BLOC⁃3介导Rab32线粒体定位改变对肝癌细胞生长的作用研究

目的 观察溶酶体相关细胞器生物发生复合体⁃3 （biogenesis of lysosome⁃related organelles complex⁃3,BLOC⁃3）亚基Hps1和Hps4对肝癌细胞中Rab32线粒体定位的影响及在肝癌细胞生长中的作用。 方法 通过公共数据库GenDoma,String和InBio Discover分析Hps1和Hps4与Rab32的相互作用情况。体外培养人肝癌细胞系SNU⁃739和Hep⁃3B,利用脂质体转染方法分别转染Hps1和Hps4相关的siRNAs和质粒,采用免疫荧光和Western blot观察Hps1和Hps4对Rab32线粒体定位的影响,细胞划痕、克隆形成、EdU、MTS及Transwell侵袭实验检测Hps1和Hps4调控Rab32线粒体定位后肝癌细胞迁移、增殖和侵袭的变化情况。通过公共数据库UALCAN中的数据集CPTAC分析Rab32蛋白在肝癌和正常肝脏组织中的表达差异。 结果 数据库分析结果显示,Hps1和Hps4均可以与Rab32相互作用;与正常肝脏组织相比,Rab32蛋白在肝癌组织中的表达显著降低（P<0.001）。在肝癌细胞系SNU⁃739中干涉Hps1或Hps4或同时干涉Hps1和Hps4后,Rab32线粒体定位均减少（均P<0.01）,细胞线粒体Rab32蛋白表达均降低（均P<0.001）,细胞增殖、迁移和侵袭能力增强（均P<0.05）;在肝癌细胞系Hep⁃3B中过表达Hps1和Hps4后,Rab32线粒体定位增多（P<0.01）,细胞线粒体Rab32蛋白表达增加（P<0.001）,细胞增殖、迁移和侵袭能力均受抑制（均P<0.01）,而单独过表达Hps1或Hps4时无显著抑制作用（均P>0.05）。结论 BLOC⁃3亚基Hps1和Hps4均可与Rab32相互作用并增加Rab32线粒体定位,进而抑制肝癌细胞生长。     

GSTP1基因对人肝癌细胞系HepG2增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨过表达/沉默GSTP1基因对人肝癌细胞系HepG2增殖及侵袭能力的影响。 方法 采用腺病毒载体转染人肝癌细胞系HepG2,获得过表达/沉默GSTP1基因的HepG2细胞。实时荧光定量PCR（qPCR）法检测细胞中GSTP1 mRNA表达水平;CCK-8法和Transwell小室法分别检测细胞的细胞活力和侵袭能力;免疫印迹法（Western blot）检测细胞中Akt、mTOR、p-Akt和p-mTOR的蛋白表达。 结果 经腺病毒载体转染后,成功获得过表达/沉默GSTP1基因的HepG2细胞;过表达GSTP1 基因后,HepG2细胞的细胞活力和侵袭能力显著降低（P<0.05）,而沉默GSTP1基因后,HepG2细胞的细胞活力和侵袭能力则显著增高（P<0.05）;过表达GSTP1基因后,p-Akt和p-mTOR的蛋白表达水平显著降低（P<0.05）,而沉默GSTP1基因的结果则相反。 结论 过表达GSTP1基因可抑制HepG2细胞的增殖和侵袭能力,沉默GSTP1基因则促进HepG2细胞的增殖和侵袭能力,其作用机制可能与Akt/mTOR信号通路有关。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂提高腺病毒对K562细胞转染及杀伤效率的研究

 目的　研究通过观察组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase,HDAC）抑制剂曲古抑菌素A（trichostatin A,TSA）对人类白血病细胞系K562 CAR表达水平的影响,并探讨HDAC抑制剂在以腺病毒为载体的基因治疗中的应用价值。方法　在mRNA和蛋白水平检测TSA处理K562细胞前后CAR的表达情况,采用流式细胞术测定病毒的转染效率,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测腺病毒及其携带的基因的体外抗瘤效应。结果　TSA处理后,K562细胞CAR 的mRNA 和蛋白表达明显增高;流式细胞仪分析ADV-GFP转染K562 后GFP的表达发现：未处理组的转染率为（8.74±0.34）％,1、10 和100 nmol／L TSA处理细胞48 h后的转染率分别为（12.26±0.55）％、（20.83±1.22）％和（28.66±0.43）％。未处理组与处理组间及各处理组间转染效率的差异有统计学意义（P＜0.05）。MTT结果表明腺病毒M1介导的体外杀伤效应TSA处理组比未处理组增强（P＜0.05）,TSA各处理组间的体外杀伤效应随TSA浓度的提高而增强（P＜0.05）。结论　低浓度的TSA可以增强腺病毒对K562细胞的感染及杀伤效率,可以提高以腺病毒为载体的血液肿瘤基因治疗的疗效。     

miR⁃145⁃5p靶向调控LOX基因对肝癌细胞侵袭和迁移的影响

目的 探讨miR-145-5p靶向调控LOX对肝癌细胞侵袭和迁移的影响及其作用机制。方法 收集2017年9月至2019年9月广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科手术切除的73例肝癌患者肿瘤组织及其配对癌旁正常组织,以及肝癌细胞系SMMC-7721、SK-Hep1,采用RT-PCR法检测组织中miR-145-5p和LOX的表达。分别将miR-145-5p慢病毒载体、LOX过表达质粒及LOX慢病毒沉默载体转染至肝癌细胞SMMC-7721或SK-Hep1,同时用LOX过表达质粒和过表达miR-145-5p慢病毒载体共转染SMMC-7721细胞,各转染组均设置相应阴性对照组及空白对照组;然后采用Transwell实验检测肝癌细胞迁移和侵袭能力;Western blot法检测LOX蛋白的表达水平;通过TargetScan数据库预测miR-145-5p的靶点,并利用Cluster Profiler包进行GO和KEGG富集分析。结果 qRT-PCR检测结果显示,miR-145-5p在癌旁正常组织中的表达高于肝癌组织（4.196±2.288 vs 2.835±1.817,P<0.0001）;LOX在肝癌组织中的表达高于癌旁正常组织（12.17±1.369 vs 11.26±1.556,P<0.001）。Transwell检测结果显示,过表达LOX能促进肝癌细胞侵袭、迁移,敲低LOX则抑制肝癌细胞侵袭、迁移（均P<0.05）;过表达miR-145-5p能抑制肝癌细胞的侵袭、迁移能力,LOX过表达能逆转miR-145-5p对SMMC-7721细胞迁移和侵袭的抑制能力。TargetScan数据库预测显示,LOX是miR-145-5p的靶基因。Western blot检测结果显示,miR-145-5p能抑制LOX蛋白表达水平（P<0.001）。结论 miR-145-5p在肝癌组织中低表达,LOX则高表达,miR-145-5p可能通过负向调控LOX抑制肝癌细胞侵袭和迁移。     

水通道蛋白4与人星形胶质细胞瘤迁移的相关性

目的 探讨水通道蛋白4（aquaporin-4, AQP4）和星形胶质细胞瘤恶性程度和迁移能力的相关性。方法 收集临床组织标本,培养获得正常星形胶质细胞、低级别星形细胞瘤和高级别星形细胞瘤细胞,荧光定量PCR法检测细胞中AQP4基因相对表达量,免疫印迹法检测AQP4蛋白水平,Transwell法检测细胞迁移能力。结果 荧光定量PCR结果提示低级别组和高级别组内AQP4基因相对于对照组的扩增倍数分别为（1.65±0.052）和（2.04±0.196）,差异有统计学意义（P<0.05）;免疫迹检测结果提示AQP4/β-actin 灰度值比,对照组（0.103±0.012）,低级别组（0.185±0.100）,高级别组（0.248±0.028）,各组间差异有统计学意义（P<0.05）,AQP4蛋白表达水平随细胞恶性程度而增高（P<0.05）;Transwell法检测结果提示各组细胞脱色液吸光度值分别为对照组（0.408±0.010）,低级别组（0.590±0.033）,高级别组（0.986±0.026）,差异有统计学意义（P<0.05）,各组细胞迁移随AQP4表达的增高,细胞迁移能力也增强（P<0.05）。结论 星形胶质细胞瘤中水通道蛋白4的表达随恶性程度的增高而增高,随AQP4表达的上升,星形胶质细胞瘤的迁移能力也增强。     

Linc00704对结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的 探讨Linc00704（long non-coding RNA 00704）对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法 RT-qPCR检测配对结直肠癌及癌旁正常组织、结直肠癌细胞和正常永生化人结肠上皮细胞系FHC中Linc00704 mRNA的表达。反义寡核苷酸（antisenseoligonucleotide,ASO）转染结直肠癌细胞构建Linc00704低表达细胞模型,慢病毒感染结直肠癌细胞构建Linc00704过表达细胞模型,RT-qPCR检测转染效率;CCK-8实验检测细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力。结果 相比癌旁组织,Linc00704在结直肠癌组织中表达降低（t=4.103,P<0.001）。8种结直肠癌细胞系中有6种细胞系（RKO、HCT15、NCI-H716、SW480、SW1463、SW48）Linc00704的表达较FHC细胞低（F=44.750,P<0.001）。沉默 Linc00704表达可促进Caco-2、DLD-1细胞迁移和侵袭能力（均P<0.01）,但对增殖无明显影响（均P>0.05）。过表达Linc00704可抑制RKO、HCT15细胞迁移和侵袭能力（均P＜0.001）,但对增殖无明显影响（均P>0.05）。结论 Linc00704在结直肠癌组织中呈低表达,过表达Linc00704可抑制结直肠癌细胞迁移和侵袭能力。     

FEN1过表达对肝细胞癌细胞生物学行为及患者预后的作用

目的 探讨FEN1在肝细胞癌中的表达及其在肝细胞癌发生发展中的作用。方法 应用RTqPCR及免疫组织化学方法检测FEN1基因在52例肝细胞癌组织及相应癌旁组织中的表达。FEN1基因特异性siRNA转染肝癌细胞株HepG2并用Western blot检测转染效率。用MTT及流式细胞技术检测干扰FEN1后HepG2增殖及凋亡情况。Transwell实验检测HepG2迁移、侵袭能力改变。结果 RT-qPCR结果显示与癌旁正常组织相比较,FEN1高表达于肝细胞癌组织（P<0.01）。免疫组织化学与临床资料统计分析进一步证实FEN1的高表达与肿瘤分化程度（P=0.017）、肝内转移（P=0.046）、临床TNM分期（P=0.020）相关,而与患者性别、年龄、术前AFP值及肿瘤直径无相关性（P>0.05）。通过siRNA干扰肝癌细胞株HepG2中FEN1基因表达,MTT及流式细胞术检测表明干扰FEN1表达后肝癌细胞株HepG2增殖受到明显抑制（P<0.05）,凋亡率明显增加（P<0.05）。Transwell实验发现干扰FEN1后可明显抑制HepG2迁移、侵袭能力（P<0.05）。结论 FEN1在肝细胞癌组织中高表达,高FEN1表达提示肿瘤分化程度低,易转移及预后差,干扰FEN1后抑制肝癌细胞增殖,诱导其凋亡,并降低肝癌细胞体外迁移和侵袭能力。FEN1基因可成为肝细胞癌诊断及治疗的一个新生物靶点。     

肝癌组织中FMNL-2和MMP-2的表达及临床病理分析

目的 探讨肝癌及癌旁组织中FMNL-2和MMP-2的蛋白表达及与临床病理特征的关系。方法采用免疫组织化学MaxvisionTM法检测100例肝癌及癌旁组织中FMNL-2和MMP-2的蛋白表达情况,应用图文分析软件Image-Pro Plus6.0测定FMNL-2和MMP-2的蛋白累积吸光度值（IOD）,采用SPSS19.0软件统计分析。结果 肝癌及癌旁组织中FMNL-2蛋白IOD值分别为(90 748.36±46 276.91)和(39 075.46±24 763.12),MMP-2蛋白IOD值分别为（87 969.46±27 131.77）和（59 517.72±20 218.23）,两组差异均有统计学意义（P<0.05）;FMNL-2在伴与不伴肝硬化组中IOD值分别为（47 471.96±40 273.54）和（72 123.41±45 517.93）（P<0.05）;MMP-2在HBsAg阳性或阴性组中IOD值分别为（77 668.34±27 682.79）和（64 585.83±26 173.62）（P<0.05）,在有无转移组中IOD值分别为（63 854.73±21730.42）和（77 218.05±28 930.01）（P<0.05）,差异有统计学意义;并且肝癌及癌旁组织中FMNL-2和MMP-2蛋白表达呈正相关（r=0.240,P=0.016）。结论 在肝癌发生、发展过程中存在FMNL-2和MMP-2蛋白异常表达,联合监测两者蛋白表达可能会有助于肝癌的诊断。     

慢病毒介导的siRNA沉默Foxp1对肝癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响

目的 探讨Foxp1对肝癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法 体外合成干扰Foxp1功能的小核酸片段（siRNA Foxp1）,通过重组技术将其插入到慢病毒三质粒系统的转移质粒中,利用包装细胞（293T）将三质粒系统组装为完整的反转录慢病毒载体（lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA）,感染高表达Foxp1的肝癌细胞株。同时构建不含有Foxp1-siRNA序列的直接三质粒系统包装的空病毒载体对照组。荧光显微镜观察慢病毒载体介导siRNA感染细胞的效果。Western blot和Real-time QPCR（RTQPCR）分别检测肝癌细胞中Foxp1蛋白表达和mRNA水平。CCK-8实验、流式细胞仪、细胞划痕愈合实验和侵袭小室实验分别检测细胞增殖、凋亡和迁移的改变。结果 与对照组细胞比较,肝癌细胞感染lenti-pLL3.7-Foxp1-siRNA后,细胞中Foxp1蛋白和mRNA表达显著下降,增殖活性受到显著抑制,细胞凋亡明显增加,在二维空间和三维空间的迁移细胞显著减少（均P<0.01）。结论 Foxp1作为一种多功能转录因子,促进肝癌细胞的增殖和迁移,抑制其凋亡。     

沉默SND1重组慢病毒制备及其对乳腺癌细胞增殖和侵袭的影响

  目的   探讨沉默葡萄球菌核酸酶结构域包含蛋白1（Staphylococcal nuclease domain containing 1,SND1）表达对乳腺癌细胞系MCF-7增殖和侵袭迁移的影响。   方法   制备可介导SND1靶向沉默的重组慢病毒,感染MCF-7细胞建立沉默SND1的稳定亚细胞系;用qRT-PCR和Western blot检测SND1沉默效果;用噻唑蓝（MTS）染色法、细胞划痕和transwell实验,检测沉默SND1后MCF-7细胞增殖及侵袭迁移能力的变化。   结果   成功构建了表达靶向SND1shRNA及对照shRNA的重组慢病毒质粒,经包装获得重组慢病毒（LV-SH1、LV-SH2、LV-SH3和LV-NC）;用上述慢病毒感染MCF-7细胞,筛选出SND1沉默效果最佳的稳定亚细胞系MCF-SH3;增殖与侵袭迁移检测结果显示,MCF-SH3的增殖活性及侵袭迁移能力显著低于对照组细胞,差异有统计学意义（P < 0.01）。   结论   SND1可以促进乳腺癌细胞增殖及侵袭迁移,沉默SND1表达可抑制其增殖及侵袭迁移,提示SND1表达异常与乳腺癌密切相关,可能通过影响细胞增殖及侵袭迁移在乳腺癌的发生发展中起重要作用。      

沉默环状RNA hsa_circ_0000591表达对肝癌细胞增殖及迁移的影响

目的 探讨环状RNA hsa_circ_0000591在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织以及肝癌细胞系中的表达,及其对肝癌细胞增殖和迁移的影响.方法 收集2014—2018年广西医科大学附属肿瘤医院手术切除的84例HCC组织及其相应癌旁正常组织标本,采用qRT-PCR检测hsa_...     

lncRNA LOC730101对肝细胞癌增殖、迁移与侵袭的影响

目的 探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)LOC730101对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）生物学行为的影响。方法 利用R软件分析TCGA数据库LIHC数据集374例HCC组织和50例正常组织中LOC730101的表达差异。收集2018年广西医科大学附属肿瘤医院外科手术切除、经病理确诊的40例HCC患者的癌组织及其相应癌旁组织,培养肝癌细胞系Huh-7、HCCLM3、HepG2和人正常肝细胞系L02,采用qRT-PCR检测组织和细胞系中LOC730101的相对表达水平。在肝癌细胞系Huh-7、HCCLM3中采用慢病毒感染法构建过表达LOC730101(OE-LOC730101)和敲低LOC730101(sh-LOC730101)的稳转细胞株,同时设置相应空白对照（control组）及阴性对照组（sh-NC组、OE-NC组）,然后采用qRT-PCR验证感染效果,CCK-8实验检测各组细胞的增殖能力,划痕愈合实验和Transwell小室侵袭实验检测各组细胞的迁移、侵袭能力。结果 TCGA数据库分析结果显示,LOC...     

NRP-1过表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231、SK-BR-3生物学行为的影响

目的 通过上调乳腺癌细胞MDA-MB-231、SK-BR-3中NRP-1的表达,观察NRP-1对细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响。方法 构建pcDNA3.1-NRP-1表达载体,脂质体介导NRP-1 表达质粒转染MDA-MB-231、SK-BR-3细胞,用G418筛选出稳定转染的乳腺癌细胞株。利用RTqPCR、Western blot法分别检测NRP-1基因mRNA及其蛋白表达;CCK-8法、AnnexinⅤ-APC/7-AAD法、Transwell小室分别检测转染细胞增殖率、凋亡率及侵袭、迁移能力。结果 成功构建pcDNA3.1- NRP-1表达载体,转染MDA-MB-231、SK-BR-3细胞并筛选稳定表达系。与对照组相比,过表达组细胞的NRP-1 mRNA及蛋白表达水平明显升高（均P<0.05）;NRP-1过表达组的细胞较对照组增殖率增加、凋亡率降低、侵袭及迁移能力增强（均P<0.05)。结论 NRP-1在乳腺癌发展、浸润、转移中起着一定的作用,它可促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭,抑制其凋亡。     

PES1对肝细胞癌预后和肝癌BEL-7402细胞生长的影响

目的 探讨pescadillo核糖体生物发生因子1（pescadillo ribosomal biogenesis factor 1，PES1）在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）组织中的表达及其对肝癌BEL-7402细胞生长的影响。方法 采用免疫组化法检测HCC癌组织和癌旁正常组织中PES1的表达。肝癌BEL-7402细胞转染PES1小干扰片段后，采用Western blot检测PES1、CDK4、CDC25A蛋白表达，MTS法检测细胞生长情况，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡。结果 95例HCC癌组织中，PES1表达阳性率高于癌旁正常组织（90.5% vs 72.6%，χ²=10.122，P=0.001）；癌组织中PES1染色评分高于癌旁正常组织的［（6.30±3.56） 分 vs （2.10±1.64） 分，t=10.423，P<0.001］。PES1表达与HCC患者的肿瘤大小、门脉癌栓和TNM分期有关（均P<0.05）；PES1高表达患者总生存期较PES1低表达患者短（P<0.05）。转染PES1小干扰RNA组的细胞与对照组相比，细胞生长受抑制（P<0.01），G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少（均P<0.01），CDK4、CDC25A蛋白表达下调，但细胞凋亡未见明显变化。结论 HCC组织中PES1表达上调，且与患者预后相关。PES1可通过上调CDK4、CDC25A蛋白表达，加快细胞G1/S期的转换，促进肝癌细胞生长。     

ACCα在肝细胞癌中的表达及对细胞生长的影响

目的  探讨乙酰辅酶A羧化酶α（acetyl CoA carboxylase alpha，ACCα）在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma ，HCC）中的表达及其在HCC细胞生长中的调控作用。 方法 采用qRT-PCR及Western blot法检测30例HCC患者癌组织及其相应癌旁正常组织中ACCα mRNA与蛋白的表达。采用siRNA下调HCC SNU-368细胞中ACCα的表达后，采用MTS法检测细胞增殖能力，流式细胞仪检测细胞周期分布及细胞凋亡情况。结果 qRT-PCR及Western blot结果显示，HCC组织中ACCα mRNA与蛋白表达水平均显著高于癌旁正常组织（3.26±0.81 vs 1.88±0.64，P=0.021；3.41±0.71 vs 1.74±0.54，P=0.019）。下调ACCα表达后，HCC SNU-368细胞的增殖能力降低（P<0.01），细胞周期进程被抑制（P<0.05），细胞凋亡比例增多（P<0.01）。 结论 HCC细胞SNU-368中ACCα表达显著上调，可能通过诱导细胞周期进程并抑制细胞凋亡促进HCC细胞增殖，ACCα可作为HCC治疗的潜在靶点。     

Overexpression of histone deacetylase 6 contributes to accelerated migration and invasion activity of hepatocellular carcinoma cells

Histone deacetylase 6 (HDAC6) is a cytoplasmic enzyme that regulates many important biological processes, including cell migration, viral infection and autophagy. The aim of this study was to investigate the significance of HDAC6 in the invasion and metastasis activities of hepatocellular carcinoma (HCC). Three HCC cell lines and two primary cultures of hepatocytes were used for biological experiments. Immunohistochemistry for HDAC6 protein was also examined in 70 resected primary HCCs. Knockdown of the HDAC6 gene in the HCC cell lines was carried out by treatment with siRNA, and their migration and invasion activities were examined by the scratch assay and Matrigel invasion assay, respectively. HDAC6 expression was greater in all of the HCC cell lines compared to the primary cultures of hepatocytes. Knockdown of HDAC6 markedly downregulated the migration and invasion activities of all HCC cell lines (P<0.05). Overexpression of HDAC6 protein to a level higher than that in the corresponding normal hepatocytes was observed in 14 (20%) of the 70 primary HCCs, and was significantly correlated with high clinical stage, number of tumors, vascular invasion and intrahepatic metastasis (P<0.05). These results suggest that overexpression of the HDAC6 protein is involved in the migration and invasion activities of HCC cells, and may be a good biomarker for prediction of intrahepatic metastasis.