犬脱钙骨基质颗粒骨水泥复合材料的生物力学性能

目的　研究不同质量比的犬脱钙骨基质颗粒骨水泥复合材料的生物力学性能 ,为临床应用该复合材料修复骨缺损提供理论依据 .方法　按 U rist等方法制备犬脱钙骨基质颗粒后 ,再与骨水泥混合制成含骨粒质量比为 0 ,40 0 ,5 0 0和6 0 0 m g·g- 1 的脱钙骨基质颗粒骨水泥复合材料 ,对其抗压极限强度、抗弯极限强度、抗扭转极限强度进行测定 .结果　含脱钙骨基质颗粒质量比为 0 ,40 0 ,5 0 0和 6 0 0 mg· g- 1的复合材料的抗压极限强度分别为 (81.0± 3.0 ) ,(5 0 .4± 5 .9) ,(4 8.8± 2 .0 )和 (33.8± 3.6 ) MPa;抗弯极限强度分别为 (6 5 .3± 6 .7) ,(4 2 .9± 8.1) ,(37.2± 2 .9)和 (2 5 .0± 2 .4) MPa;抗扭转极限强度分别为 (35 .5± 0 .8) ,(16 .3± 2 .2 ) ,(13.1± 2 .0 )和 (8.0± 1.4) MPa.结论　犬脱钙骨基质颗粒骨水泥复合材料具有良好的生物力学性能 ,易于塑形 ,能根据需要适应不同部位骨缺损的要求 ,其中含骨粒质量比为 5 0 0 mg· g- 1的复合材料生物力学性能及骨诱导活性最为适宜 ,能作为支架材料有效地修复大块骨缺损 .     

基因修饰的骨髓间充质干细胞复合脱细胞软骨基质促进疏松骨质修复的实验研究

目的探讨经基因修饰的骨髓间充质干细胞(MSC)与脱细胞软骨基质(ECM)混悬物对骨质疏松模型大鼠的疗效。方法以去卵巢法将30只3月龄SD大鼠制成骨质疏松模型。实验组18只,将SD大鼠MSC分离培养和siRNA(RNA干扰)修饰,与ECM制成混悬物后注入SD大鼠骨质疏松模型椎体骨质中;对照组12只注入生理盐水。观察2组动物不同时间的椎体骨质X线表现差异和力学性能改变。结果 4～12周时,随着周次的增加,实验组动物X线摄片见椎体骨质圆点状密度增高影扩大增加趋势,力学测试最大载荷、弹性模量和最大应变力均较对照组增强,差异有统计学意义(P<0.05)。结论利用经基因修饰的MSC与ECM混悬物注射对骨质疏松实验动物骨质改善效果良好,为探索骨质疏松症的治疗新途径提供一定依据。     

兔脱钙骨基质材料复合骨髓间充质干细胞的体外培养

目的:制备兔脱钙骨基质材料,研究脱钙骨基质作为软骨组织工程支架材料的可行性。方法:参照Ursit方法制得兔脱钙骨基质材料,扫描电镜观察脱钙骨基质的结构,将兔骨髓基质干细胞与兔脱钙骨基质体外复合培养,第2、4、6、8、10、12天时行MTT法测定及扫描电镜观察。结果:兔脱钙骨基质支架材料外观均呈乳白色,SEM观察脱钙骨基质呈天然的高密度孔隙网架结构,平均孔隙率为(65.86±5.15)%;平均孔径大小为(124.82±42.79)μm;兔脱钙骨基质材料接种于骨髓基质干细胞后可见大量骨髓基质干细胞粘附,随培养时间延长,骨髓基质干细胞增殖明显,MTT法检测显示复合培养8d骨髓基质干细胞增殖达稳定状态。结论:兔脱钙骨基质支架材料具有天然孔隙网架结构,利于细胞的粘附生长,具有良好的生物相容性,是一种较好的软骨组织工程支架材料。     

脉冲电磁场对脱钙骨基质诱导人骨髓干细胞成骨分化的影响

目的观察脉冲电磁场(pulsed electromagnetic fields,PEMF)对脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)诱导人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)成骨分化的影响,探讨可能的发生机制。方法提取1例健康14周岁男性骨髓间充质干细胞,培养至第3代,以1×104/孔接种至8块24孔板,以1×105/孔接种至2块6孔板,各分成4组:细胞对照组(C组)、细胞+材料组(CD组)、细胞+脉冲电磁场组(CP组)和细胞+材料+脉冲电磁场组(CDP组)。CD组和CDP组加入一块5mm×5mm×3mm大小的DBM,CP组和CDP组给予PEMF(频率15Hz,场强5Gs)照射;各组分别于种植后第1、7、14、21天进行碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素(OC)浓度等指标检测,在第21天进行钙结节茜素红染色,光镜观察。结果CD组、CP组和CDP组ALP活性及OC浓度在种植7d后均明显升高(P0.01);在14d时CD组和CDP组ALP活性达到最高值,第7、14天时CDP组ALP活性较CD组、CP组均显著升高(P0.01),仅在第14天时CD组ALP活性较CP组显著升高(P0.01);CDP组OC值在7、14、21d时均较CD组、CP组显著升高(P0.01),仅在第21天时CD组OC浓度较CP组显著升高(P0.01);21d时形态学观察显示钙结节数量CDP组明显多于CD组和CP组(P0.01),CD组明显多于CP组(P0.01)。结论PEMF与DBM联合对hMSCs的成骨诱导要强于PEMF或DBM的单独作用,且随着磁场应用时间的延长更加明显。另外PEMF对DBM诱导hMSCs成骨分化具有明显的协同效应,可能是通过PEMF增强hMSCs对BMPs等成骨活性因子的反应性来实现的。     

骨髓间充质干细胞复合脱钙骨基质修复兔膝关节全层软骨缺损的实验

目的:研究骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)复合脱钙骨基质(deminerized bone matrix, DBM)修复兔膝关节全层软骨缺损的疗效. 方法:MSCs取自4～6 mo龄2.5～3.5 kg的青紫兰兔,体外分离培养后种植于DBM支架上体外培养,再移植于兔膝关节全层软骨缺损模型处. 实验动物选用健康的青紫兰兔36只,随机分成A, B, C 3个处理组各12只,A处理组(MSCs/DBM)双侧股骨髁间窝软骨缺损处植入DBM吸附体外分离培养的自体MSCs复合物;B处理组(DBM)单纯植入DBM;C处理组(对照)不作任何植入. 分别于术后4, 8和12 wk各处死4只兔子,取材进行大体、组织学及免疫组化染色观察,根据关节软骨组织学计分标准进行评分,数据输入SPSS 10.0软件统计分析,比较各组的评分差异是否具有统计学意义. 结果:MSCs复合DBM所修复组织为透明软骨样修复;而单纯DBM移植组和对照组为纤维性修复. 对术后12 wk大体及组织学形态进行评分. 按完全随机设计进行方差分析和SNK-q检验,结果显示,SMCs/DBM组明显优于DBM植入组和对照组(P<0.05);DBM组优于对照组(P<0.05). 结论:运用软骨组织工程的原理,以DBM为支架材料的自体MSCs移植是一种修复软骨缺损的行之有效的方法.     

脂肪干细胞成骨分化的研究进展

随着骨组织工程研究取得较好的发展,涌现出各类种子细胞。脂肪干细胞,来自脂肪组织,具有诸多的优势,成为骨组织工程研究的热点种子细胞之一。本文综述了脂肪干细胞成骨分化的诱导方法、过程、验证方法、影响成骨分化的供体因素和实验因素,并对其未来研究方向进行了展望。     

年龄因素对大鼠脂肪干细胞成骨诱导分化能力的影响

目的 探讨年龄因素对脂肪干细胞成骨分化能力的影响.方法 通过密度梯度离心法分离不同年龄段ADSCs进行培养及传代,观察细胞生长情况,细胞培养至第3代进行诱导分化,各年龄组细胞均在成骨诱导分化后进行检测.观察其形态变化、细胞凋亡率、碱性磷酸酶活性及钙离子浓度测定.结果 体外培养的ADSCs呈梭形,诱导条件下,各年龄组细胞形态由梭形变为立方形、多角形;经检测,随年龄的增长细胞的凋亡率在不断增大,幼年组细胞碱性磷酸酶活性较老年组高,钙离子浓度随年龄增加而降低.结论 ADSCs成骨分化能力随着年龄的增加而降低.     

年龄因素对大鼠脂肪干细胞成骨诱导分化能力的影响

目的探讨年龄因素对脂肪干细胞成骨分化能力的影响。方法通过密度梯度离心法分离不同年龄段ADSCs进行培养及传代,观察细胞生长情况,细胞培养至第3代进行诱导分化,各年龄组细胞均在成骨诱导分化后进行检测。观察其形态变化、细胞凋亡率、碱性磷酸酶活性及钙离子浓度测定。结果体外培养的ADSCs呈梭形,诱导条件下,各年龄组细胞形态由梭形变为立方形、多角形;经检测,随年龄的增长细胞的凋亡率在不断增大,幼年组细胞碱性磷酸酶活性较老年组高,钙离子浓度随年龄增加而降低。结论ADSCs成骨分化能力随着年龄的增加而降低。     

脱细胞真皮联合骨髓间充质干细胞修复糖尿病大鼠皮肤全层缺损创面的研究

目的研究以骨髓间充质干细胞为种子细胞、脱细胞真皮为支架的组织工程皮肤对糖尿病大鼠皮肤全层缺损创面愈合的影响。方法 36只大鼠随机分为3组,A组：骨髓间充质干细胞＋脱细胞真皮实验组;B组：脱细胞真皮对照组;C组：空白对照组。观察创面愈合及5-BrdU阳性细胞表达角蛋白的表达情况。结果 A组第3、5、7及14 d创面愈合率分别为（19.10%±3.52%）、（29.80%±4.10%）、（56.71%±8.07%）与（88.12%±5.31%）,明显快于B、C两组（P〈0.05）。A组新生皮肤的细胞结合有序,排列紧密,真皮层较厚,有大量皮肤附属器及血管形成,明显多于B、C两组。免疫组化检测BrdU阳性细胞表达角蛋白。结论骨髓间充质干细胞联合ADM可有效促进糖尿病大鼠创面的愈合。     

人脂肪间充质干细胞与软骨细胞接触式共培养的实验研究

目的探讨接触式细胞共培养条件下,人软骨细胞对脂肪间充质干细胞的诱导分化效应。方法用4,6-联脒-2-苯基吲哚(PKH26)荧光标记脂肪间充质干细胞,与软骨细胞进行接触式细胞共培养,细胞比例为1:1,单独培养的脂肪间充质干细胞为对照组。共培养2周后,应用流式细胞仪分选荧光标记阳性的脂肪间充质干细胞,提取细胞总RNA,采用Real-Time PCR检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因的相对表达改变。结果成功分离提取脂肪间充质干细胞;Real-timePCR检测结果显示,共培养组脂肪间充质干细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因相对表达较对照组显著增加(P0.05),蛋白多糖上调307倍,Ⅱ型胶原上调584倍。结论与软骨细胞接触式共培养后,人脂肪间充质干细胞能够被诱导分化为软骨细胞。     

脂肪组织源性干细胞分步诱导分化为神经元样细胞

目的探讨脂肪组织源性干细胞(ADSCs)诱导分化为神经元样细胞的可行性。方法 ADSCs分离自雄性SD大鼠附睾脂肪垫,差速贴壁法纯化ADSCs,传至第3代培养细胞行流式细胞术行表型鉴定(CD106,CD11b,CD45,CD90,CD29,CD49d),并进行成脂诱导。取鉴定后的ADSCs用分步诱导法,即先用含10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20ng/ml表皮生长因子(EGF)、2%B27的DMEM/F12培养基I培养,诱导其向神经干细胞转分化,再用含10 ng/ml胶质细胞源性神经营养因子(GDNF),10 ng/ml脑源性神经营养因子(BDNF),1μmol/L维甲酸(RA)的培养基II诱导分化为神经元样细胞(NLCs),免疫细胞化学法鉴定细胞表面标记物巢蛋白(nestin),神经细胞特异性标志微管相关蛋白(MAP2),神经元核蛋白(NeuN)。结果分离纯化的ADSCs CD90、CD29表达强阳性;成脂诱导分化后细胞油红O染色阳性;ADSCs经培养基I培养7 d后聚集成球样细胞团悬浮于培养液中,表达nestin;继而用培养基II诱导分化4 h后细胞球逐渐贴壁,球周边少数细胞向外发出突起,形似神经元,MAP2、NeuN均呈阳性。结论特定条件下,ADSCs在体外可被逐步诱导分化为NLCs。     

大鼠关节软骨干细胞的分离培养及其特性的鉴定

目的分离培养大鼠关节软骨干细胞(ACSCs)并鉴定其特性。方法运用纤连蛋白黏附法从大鼠关节软骨细胞中分选出ACSCs,流式细胞技术分别鉴定干细胞阳性表面抗原(阳性标志物CD90与CD44)和阴性表面抗原(阴性标志物CD45、CD31与CD34)在ACSCs中的表达水平,单克隆形成实验鉴定ACSCs的单克隆形成能力,成骨、成脂及成软骨诱导鉴定ACSCs的多向分化潜能。结果纤连蛋白可以特异性地分选出ACSCs。ACSCs高表达CD90与CD44,几乎不表达CD45、CD31与CD34。经过7d培养,单个ACSC可以形成大于32个细胞的单克隆细胞团。ACSCs具备很强的成骨、成脂和成软骨分化能力。结论大鼠关节软骨内存在ACSCs,ACSCs具有比较典型的干细胞特征。     

自体富血小板血浆联合骨髓基质干细胞复合改建脱细胞真皮基质修复兔关节软骨的可行性研究

目的:研究自体富血小板血浆（PRP）联合骨髓基质干细胞（BMSCs）复合改建脱细胞真皮基质（ADM）修复兔关节软骨的修复效果及临床价值。方法:选择60只股骨髁关节损伤的青紫蓝兔作为研究对象,随机分为研究组、对照组和空白组,各20只。首先制备PRP,再分离BMSCs,并进行体外培养,接种于ADM支架上。研究组培养基添加10% PRP,其他条件同对照组,空白组兔不做任何处理。将BMSCs-ADM复合物植入兔关节缺损处,在1、2、3个月末对构建的软骨组织进行免疫力学、组织学、生物力学检测,比较PRP-BMSCs-ADM联合修复关节缺损的效果。结果:随着培养时间延长,BMSCs的细胞数目显著增多,呈现S形生长曲线,第3天后进入对数期,第9天后进入平台期;从第3天开始,细胞数目OD值研究组均明显高于对照组（P<0.01）;随着时间的延长,各组标本软骨样细胞数目增多,软骨陷窝逐渐成熟,软骨表面逐渐光滑,IRCS宏观评分和组织学评分均呈现增长趋势（P<0.01）,标本压力弹性模量有上升趋势（P<0.05）;同时期研究组标本评分与压力弹性模量均显著高于对照组和空白组（P<0.01）;3个月后,研究组软骨缺损修复状况明显优于对照组和空白组。结论:自体PRP联合BMSCs复合改建ADM修复兔关节软骨的修复效果良好,具有可行性。     

兔脂肪间充质干细胞诱导成膀胱移行上皮细胞的研究

目的 探讨体外诱导兔脂肪间充质干细胞(rabbit adipose tissue-derived stromal cells,rASCs)向膀胱移行上皮细胞分化的可行性.方法 实验分混合共培养组、条件培养液组和空白对照组.混合共培养组是将兔脂肪间充质干细胞rASCs(GFP标记)与兔膀胱移行上皮细胞按1∶1比例混合培养;条件培养液组是将兔膀胱移行上皮细胞上清液与rASCs一起培养;空白对照组是rASCs与普通培养基常规培养.2周后,用免疫荧光法检测诱导分化的脂肪间充质干细胞中膀胱移行上皮细胞特异性蛋白尿斑素Ib、尿斑素Ⅱ、尿斑素Ⅲ和上皮细胞角蛋白CK18的表达.结果 2周后,免疫荧光检测显示,在混合共培养组中,诱导分化的脂肪间充质干细胞表达膀胱移行上皮细胞特异性蛋白尿斑素Ib和上皮细胞角蛋白18、尿斑素Ⅱ、尿斑素Ⅲ没有检测到.而在条件培养液组和空白对照组,上述膀胱移行上皮细胞特异性标记都没有检测到.结论 rASCs与兔膀胱移行上皮细胞混合培养可以诱导rASCs向膀胱移行上皮细胞分化.     

缺氧预处理的脂肪间充质干细胞对小鼠硬皮病模型的治疗作用

目的 观察脂肪间充质干细胞（adipose tissue-derived stromal cells, ADSCs）及缺氧预处理的ADSCs（hypoxia-pretreated ADSCs, hpADSCs）对硬皮病小鼠皮损组织的治疗作用。方法 分离提取小鼠的脂肪间充质干细胞,体外培养至第3代后,部分细胞进行缺氧预处理。使用博来霉素（bleomycin, BLM）对小鼠进行造模,根据处理方式分为PBS处理的空白对照组、BLM模型组、ADSCs治疗组、hpADSCs治疗组。各组皮损样本石蜡切片分别进行H-E染色、Masson染色,检测真皮厚度、羟脯氨酸评估胶原水平,检测H2O2评估氧化应激水平,使用Western印迹法和免疫组化评估α-SMA及TGF-β的表达水平。结果 与空白对照组相比,BLM模型组真皮厚度和组织内H2O2水平明显增加（P<0.05）,α-SMA和TGF-β表达水平也有一定程度的上调。虽然ADSCs治疗能够一定程度上降低真皮厚度,但是差异无统计学意义（P>0.05）,而hpADSCs治疗能够显著降低小鼠真皮厚度（P<0.05）。ADSCs与hpADSCs治疗均能够明显降低组织内H2O2水平（P<0.05）。相比ADSCs治疗,hpADSCs治疗能够更好地降低真皮内TGF-β和α-SMA的表达水平。结论 ADSCs能够降低硬皮病小鼠的胶原沉积并下调氧化应激水平,hpADSCs有更好的治疗效果。     

人脂肪间充质干细胞体外诱导为肝脏样细胞的试验研究

目的 探讨人脂肪间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及向肝脏样细胞分化的方法.方法 采用胶原酶Ⅰ消化离心法获得人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs),原代培养并采用流式细胞仪检测干细胞相关表面抗原白细胞分化抗原13(Cluster differentiation13,CD13)、CD73、CD34、CD45和人类白细胞DR抗原(human leukocyte antigen DR,HLA-DR)的表达,采用诱导培养基将hADSCs向成脂及成骨方向诱导.采用两阶段细胞因子诱导法诱导hADSCs,并观察其形态变化;采用实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)法及细胞免疫组化法检测肝细胞相关基因甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)、细胞角蛋白18抗体(cytokeratin18,CK18)、细胞角蛋白19抗体(cytokeratin19,CK19)等在肝脏样细胞中的表达;采用糖元染色法(Periodic acid-Schiff stain,PAS)检测肝脏样细胞糖原合成情况.结果 用消化离心法获取的hADSCs大小均匀,呈梭形的成纤维细胞样,体外能长期培养存活,并保持不分化状态;流式细胞仪检测显示hADSCs高表达CD13、CD73,低表达CD34、CD45及HLA-DR;hADSCs体外可被诱导成脂肪细胞及成骨细胞.hADSCs经成肝诱导后,细胞形态由梭形变为多角形的肝脏样细胞,这些肝脏样细胞高表达血清白蛋白(serum albumin,ALB)、AFP、CY3P4等基因,并表达肝细胞相关性蛋白HepPa r-1、AFP、CK18、CK19.PAS染色显示肝脏样细胞胞质呈红色表现.结论 利用消化离心法在体外成功构建了人原代脂肪干细胞系,可长期存活,反复传代,经诱导后可转化为有功能的肝脏样细胞,为脂肪间充质干细胞作为生物人工肝及肝组织工程的种子细胞提供理论依据.