胞(P＜0.05).结论 Wnt/β-catenin信号通路可能与鼻咽癌细胞放射敏感性有关.     

川续断皂苷Ⅵ对小鼠骨髓基质细胞ST-2 成脂分化的影响及其机制研究

目的观察川续断皂苷Ⅵ（Asperosaponin Ⅵ,ASAⅥ）对脂肪细胞分化的影响及Wnt 通路的调节。方法以小鼠骨髓基质细胞系ST-2 为研究对象,将其分为对照组、成脂分化组以及4 个不同剂量的ASAⅥ组。其中对照组加入溶媒,成脂分化组加入成脂诱导分化试剂,ASAⅥ组除加入成脂诱导分化试剂外,使用不同浓度（10-7、10-6、10-5、 10-4 mol/L）的ASAⅥ干预细胞。各组细胞处理5 d 后,行油红O 染色,观察脂滴形成情况并计算成脂率进行定量分析;荧光定量PCR（FQ-PCR）检测成脂相关基因PPARγ、FABP4 和Wnt/β-连环素（β-catenin）通路蛋白β-catenin 的 mRNA 表达水平;Wnt 通路抑制剂DKK1 干预诱导成脂分化的ST-2 细胞5 d,FQ-PCR 检测ASAⅥ所调节的 PPARγ、FABP4 和β-catenin mRNA 表达水平。结果与成脂分化组相比,10-5 mol/L 和10-4 mol/L ASAⅥ组中分化的脂肪细胞显著减少,10-5、10-4 mol/L ASAⅥ明显抑制PPARγ、FABP4 的mRNA 表达,但上调β-catenin mRNA 表达。 DKK1 能够逆转ASAⅥ对ST-2 细胞成脂分化的抑制作用,促进PPARγ、FABP4 的mRNA 表达,抑制β-catenin 的 mRNA 表达。结论ASAⅥ能显著抑制ST-2 细胞的成脂分化,这一作用可能是通过Wnt/β-catenin 通路的激活所介导的。     

胶质瘤U251细胞化疗过程中MGMT表达改变与耐药的关系

目的探讨胶质瘤U251细胞中MGMT表达与卡莫司汀（BCNU）和替莫唑胺（TMZ）化疗耐药的关系。方法细胞生长情况用MTT进行评估,细胞周期采用流式细胞仪检测,MGMT表达用western-blot检测。结果 U251细胞对BCNU和TMZ存在耐药现象。在化疗过程中,处于G0/G1期细胞比例明显增加,MGMT表达无显著变化。结论利用BCNU和TMZ对U251进行化疗过程中,不能通过消耗MGMT,来达到逆转耐药现象的目的 。     

Downregulation of Dickkopf-1 is responsible for high proliferation of breast cancer cells via losing control of Wnt/β-catenin signaling

Aim:

To investigate the role of DKK-1/Wnt/β-catenin signaling in high proliferation of LM-MCF-7 breast cancer cells, a sub-clone of MCF-7 cell line.

Methods:

Two cell lines (MCF-7 and LM-MCF-7) with different proliferation abilities were used. LM-MCF-7 cells were transiently transfected with the pcDNA3-DKK-1 plasmid encoding the DKK-1 gene (or MCF-7 cells were transfected siRNA targeting DKK-1 mRNA). Flow cytometry analysis and 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) incorporation assay were applied to detect the cell proliferation. The expression levels of β-catenin, phosphorylated β-catenin, c-Myc, cyclin D1 and Survivin were examined by Western blot analysis. The regulation of Survivin was investigated by Luciferase reporter gene assay.

Results:

Western blot and RT-PCR analysis showed that the expression level of DKK-1 was downregulated in LM-MCF-7 relative to MCF-7 cells. Flow cytometry and BrdU incorporation assay showed DKK-1 could suppress growth of breast cancer cells. Overexpression of DKK-1 was able to accelerate phosphorylation-dependent degradation of β-catenin and downregulate the expression of β-catenin, c-Myc, cyclin D1 and Survivin. Luciferase reporter gene assay demonstrated that Survivin could be regulated by β-catenin/TCF4 pathway.

Conclusion:

We conclude that the downregulation of DKK-1 is responsible for the high proliferation ability of LM-MCF-7 breast cancer cells via losing control of Wnt/β-catenin signaling pathway, in which c-Myc, cyclinD1 and Survivin serve as essential downstream effectors. Our finding provides a new insight into the mechanism of breast cancer cell proliferation.     

Diallyl disulfide inhibits proliferation,epithelial–mesenchymal transition,and invasion through RORα-mediated downregulation of Wnt1/β-catenin pathway in gastric cancer cells

Overactivation of Wnt/β-catenin pathway due to dysfunction of retinoid-related orphan receptor α (RORα) is related to cancer development and progression. Diallyl disulfide (DADS), an active component of garlic, has been reported in our previous study for upregulation of RORα expression in gastric cancer (GC) cells. It remains to be elucidated the role and mechanism of RORα in DADS against GC. This study revealed that DADS treatment resulted in reduced expression levels of Wnt1, β-catenin, TCF-4, intranuclear β-catenin and p-β-catenin in GC cells, concomitant with the compromised expression of β-catenin target genes (Axin, c-Jun, and c-Myc). RORα overexpression augmented DADS-induced downregulation of Wnt1/β-catenin pathway, G2/M phase arrest, and cell growth inhibition in vitro and in vivo. Contrarily, knockdown of RORα attenuated these effects of DADS. Interestingly, DADS induced an increase in the binding of RORα to β-catenin, which may lead to reduction of β-catenin phosphorylation and nuclear translocation. This interplay modulated by DADS may affect β-catenin target gene expression for that the opposite results were observed in DADS-treated RORα knockdown and overexpression cells. DADS caused a decrease in vimentin, snail and MMP-9, as well as an increase in E-cadherin and TIMP3 expression, which restricted epithelial–mesenchymal transition (EMT), migration, and invasion. The aforementioned effects of DADS were weakened simultaneously when the suppression of DADS on the Wnt1/β-catenin pathway was resisted by knockdown of RORα. In contrast, overexpression of RORα enhanced the effects of DADS. Therefore, RORα-mediated downregulation of Wnt1/β-catenin pathway could undertake an important role in anticancer activity of DADS against GC cell proliferation, EMT, migration, and invasion.     

抑制miR-33表达对急性呼吸窘迫综合征大鼠肺纤维化的影响及机制研究

目的 探讨抑制miR-33表达对急性呼吸窘迫综合征(ARDS)大鼠肺纤维化的影响及其机制。方法 将60只SD大鼠按随机数字表法分成假手术组(Sham组)、ARDS模型组(Model组)、antagomir阴性对照组(antagomir-NC组)和miR-33 antagomir组(antagomir组),每组15只。除Sham组外,其他各组大鼠均通过颈部气管滴注脂多糖(LPS)建立ARDS模型。造模成功后给予miR-33 antagomir或antagomir-NC尾静脉注射。测定动脉血氧分压[p(O₂)]及氧合指数(OI);HE和Masson染色观察肺组织病理学变化;碱性水解法检测肺组织中羟脯氨酸(Hyp)含量;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肺泡灌洗液中炎性因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平;实时荧光定量PCR检测肺组织中miR-33表达水平及转化生长因子β1(TGF-β1)、胶原蛋白(Collagen)Ⅰ和CollagenⅢmRNA表达水平;Western blot检测肺组织中TGF-β1、Smad2、p-Smad2、S...     

Quercetin sensitizes human glioblastoma cells to temozolomide in vitro via inhibition of Hsp27

Aim： Quercetin is an effective Hsp27 inhibitor and has been reported to facilitate tumor cell apoptosis. The aim of this study was to investigate whether quercetin could sensitize human glioblastoma cells to temozolomide （TMZ） in vitro.
Methods： Both U251 and U87 human glioblastoma cells were treated with quercetin and/or TMZ for 48 h. Cell viability was detected using the MTT assay. Cell apoptosis was analyzed with caspase-3 activity kits and flow cytometry. Hsp27 expression and phosphorylation were examined using Western blot analysis. RNA interference using Hsp27 siRNA oligos was performed to knock down the gene expression of Hsp27.
Results： TMZ （200 or 400 μmol/L） alone effectively inhibited the viability of U251 and U87 cells. When combined with quercetin （30 μmol/L）, TMZ （100 μmol/L） significantly inhibited the cell viability, and the inhibition of TMZ （200 and 400 μmol/L） was enhanced. TMZ or quercetin anole did not affect caspase-3 activity and cell apoptosis, while TMZ combined with quercetin significantly increased caspase-3 activity and induced cell apoptosis. TMZ anole significantly increased Hsp27 phosphorylation in U251 and U87 cells, while quercetin or Hsp27 siRNA oligos combined with TMZ attenuated TMZ-induced Hsp27 phosphorylation and significantly inhibited Hsp27 expression.
Conclusion： Combined treatment with TMZ and quercetin efficiently suppressed human glioblastoma cell survival in vitro.