自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对A2E诱导视网膜色素上皮细胞自噬的调节以及相关细胞因子表达的影响

目的 探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2 E)诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞自噬的调节以及相关细胞因子表达的影响.方法 取人RPE细胞(ARPE-19细胞系)进行培养.将细胞分为4组.对照组:仅使用正常DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;A2E组:将ARPE-...     

脂褐素成分A2E诱导人视网膜色素上皮细胞自噬及损伤的研究

目的 探讨N-亚视黄基-N-视黄基-乙醇胺(A2 E)能否诱导人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞)的自噬及损伤反应,并从自噬的角度探索其与年龄相关性黄斑变性(AMD)发病相关的分子机制.方法 CCK-8法筛选A2E作用于ARPE-19细胞的最佳浓度用于后续实验.采用多重细胞因子检测技术检测A2E作用于ARPE-1...     

雷帕霉素对高糖诱导人晶状体上皮细胞氧化应激的保护作用

目的　探讨雷帕霉素对高糖诱导的人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells,HLECs）氧化应激的影响。方法　建立高糖诱导的HLECs氧化损伤模型,用不同浓度(10 nmol·L^-1、100 nmol·L^-1)雷帕霉素干预,CCK-8比色法检测细胞存活率,倒置显微镜观察细胞形态并拍照,H_2DCFDA检测细胞内活性氧水平,Western Blotting检测各组凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax 的表达情况。结果　CCK-8检测结果显示,用10 nmol·L^-1、100 nmol·L^-1雷帕霉素处理后,HLECs存活率分别提高到62.86%±3.45%和77.47%±4.21%,与高糖组（42.32%±3.10%）比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）;H_2DCFDA荧光探针染色结果显示,雷帕霉素处理后HLECs内活性氧生成量下降,氧化损伤细胞减少;此外,雷帕霉素可以抑制高糖诱导的HLECs内凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表达,抑制效应与剂量正相关。结论　雷帕霉素可以抑制高糖诱导的HLECs氧化损伤及凋亡的发生,对糖尿病性白内障具有预防作用。     

自噬在高糖条件下视网膜色素上皮细胞表达血管内皮生长因子促进RF/6A细胞血管生成中的作用

目的　研究高糖条件下诱导的人视网膜色素上皮细胞株（ARPE-19）自噬对其表达血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），及恒河猴脉络膜视网膜血管内皮细胞（RF/6A）迁移和管腔形成的影响。方法　根据不同干预将ARPE-19细胞随机分为对照组、高糖组及3-甲基腺嘌呤（3-MA）+高糖组。对照组细胞在无糖DMEM培养基中常规培养24 h，高糖组细胞在DMEM培养基中加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理24 h，3-MA+高糖组细胞先用10 mmol·L^-1 3-MA处理24 h，然后更换培养基再加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理24 h。Western blot法检测细胞自噬标志性蛋白微管相关蛋白1 轻链 3（microtubule-related protein 1 light chain 3，LC3）II型和I型的比值(LC3-II/LC3-I)、Beclin-1及细胞中自噬相关基因3（autophagy-related gene 3，Atg3）的蛋白表达。ELISA法检测ARPE-19细胞上清液中VEGF的蛋白表达。比较三组ARPE-19细胞LC3-II/LC3-I、Beclin-1、Atg3及VEGF的蛋白表达量。然后将以上三组ARPE-19细胞上清液分别加入RF/6A细胞培养基中，将RF/6A细胞也按以上方法分组，分别采用Transwell法及Matrigel胶法检测并比较三组RF/6A细胞迁移数及细胞管腔形成数。结果　对照组、高糖组和3-MA+高糖组ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比值分别为0.405±0.095、0.932±0.024和0.635±0.048；Beclin-1蛋白相对表达量分别为0.205±0.035、0.590±0.120和0.425±0.082；Atg3蛋白相对表达量分别为0.277±0.035、0.539±0.071和0.389±0.019。ARPE-19细胞上清液中VEGF的蛋白表达量三组分别为（44.03±9.08）ng·L^-1、（205.70±17.90）ng·L^-1和（112.52±21.06）ng·L^-1；RF/6A细胞迁移数三组分别为（125.60±6.35）个、（153.60±19.20）个和（67.40±7.95）个；细胞管腔形成数三组分别为（12.22±0.84）个、（18.44±1.68）个和（5.44±0.51）个；整体比较差异均有统计学意义（均为P<0.01）。与对照组相比，高糖组ARPE-19细胞的LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1及Atg3蛋白相对表达量均明显增加（均为P<0.01），VEGF表达水平均明显升高（P<0.01），RF/6A细胞迁移数和管腔形成数均明显增加（均为P<0.01），3-MA+高糖组ARPE-19细胞中LC3-II/I比值、Beclin-1和Atg3蛋白相对表达量、VEGF表达量、RF/6A细胞迁移数和细胞管腔形成数均较高糖组明显降低（均为P<0.01）。结论　高糖激活ARPE-19细胞自噬，进而上调VEGF的表达并促进RF/6A细胞迁移和管腔形成，自噬抑制剂3-MA可抑制ARPE-19细胞自噬，并下调VEGF的表达从而抑制RF/6A细胞的血管形成能力。     

紫外线B照射在抑制人视网膜色素上皮细胞自噬中的作用

目的　探讨紫外线B(ultraviolet B,UVB)照射在抑制人视网膜色素上皮细胞株ARPE-19细胞自噬中的作用。方法　不同剂量UVB照射ARPE-19细胞后不同时间收集细胞,应用MTT法检测UVB照射对细胞存活的影响;Western blot检测细胞中自噬蛋白LC3的表达及LC3-II/LC3-I比率、Beclin-1蛋白表达水平;应用细胞自噬增强剂雷帕霉素（rapamycin,RAPA）和细胞自噬抑制剂氯化铵（NH₄Cl）进一步验证UVB照射对于细胞自噬的调节;采用环氧霉素（epoxomicin,EPO）检测泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)对于UVB作用的影响。MTT法检测细胞自噬变化对于细胞生存的影响。结果　UVB照射组诱导细胞剂量依赖性的死亡,100 mJ·cm^-2 UVB照射后24 h细胞出现明显死亡,和对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）;200 mJ·cm^-2 UVB照射后24 h和对照组相比差异有显著统计学意义(P<0.01);两种剂量的UVB照射后48 h细胞有一定程度的恢复。和对照组相比,UVB照射组ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比率和Beclin-1蛋白表达水平均降低（均为P<0.05)。和UVB照射组相比,UVB+RAPA组ARPE-19细胞中明显升高了LC3-II/LC3-I比率,UVB+NH₄Cl组进一步降低了LC3-II/LC3-I比率,RAPA和NH₄Cl在一定程度上恢复了UVB照射降低的Beclin-1蛋白表达水平（均为P<0.05)。和对照组相比,EPO组明显增加了ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比率、升高了Beclin-1蛋白表达水平（均为P<0.05)。与UVB照射组相比,UVB+EPO组ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比率无明显改变(P>0.05),而Beclin-1蛋白表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,RAPA组细胞死亡率增多,两组间差异有统计学意义（P<0.05）,NH₄Cl组细胞无明显死亡,与UVB照射组相比,UVB+RAPA组和UVB+NH₄Cl组细胞死亡率均无明显改变（均为P>0.05）。细胞自噬的改变不能逆转UVB诱导的ARPE-19细胞死亡。结论　UVB照射抑制了ARPE-19细胞自噬的启动及自噬流,UPS的改变不影响UVB对于自噬流的抑制。UVB照射可通过减少RPE细胞、损害细胞自噬能力增加RPE细胞变性,增加年龄相关性黄斑变性发生的风险。     

miR-140-5p靶向Nrf2对高糖诱导的视网膜色素上皮细胞氧化应激的调节作用

目的探讨miR-140-5p靶向核因子-类胡萝卜素2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)对高糖诱导的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞氧化应激的调节作用及对应的分子生物学机制。方法使用5 mmol·L^-1、10 mmol·L^-1、20 mmol·L^-1、30 mmol·L^-1、50mmol·L^-1的葡萄糖分别处理ARPE-19细胞。利用CCK-8法及RT-qPCR检测各葡萄糖浓度下ARPE-19细胞的活力及miR-140-5p、Nrf2 mRNA表达情况。将miR-140-5p inhibitor、miR-140-5p-NC、miR-140-5p-mimic、si-Con或si-Nrf2转染入ARPE-19细胞,根据转染物和葡萄糖浓度不同分组,使用DCFH-DA荧光探针检测各组细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,使用超...     

生存素(Survivin)抑制剂YM155对视网膜色素上皮细胞活力和迁徙能力的影响

目的　探讨生存素(Survivin)抑制剂YM155对视网膜色素上皮细胞活力和迁徙能力的影响。方法　将ARPE-19细胞分为对照组（不作任何处理）,10 nmol?L^-1、20 nmol?L^-1、50 nmol?L^-1 YM155组（用相应浓度YM155处理细胞24 h）,MTT检测各组细胞活力,Western blot检测各组细胞表皮生长因子受体（EGFR）、AKT、Survivin蛋白的表达情况;采用细胞迁徙实验和免疫荧光染色实验检测对照组与20 nmol?L^-1 YM155组细胞迁徙能力和EGFR表达情况。结果　MTT检测结果显示,与对照组相比,10 nmol?L^-1、20 nmol?L^-1和50 nmol?L^-1YM155组ARPE-19细胞的相对细胞活力平均降低约42.3%、55.6%、73.0%,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。使用20 nmol?L^-1YM155处理ARPE-19细胞24 h会降低细胞迁徙能力。YM155处理细胞24 h后,10 nmol?L^-1 YM155组细胞EGFR和AKT蛋白表达,与对照组相比无明显差异（均为P<0.05）,但Survivin蛋白表达下调（P<0.05）;20 nmol?L^-1YM155组细胞AKT蛋白表达,与对照组相比亦无明显差异（P>0.05）,EGFR和Survivin蛋白表达均下调（均为P<0.05）;50 nmol?L^-1组细胞EGFR、AKT和Survivin三种蛋白表达均下调,与对照组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。免疫荧光染色检测结果显示,对照组ARPE-19细胞EGFR均匀表达于细胞膜,20 nmol?L^-1YM155组表达于细胞膜的EGFR被内吞转移到细胞质内,在细胞核周围呈颗粒状分布;YM155可以诱导细胞骨架损害、F-肌动蛋白纤维排列紊乱,细胞核增大。结论　YM155能抑制ARPE-19细胞活力和迁徙能力,YM155对视网膜色素上皮细胞活力和迁徙能力的影响与Survivin、EGFR和AKT的蛋白表达下调有关。     

视网膜色素上皮细胞 LncRNA MEG3在不同葡萄糖浓度下的表达情况及对VEGF和 TGF-β1表达的影响

目的　探讨长链非编码RNA母系表达基因3（LncRNA MEG3）在不同浓度葡萄糖下表达情况及对血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响。 方法　按照不同浓度d-葡萄糖培养ARPE-19细胞,随机分为5 mmol·L^-1 d-葡萄糖组、15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组、30 mmol·L^-1d-葡萄糖组。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测各组ARPE-19细胞LncRNA MEG3、VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平。ARPE-19细胞转染PCDNA-MEG3及PCDNA-NC质粒,建立LncRNA MEG3过表达ARPE-19细胞及转染空质粒的ARPE-19细胞。以含30 mmol·L^-1d-葡萄糖的DMEM分别培养以下各组ARPE-19细胞:LncRNA MEG3过表达ARPE-19细胞(O组);转染空质粒的ARPE-19细胞（NC组）;加入PBS的正常ARPE-19细胞(G组);同时以含5 mmol·L^-1d-葡萄糖的DMEM培养正常ARPE-19细胞（C组）;以上各组细胞培养24 h后,采用RT-qPCR法及Western blot法检测各组ARPE-19细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白、TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白的相对表达水平。 结果　与5 mmol·L^-1 d-葡萄糖组比较,15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组和30 mmol·L^-1 d-葡萄糖组ARPE-19细胞LncRNA MEG3相对表达水平降低,VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组比较,30 mmol·L^-1 d-葡萄糖组ARPE-19细胞LncRNA MEG3相对表达水平降低,VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与G组和NC组比较,O组ARPE-19细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白、TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白相对表达水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论　高糖下调ARPE-19细胞LncRNA MEG3的表达,上调VEGF和 TGF-β1的表达。LncRNA MEG3过表达降低高糖诱导的VEGF和 TGF-β1表达的升高。LncRNA MEG3可能通过抑制VEGF和 TGF-β1的表达调节糖尿病视网膜病变的发展。     

藤黄酸通过CYLD/NF-κB信号通路抑制高糖环境下RPE细胞上皮-间充质转化的作用

目的 基于去泛素化酶圆柱瘤蛋白/核因子κB(CYLD/NF-κB)通路,研究藤黄酸(GA)对高糖环境下视网膜色素上皮(RPE)细胞上皮-间充质转化(EMT)的作用。方法 体外培养ARPE-19细胞,高糖诱导,实验分为NC组(含5.5 mmol·L^-1葡萄糖),HG组(含30 mmol·L^-1葡萄糖),HG+不同剂量GA组(2μmol·L^-1、4μmol·L^-1、8μmol·L^-1GA分别预处理RPE细胞1 h,加30 mmol·L^-1葡萄糖)。CCK-8检测各组RPE细胞增殖活力,免疫荧光染色检测RPE细胞中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、去泛素化酶圆柱瘤蛋白(CYLD)表达;Western blot检测RPE细胞中α-SMA、CYLD、磷酸化核转录因子κB(p-NF-κB)蛋白表达。结果 与NC组相比,HG组RPE细胞出现明显增殖,RPE细胞中α-SMA、p-NF-κB蛋白表达均增加,CYLD蛋白表达减少(均为P<0.01);与HG组相比,HG+不...     

杞黄颗粒对H2O2诱导的人视网膜色素上皮细胞炎症损伤的保护作用

目的　探讨杞黄颗粒（QHG）对H₂O₂诱导的人视网膜色素上皮（RPE）细胞系ARPE-19炎症损伤的保护作用。方法　常规培养ARPE-19细胞,随机分为对照组、H₂O₂损伤组(200 μmol?L^-1 H₂O₂处理细胞）、QHG低剂量组（1 g?L^-1 QHG作用24 h后再加入H₂O₂处理细胞）和QHG高剂量组（2 g?L^-1QHG作用24 h后再加入H₂O₂处理细胞）。使用相差显微镜观察各组ARPE-19细胞形态;流式细胞仪检测各组ARPE-19细胞凋亡率,Real-time PCR检测各组ARPE-19细胞β淀粉样蛋白（Aβ)mRNA表达,ELISA检测各组ARPE-19细胞Aβ以及攻膜复合物（MAC）的蛋白表达水平。结果　相差显微镜下可见,QHG低剂量组、QHG高剂量组ARPE-19细胞形态改变均较H₂O₂损伤组轻。对照组、H₂O₂损伤组、QHG低剂量组、QHG高剂量组ARPE-19细胞凋亡率分别为（6.85±0.14）%、（43.60±1.80）%、（23.23±1.43）%、（17.90±0.78）%,H₂O₂损伤组细胞凋亡率较对照组明显增加,QHG低剂量组及QHG高剂量组细胞凋亡率均较H₂O₂损伤组明显降低,且QHG高剂量组较QHG低剂量组降低更明显,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与对照组相比,H₂O₂损伤组ARPE-19细胞Aβ mRNA及Aβ、MAC蛋白表达水平均升高,差异均有统计学意义（均为P<0.01）。与H₂O₂损伤组相比,QHG低剂量组及QHG高剂量组均可明显降低ARPE-19细胞Aβ mRNA 相对表达量及Aβ、MAC蛋白的表达水平,差异均有统计学意义（均为P<0.01）。结论　QHG能有效抑制H₂O₂诱导的人RPE细胞凋亡,减少细胞Aβ及MAC表达,从而起到保护人RPE细胞的作用。     

纳豆激酶对高糖缺氧诱导的视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

目的 探讨纳豆激酶(NK)对高糖缺氧导致的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)损伤的保护作用。方法 不同浓度的葡萄糖和氯化钴(CoCl₂)诱导培养ARPE-19细胞24 h后,观察细胞形态变化,采用CCK-8法检测ARPE-19细胞活性。Western blot和RT-qPCR检测紧密连接蛋白-1(ZO-1)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、白细胞介素(IL)-1β、IL-18的表达情况,筛选最佳葡萄糖和CoCl₂浓度构建体外高糖缺氧的细胞模型。CCK-8法筛选合适的NK浓度,将ARPE-19细胞分为正常糖组(5.5 mmol·L^-1葡萄糖,NC组)、高糖+CoCl₂组(25.0 mmol·L^-1葡萄糖+200μmol·L^-1 CoCl₂,HG+CoCl₂组)和NK处理组(1.0μmol·L^-1 NK+25.0 mmol·L^-1葡...     

潜伏转化生长因子β结合蛋白2(LTBP2)对氧化型低密度脂蛋白诱导的人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的影响

目的 探索潜伏转化生长因子 β结合蛋白2(LTBP2)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人视网膜色素上皮(ARPE)细胞氧化损伤的影响.方法 0 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1和200 mg·L-1 ox-LDL处理ARPE-19细胞,CCK-8试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒检测细胞活力和凋...     

视网膜色素上皮细胞通过分泌含有miR-4488的外泌体抑制糖尿病视网膜病变进展的机制研究

目的　探讨视网膜色素上皮细胞通过分泌含有miR-4488的外泌体抑制糖尿病视网膜病变进展的分子机制。方法　将人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19细胞分为空白组、高糖组。将人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）分为NG组、HG组、NG+外泌体组和HG+外泌体组。空白组、NG组和NG+外泌体组细胞用含5.5 mmol·L^-1正常浓度葡萄糖的培养基培养24 h;高糖组、HG组和HG+外泌体组细胞用含30 mmol·L^-1高浓度葡萄糖的培养基培养24 h;NG+外泌体组和HG+外泌体组细胞在培养基中分别加入空白组或高糖组ARPE-19细胞分泌的外泌体40 μg·L^-1。PKH67绿色荧光标记外泌体;利用CCK-8法、Transwell小室法检测HRMECs增殖、迁移和血管生成。取空白组和高糖组ARPE-19细胞外泌体进行miRNA微阵列分析。采用双荧光素酶报告分析检测miR-4488和转化生长因子β受体Ⅱ（TGFβR2）基因序列的靶向关系。采用Western blot或免疫荧光染色检测各组HRMECs中TGFβR2、Smad2、p-Smad2ser467或Desmin、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达。结果　空白组和高糖组ARPE-19细胞分泌的被PKH67标记的外泌体加入培养基后都可被HRMECs吸收。与NG组相比,HG组HRMECs细胞增殖率、迁移率、血管结点数和血管总长度、TGFβR2和p-Smad2ser467蛋白表达量、Desmin和α-SMA蛋白荧光强度均增加（均为P<0.05）;与HG组相比,HG+外泌体组上述指标均被逆转（均为P<0.05）;NG+外泌体组与NG组上述指标相比差异均无统计学意义（均为P>0.05）。与空白组相比,高糖组ARPE-19细胞分泌的外泌体中miR-4488相对表达量增加,且miR-4488模拟物和TGFβR2wt共转染可增加双荧光素酶活性（均为P<0.05）。结论　在高糖条件下,ARPE-19细胞释放的外泌体可通过miR-4488/TGFβR2/Smad信号通路抑制HRMECs间充质转化。     

黄芪甲苷对蓝光诱导损伤的视网膜色素上皮细胞的保护作用及其机制

目的　探讨黄芪甲苷（AS-IV）对蓝光诱导损伤的视网膜色素上皮细胞的保护作用及其机制。方法　将传代后的ARPE-19细胞分为5组。空白组:在暗环境中培养细胞,不采用蓝光照射;光照组:采用辐射强度为(4.0±0.5) mW·cm^-2的蓝光照射细胞4 h;光照+AS-IV组:采用相同辐射强度的蓝光照射4 h +50 mg·L^-1 AS-IV培养细胞24 h;光照+AS-IV+siNC组:将细胞转染对照siRNA后,采用相同辐射强度蓝光照射4 h +50 mg·L^-1 AS-IV培养细胞24 h;光照+AS-IV+siPINK1组:将细胞转染siPINK1后,采用相同辐射强度蓝光照射4 h +50 mg·L^-1 AS-IV培养细胞24 h。采用CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,JC-1荧光探针检测细胞线粒体膜电位,DHE荧光探针法检测细胞内活性氧（ROS）含量,Western blot检测蛋白表达。结果　当连续蓝光照射4 h以上,ARPE-19细胞存活率均低于80%,故选择照射时间为4 h进行后续实验。光照+AS-IV组细胞存活率明显高于光照组［（93.85±1.79）%、（79.24±3.25）%,t=11.141、P<0.001］。光照+AS-IV组细胞凋亡率明显低于光照组［（11.03±1.65）%、（27.85±3.44）%,t=12.472、P<0.001］。光照组细胞线粒体膜电位高于空白组（绿/红色荧光强度比值分别为1.72±0.25、0.58±0.07,t=12.418、P<0.001）,但是光照+AS-IV组细胞线粒体膜电位（绿/红色荧光强度比值为0.81±0.10)则低于光照组（t=9.559、P<0.001）。光照+AS-IV组细胞ROS含量少于光照组（t=6.341、P<0.001）。蓝光照射4 h后,光照+AS-IV组ARPE-19细胞PINK1蛋白（1.18±0.14,t=9.035、P<0.001）和Parkin蛋白（0.77±0.09,t=8.106、P<0.001）相对表达量则明显高于光照组。与光照组相比,光照+AS-IV组ARPE-19细胞的细胞质细胞色素C（Cyt C）蛋白相对表达量降低至0.67±0.08（t=17.059、P<0.001）,线粒体Cyt C蛋白相对表达量升高至0.16±0.03（t=5.491、P<0.001）,总蛋白中LC3B-II/I蛋白表达比值升高至3.44±0.27（t=34.047、P<0.001）。与光照+AS-IV组相比,光照+AS-IV+siNC组ARPE-19细胞的细胞质和线粒体Cyt C蛋白相对表达量（0.70±0.09、0.15±0.03）、总蛋白中LC3B-II/I蛋白表达比值（3.26±0.33）差异均无统计学意义（均为P>0.05）,而光照+AS-IV+siPINK1组ARPE-19细胞的细胞质Cyt C蛋白相对表达量（1.20±0.15）较光照+AS-IV+siNC组升高（t=8.085、P<0.001）,线粒体Cyt C蛋白相对表达量降低至0.02±0.01（t=11.628、P<0.001）,总蛋白中LC3B-II/I蛋白表达比值则降低至0.85±0.13（t=19.224、P<0.001）。结论　AS-IV对蓝光诱导损伤的视网膜色素上皮细胞具有一定的保护作用,可抑制细胞产生大量ROS,缓解细胞线粒体损伤和细胞凋亡,维持细胞活力和自噬过程,其机制可能与AS-IV上调细胞PINK1/Parkin信号通路有关。     

高糖诱导的视网膜新生血管形成中NLRP3炎症小体与自噬的关系研究

目的　探讨在高糖诱导的视网膜新生血管形成过程中,核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3）炎症小体与自噬之间的关系。方法　根据不同干预方式将人视网膜微血管内皮细胞（human retinal microvascular endothelial cells,HRMEC）随机分为三组:高糖组、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）＋高糖组、CY-09+高糖组。高糖组在M199培养基中加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理48 h;3-MA+高糖组和CY-09+高糖组分别先用5 mmol·L^-1的3-MA和10 mmol·L^-1的CY-09处理2 h,然后更换培养基再加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理48 h。分别采用MTT、Transwell及Matrigel法检测细胞活力、细胞迁移和管腔形成情况,比较三组细胞活力、细胞迁移数和管腔形成数;采用Western blot法检测三组细胞NLRP3炎症小体信号通路的关键蛋白NLRP3、凋亡相关颗粒样蛋白（ASC）、Caspase-1及自噬标志性蛋白LC3-II、LC3-I、Beclin-1的表达并对比;采用Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒转染细胞观察自噬流的情况。结果　高糖组、3-MA+高糖组、CY-09+高糖组HRMEC细胞活力分别为（153.56±1.46）%、（115.33±3.26）%和（116.10±1.66）%,细胞迁移数分别为（117.33±7.23）个、（70.00±2.00）个和（71.67±2.52）个,细胞管腔形成数分别为（88.33±2.08）个、（61.33±1.53）个和（62.00±3.00）个。与高糖组相比,3-MA+高糖组及CY-09+高糖组HRMEC的细胞活力、细胞迁移数和管腔形成数均明显减少（均为P<0.001）,而3-MA+高糖组与CY-09+高糖组间差异均无统计学意义（均为P>0.05)。与高糖组相比,3-MA+高糖组及CY-09+高糖组细胞NLRP3、ASC、Caspase-1、Beclin-1的蛋白相对表达量和LC3-II/LC3-I比值均明显降低（均为P<0.05）,细胞内自噬流明显减弱。结论　抑制NLRP3炎症小体与自噬均可有效抑制高糖诱导的视网膜新生血管形成,且二者在其中可能发挥相互正向调控的作用。