“壳-芯”结构电纺纤维膜对MC3T3-E1细胞体外早期成骨分化的影响

［摘要］　目的　研究载有骨形态发生蛋白(BMP-2)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)“壳芯结构”静电纺丝纤维膜(PP-B)对MC3T3-E1细胞体外早期成骨分化的影响。方法　通过同轴静电纺丝的方法制备PLGA/PCL-BMP-2纤维膜(PP-B),以不含BMP-2的PLGA/PCL电纺纤维膜(PP)为对照组。通过透射电子显微镜观察PP-B膜的“壳-芯”结构;用ELISA法检测BMP-2的体外释放行为;收集PP-B膜的浸出液培养细胞,用碱性磷酸酶(ALP)活性检测法检测其释放的BMP-2对MC3T3-E1细胞的影响;将MC3T3-E1细胞接种到纤维膜上,通过CCK-8法检测1d、3d、5d、7d的增殖情况;以碱性磷酸酶(ALP)活性为早期骨向分化指标,检测其7d的活性;用实时荧光定量逆转录PCR检测细胞接种7d时成骨指标Bmp2、Alp、Col1、Msx2、Runx2的表达。结果　透射电镜结果表明,同轴静电纺丝法制备的PP-B静电纺丝可形成连续均一的“壳-芯”结构;ELISA结果显示,PP-B膜可以实现BMP-2的持续释放;ALP活性检测结果证实本实验条件下制备的负载BMP-2的同轴静电纺丝支架能保持生长因子的部分活性。CCK-8结果显示PP-B膜和PP膜上的MC3T3-E1细胞在1、3、5、7d都持续增殖;ALP活性检测及染色结果显示PP-B膜上的MC3T3-E1细胞的ALP活性高于PP膜(P<0.05);实时荧光定量逆转录PCR结果显示接种在PP-B膜上的MC3T3-E1细胞的相关成骨基因Bmp2、Alp、Col1、Msx2、Runx2的表达高于PP膜(P<0.05)。结论　本实验制备的PP-B膜能促进MC3T3-E1细胞在体外的早期成骨分化。     

电纺聚己内酯/Ⅰ型胶原蛋白/纳米锆酸钙复合支架的制备及其生物相容性的研究

目的:制备聚己内酯(PCL)/Ⅰ型胶原(COLI)/纳米锆酸钙(nCZ)复合支架用于骨组织再生,评价其性能及对人牙周膜细胞(PDLCs)生物相容性及成骨分化的影响.方法:用静电纺丝法制备PCL/COLI、PCL/COLI/纳米羟基磷灰石(nHA)和PCL/COLI/nCZ复合支架,通过扫描电子显微镜表征支架形貌,能量色...     

静电纺聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜诱导骨髓间充质细胞成骨分化的研究

目的：观察静电纺聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜对骨髓间充质细胞（BMSCs）粘附、增殖和成骨分化的影响。方法：通过静电纺丝技术制备聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜,将第4代BMSCs接种于纤维膜,扫描电镜、碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色、MTT检测BMSCs粘附、分化及增殖能力。结果：在静电纺丝技术制备的聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜表面,BMSCs的黏附和增殖增强,呈现明显升高的ALP活性,并形成矿化结节,提示具有向成骨细胞方向分化的倾向。结论：静电纺聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜对BMSCs的细胞相容性较好,适合BMSCs的黏附生长,具有诱导其向成骨细胞分化的潜能,有望成为一种新型牙周组织工程支架材料。     

静电纺壳聚糖-聚己内酯纳米纤维膜引导骨再生的体外研究

目的 探讨静电纺壳聚糖（CHS）-聚己内酯(PCL)纳米纤维膜对骨缺损再生作用。方法通过静电纺丝技术制备壳聚糖-聚己内酯纳米纤维膜,以纤维膜作为载体,根据碱性磷酸酶活性和Western 免疫印迹实验结果,探讨纤维膜对细胞成骨分化能力的影响。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学处理。结果静电纺壳聚糖-聚己内酯纳米纤维膜对细胞成骨分化能力的作用显著高于对照组（不含材料组）（P<0.05）。结论静电纺聚己内酯-壳聚糖纳米纤维膜在体外能够促进细胞的成骨分化,为骨缺损及再生修复提供了科学依据。     

辛伐他汀/聚己内酯静电纺丝膜的制备及其生物相容性评价

目的：制备辛伐他汀（simvastatin）/聚己内酯（Polycaprolactone,PCL）静电纺丝膜,评价其生物相容性.方法：制备PCL静电纺丝膜和simvastatin/PCL静电纺丝膜,通过扫描电镜观察两种膜片的形貌特征.选择人牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament fibroblasts,PDLFs）与膜片浸提液共培养,检测细胞增殖情况,评价材料毒性;PDLFs接种于膜片共培养7d,扫描电镜观察细胞生长情况,以直接接触法检测膜片的细胞毒性.将PCL和simvastatin/PCL静电纺丝膜植入大鼠皮下,术后14d取出标本,HE和Masson染色法进行组织学观察.结果：成功制备出纤维直径为纳米级别的simvastatin/PCL静电纺丝膜.细胞增殖试验和直接接触试验结果显示,PCL和simvastatin/PCL静电纺丝膜的浸提液细胞毒性试验均合格,细胞在材料上伸展充分,连接成片.PCL和simvastatin/PCL静电纺丝膜植入皮下2周后均有包膜形成;与PCL静电纺丝膜相比,simvastatin/PCL静电纺丝膜与周围组织界限较明显,反应层炎症细胞较少.结论：simvastatin/PCL静电纺丝膜的生物相容性良好,细胞毒性和组织相容性均符合生物支架材料的要求.     

聚己内酯静电纺丝支架与人牙周膜干细胞的生物相容性

目的：观察荧光标记的人牙周膜干细胞在聚己内酯静电纺丝支架上的生长情况,评价聚己内酯静电纺丝支架与人牙周膜干细胞的生物相容性.方法：采用有限稀释法,体外分离培养人牙周膜干细胞.用荧光染料对牙周膜干细胞进行标记,检测细胞增殖情况,评价荧光标记对细胞生长特性的影响.制备聚己内酯静电纺丝支架,与牙周膜干细胞直接接触共培养7d,激光共聚焦显微镜观察细胞在支架材料上的黏附和增殖情况,扫描电镜观察细胞在支架材料上的生长状态.结果：成功分离培养人牙周膜干细胞;荧光染料标记后细胞发红色荧光,标记对细胞形态和生长特性无显著影响.激光共聚焦显微镜观察,可见牙周膜干细胞能够在聚己内酯静电纺丝支架上黏附增殖,局部细胞生长融合.扫描电镜观察,可见牙周膜干细胞在聚己内酯静电纺丝支架上黏附牢固,可进入支架内部复层生长.结论：荧光标记的牙周膜干细胞在聚己内酯静电纺丝支架上生长良好,聚己内酯静电纺丝支架与牙周膜干细胞具有良好的生物相容性,有望作为牙周组织工程的载体材料.     

海藻酸钠-去铁胺/壳聚糖微球对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的 ：探讨海藻酸钠（sodium alginate,SA）-去铁胺（deferoxamine,DFO）/壳聚糖（chitosan,CS）微球对大鼠骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）增殖及成骨分化的影响。方法：将化学接枝DFO的SA与CS多孔微球通过静电吸附作用制备SA-g-DFO/CS微球，检测其形貌、孔隙率、孔径及DFO体外释放情况。体外分离、培养大鼠BMSCs，与SA-g-DFO/CS微球共培养、成骨诱导分化，以MTT法检测细胞增殖状态，钙黄绿素（calcein acetoxymethyl ester,Calcein-AM）/碘化丙啶（propidium,PI）细胞双染观察细胞活性，检测微球促细胞分化过程中碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）、成血管及成骨相关基因的表达。采用SPSS 22.0软件包对数据进行统计学分析。结果：成功制备SA-g-DFO/CS多孔微球，可实现DFO缓释。与SA/CS微球相比，SA-g-DFO/CS多孔微球有利于细胞增殖、分化。ALP和成血管相关基因缺氧诱导因子1α(hyp...     

rhBMP2缓释微球对牙龈成纤维细胞的生物学作用

目的：观察甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐(dex-GMA)载重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP2)缓释微球(MPs)对体外培养的人牙龈成纤维细胞(GFCs)的生物学作用。方法：采用体外细胞培养技术,将rhBMP2缓释微球和GFCs一起培养,采用M1Tr法检测其对GFCs的增殖状况的影响;碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒检测细胞ALP活性以反映rhBME2缓释微球对其分化状况的影响,并与单纯rhBMP2的作用进行比较。结果：rhBMP2缓释微球具有良好的生物学活性,能显著促进的GFCs增殖及分化,并维持10d以上,其效应高于单纯施加rhBMP2的效应。结论：所制备的rhBMP2微球比单纯rhBMP2对GFCs有更为明显的生物学效应,可以达到对生长因子的有效缓释。     

骨形态发生蛋白2壳聚糖纳米缓释载体的制备及性能测定

目的 制备负载骨形态发生蛋白2（BMP-2）的壳聚糖纳米球,测定纳米球粒径、zeta电位、形态、体外降解和体外释放性能,探讨负载BMP-2的壳聚糖纳米球作为缓释载体的可行性。方法以壳聚糖（chitosan）和三聚磷酸钠(tripolyphosphate )为原料,采用离子交联法制备壳聚糖纳米球。应用纳米粒度分析仪及zeta电位测定仪检测微球粒径、分布及zeta电位,透视电镜下测定其表面形态。Elisa法测定包封率、载药率及体外释放率。采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。结果离子交联法制备的BMP-2壳聚糖纳米球成球形好,球形较规则,分散较均匀,无团聚,表面较光滑;平均粒径为150.85 nm,分散指数PI=0.37,Zeta电位为+35.42 mV,包封率为(68.24±3.83)%,载药率为(56.83±2.26)%。体外释药试验显示,BMP-2可从壳聚糖纳米微球中缓慢释放,释放行为符合双相动力学规律,释放过程可达30 d。结论以壳聚糖和三聚磷酸钠为原料,可成功制备具有良好缓释能力的BMP-2纳米球,为组织工程骨的进一步应用提供依据。     

可载药的磁性聚己内酯/明胶微球支架的制备及其体外成骨性能的研究

目的 制备出可载药的磁性颗粒支架,并研究其体外成骨性能.方法 使用复乳法制备聚己内酯(polycaprolactone,PCL)/明胶微球(PCL/gel microsphere,PGM)支架,通过相差显微镜、场发射电子显微镜(field emission scanning electron micro?scope,F...     

载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞构建组织工程骨的实验研究

目的：探讨载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells)构建组织工程骨的可行性,并筛选辛伐他汀的有效载药量。方法：采用溶剂浇铸—粒子沥滤技术结合相分离法,制备不同浓度(辛伐他汀质量分别为0.1、0.5、1 mg)的载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料,扫描电镜观察孔隙率,绘制药物释放曲线;茜素红染色、I型胶原染色观察成骨诱导液和辛伐他汀对骨髓基质干细胞向成骨分化的作用;将第3代BMSCs经dil染色后,接种于不同浓度的复合支架材料上,扫描电镜、激光共聚焦显微镜观察细胞在支架上的黏附情况,CCK-8和碱性磷酸酶(ALP)检测对其增殖和分化作用;采用SPSS 18.0软件包对数据进行统计学分析。结果：支架材料孔隙率达90%以上,孔径平均200~300 μm,载药组药物持续缓慢释放,未见药物突释现象;经辛伐他汀和成骨诱导组I型胶原表达阳性,茜素红染色可见明显钙结节;4组支架材料与细胞黏附性较好,0.5 mg组细胞生长状态最佳。CCK-8和ALP检测0.5 mg组能够明显促进细胞的增殖和分化。结论：辛伐他汀和成骨诱导液联合利用,能够更有效地促进BMSCs向成骨分化;载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料是理想的组织工程支架材料;载0.5 mg辛伐他汀PLGA/CPC支架材料能够有效促进BMSCs的增殖和分化。     

BMP受体在大鼠骨髓间充质细胞成骨中的作用

目的:研究骨形成蛋白受体(BMP-R)在大鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)成骨中的作用机制。方法:分离大鼠BMSCs,将原代细胞分为4组,分别应用普通培养基(CM)、成骨诱导培养基(OM)、骨形成蛋白-2(BMP-2)和OM+BMP-2诱导培养基培养。应用碱性磷酸酶(ALPase)活性和钙结节染色(Von Kossa法)检测成骨分化程度,RT-PCR检测骨形成蛋白受体(BMP-R)的表达情况。采用SPSS16.0软件包对数据进行单因素方差分析。结果:OM可诱导BMSCs成骨分化,表现出高碱性磷酸酶活性和基质矿化能力。BMP-2可提高OM诱导BMSCs成骨分化的能力;OM在早期即可诱导BMP-RⅠA和BMP-RⅡ的表达,而BMP-2诱导BMP-R较迟。结论:BMP-2可提高OM诱导BM-SCs分化成骨的能力,BMP-R在BMSCs分化成骨中起重要作用。     

载rhPTH(1-34)纳米缓释纤维促成骨作用的体外研究

目的:制备载甲状旁腺相关肽(rhPTH(1-34))的电纺丝缓释纤维,研究其缓释效果及对成骨细胞增殖、分化的影响。方法:制备含rhPTH(1-34)电纺丝缓释纤维(PLLA/rhPTH(1-34)),扫描电镜(SEM)观察其形貌。紫外分光光度法测定释放速率。噻唑蓝法(MTT)测定PLLA/rhPTH(1-34)对小鼠前成骨细胞(MC3T3-E1)的增值活性, 碱性磷酸酶(ALP)测定其分化。结果:含模型药物的电纺丝缓释纤维体外有效释放21 d,PLLA/rhPTH(1-34)缓释纤维促进细胞的增殖作用明显(P＜0.05),并能显著促进细胞的分化(P＜0.05)。结论:PLLA/rhPTH(1-34)缓释纤维可以有效缓释药物,并能促进MC3T3-E1DE 增殖、分化。     

神经营养素3促进人牙囊细胞成骨分化

目的 研究神经营养素3（NT-3）对人牙囊细胞（hDFCs）成骨分化的影响。方法 体外分离并培养hDFCs,免疫细胞化学染色法鉴定细胞来源,CCK-8法检测不同质量浓度NT-3对hDFCs增殖活性的影响,同时检测NT-3对hDFCs的碱性磷酸酶（ALP）活性,以及骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、骨钙素（OCN）mRNA相对表达量的影响,并用茜素红染色法检测矿化情况。结果 波形丝蛋白和角蛋白染色结果表明hDFCs为间充质细胞来源。NT-3对hDFCs增殖活性无明显影响;当NT-3质量浓度为25、50、100 ng·mL^-1时能明显增强ALP活性,提高BMP-2、OCN mRNA的相对表达量,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）,NT-3质量浓度为100 ng·mL^-1时BMP-2、OCN mRNA的相对表达量达到最高。当NT-3质量浓度为50、100 ng·mL^-1时矿化结节数量最多。结论 适宜质量浓度的NT-3能促进hDFCs的成骨分化。     

Addition of bone morphogenetic protein type 2 to ascorbate and β-glycerophosphate supplementation did not enhance osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells

Bone morphogenetic protein type 2 (BMP-2) is a potent local factor, which promotes bone formation and has been used as an osteogenic supplement for mesenchymal stem cells.

Objectives

This study evaluated the effect of a recombinant BMP-2 as well as the endogenous BMP-4 and BMP-7 in the osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) in medium supplemented with ascorbate and β-glycerophosphate.

Material and Methods

Human ASCs were treated with osteogenic medium in the presence (ASCs+OM+BMP-2) or absence (ASCs+OM) of BMP-2. The alkaline phosphatase (ALP) activity was determined and the extracellular matrix mineralization was evaluated by Von Kossa staining and calcium quantification. The expressions of BMP-4, BMP-7, Smad1, Smad4, and phosphorylated Smad1/5/8 were analyzed by western blotting. Relative mRNA expressions of Smad1, BMP receptor type II (BMPR-II), osteonectin, and osteocalcin were evaluated by qPCR. Results: ASCs+OM demonstrated the highest expression of BMP-4 and BMP-7 at days 21 and 7, respectively, the highest levels of BMPR-II mRNA expression at day 28, and the highest levels of Smad1 mRNA at days 14 and 28. ASCs+OM+BMP-2 demonstrated the highest levels of Smad1 mRNA expression at days 1, 7, and 21, the highest expression of Smad1 at day 7, the highest expression of Smad4 at day 14, the highest ALP activity at days 14 and 21, and expression of phosphorylated Smad1/5/8 at day 7. ASCs+OM and ASCs+OM+BMP2 showed similar ALP activity at days 7 and 28, similar osteonectin and osteocalcin mRNA expression at all time periods, and similar calcium depositions at all time periods.

Conclusions

We concluded that human ASCs expressed endogenous BMP-4 and BMP-7. Moreover, the supplementation of ASCs with BMP-2 did not increase the level of osteogenic markers in the initial (ALP activity), intermediate (osteonectin and osteocalcin), or final (calcium deposition) phases, suggesting that the exogenous addition of BMP-2 did not improve the in vitro osteogenesis process of human ASCs.     

rhBMP2纳米缓释系统的制备及其对骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响

目的：制备甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐（dex-GMA）载重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP2）凝胶纳米微球（NPs）缓释系统,检测其理化及生物学特性.方法：采用改良乳化溶液聚合法,制备rhBMP2纳米微球（rhBMP2-dex-NPs）;观察其形态、粒径与稳定性,检测其载药、释药特征;采用体外细胞培养技术,将rhBMP2-dex-NPs和兔骨髓间充质干细胞一起培养,MTT法检测其对细胞增殖状况的影响,碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒检测细胞ALP活性,以反应rhBMp2-dex-NPs对其分化状况的影响,并与单纯rhBMP2的作用进行比较;实验按照培养液中所含成分不同分为4组：培养液中加入单纯rhBMP2（A组）、加入rhBMP2-dex-NPs（B组）、加入空白NPs（C组）和对照组（D组）,其中A、B 2组均分别按照rhBMP2的不同量设置100μg/L、200μg/L、400μg/L 3个浓度组,采用SPSS 10.0对结果进行统计学分析.结果：rhBMP2-dex-NPs大小均匀,粒径分析表明,80%的纳米球粒径在20nm左右,包封率高达83%,80%的rhBMP2在前12d释放;其具有良好的生物学活性,能显著促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖和分化,效应高于单纯施加rhBMP2的效应（P＜0.01）.rhBMP2-dex-NPs与BMSCs共培养3d内,反应BMSCs增殖和分化的OD值与A组无显著差异（P＞0.05）,但显著高于C、D组（P＜0.01）;3d后,rhBMP2-dex-NPs对细胞增殖和分化的促进作用较单纯rhBMP2明显加快;5～7d后,A、B组差异具有显著性（P＜0.01）;12d左右,B组细胞仍然有较强的增殖与分化能力,与其他3组有非常显著差异（P＜0.001）,而此时A、C、D组间差异已无统计学意义（P＞0.05）.结论：所制备的rhBMP2-dex-NPs形态良好、包封率高,理化与生物学性能稳定,可以达到对生长因子的良好缓释,比单纯rhBMP2对BMSCs有更为明显的生物学效应,可以持续促进其增殖与分化达10d以上,在组织工程领域有着广阔的应用前景.     

骨形态发生蛋白-2、-4、-6、-7和-9差异性介导永生化成牙本质细胞成骨分化

目的 研究永生化成牙本质细胞（immortalized odontoblasts,iODs）的间充质干细胞表型和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）-2、-4、-6、-7和-9差异介导iODs成骨分化的作用。方法 使用SV40 T抗原永生化成牙本质细胞（odontoblasts）,建立iOD细胞株,并连续检测BMP的内源性表达。使用Ad-Easy技术合成表达BMP和GFP的重组腺病毒,使用MTT试剂盒检测iOD的增殖能力。通过免疫荧光检测iOD的间充质干细胞表面标志物。在体外,使用半定量RT-PCR、碱性磷酸酶活性、茜素红染色及油红O染色检测iOD的成骨和成脂分化能力。最后,使用micro-CT和组织学分析评估体内形成的异位矿化组织的体积和密度。采用SPSS 21.0软件包中的单因素方差分析和Scheffe的多重比较检验对结果进行分析。结果 SV40 T抗原有效地永生化OD。iOD细胞株保持良好的增殖活性,表达间充质干细胞表面标志物并具有多向分化能力。相比BMP-4、-6和-7,BMP-2和BMP-9具有更强的介导iOD的成骨分化作用。结论 ODs和成骨生长因子（如BMP-2和BMP-9）可用作骨组织生物工程的有效策略。     

BMP-2、bFGF和Dex联合应用对犬牙牙周膜细胞成骨分化能力的影响

目的:观察骨形成蛋白(BMP-2)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和地塞米松(Dex)联合应用对犬牙周膜细胞(PDLCs)成骨分化能力的影响。方法:将第4代犬PDLCs分为5组:bFGF+Dex、BMP-2+bFGF、BMP-2+Dex、BMP-2+bFGF+Dex、对照组。检测各组碱性磷酸酶(ALP)活性,并应用RT-PCR检测各组PDLCs成骨关键基因OPN、COL-1的表达。结果:第7、14 d,各组ALP表达均较空白组显著增强(P<0.05),其中200μg/L BMP-2+10μg/LbFGF+10-8mol/L Dex诱导组犬PDLCs的ALP活性显著高于其他各组(P<0.05)。RT-PCR显示,200μg/L BMP-2+10μg/L bFGF+10-8mol/L Dex诱导组OPN、COL-1基因表达最为显著。结论:3种诱导因子两两结合均能增强犬PDLCs成骨能力,但在最佳浓度下3种因子联合应用诱导能力最强(P<0.05)。