阳春砂基于转录组的萜类合酶基因挖掘及一个单萜合酶基因的克隆

【目的】深入挖掘阳春砂转录组中挥发性萜类合酶相关基因,为全面认识阳春砂挥发性萜类代谢途径和分子调控模式奠定基础。【方法】整理前期工作获得的阳春砂2个转录组的数据,筛选已注释的及利用本地blast方法再注释的萜类合成途径的unigene;并通过对部分候选unigene的表达量与挥发性萜类化合物含量的相关性分析及生物信息学分析,进一步筛选出相关基因;采用PCR及重组载体构建的方法克隆其中一个单萜合酶基因,并对其编码蛋白序列进行分析。【结果】筛选得到10个挥发性萜类合成上游途径相关unigene及11个下游萜类合酶基因;相关性分析证明候选基因与阳春砂主要挥发性萜类有较强相关性;并成功克隆得到Av TPS1基因,其序列包含1 803 bp的开放阅读框,编码600个氨基酸;其编码蛋白含有单萜合酶蛋白特有的DDXXD、RRX8W和NSE/DTE等保守基序,N端含有一段叶绿体转运肽;系统进化分析表明Av TPS1属于TPS-b亚家族。【结论】结合转录组、表达谱数据的深入挖掘和与挥发性萜类化合物数据的关联,有效筛选出了阳春砂多个值得后续研究的萜类合酶基因;其中对Av TPS1的克隆及生物信息学分析为后续功能鉴定提供了基础。     

植物萜类物质生物合成的相关转录因子及其应用前景

植物萜类化合物具有很高的经济价值和药用价值。近年来,开始利用转录因子来提高萜类次生代谢物的产量。转录因子在萜类次生代谢生物合成中起着重要的作用,通过与结构基因的结合,转录因子可激活次生代谢合成途径中多个基因协同表达,从而有效启动次生代谢途径;转录因子还可激活不同植物中相似萜类次生代谢合成基因的表达,将从特定植物中分离出来的转录因子基因在不同植物中进行遗传转化,可以有效提高转基因植物中萜类物质的量。因此,转录因子的应用是萜类次生代谢基因工程中的一个新方向,已显示出广泛的应用前景。介绍了萜类次生代谢途径相关的重要转录因子：AP2/ERF、WRKY、bZCT、bHLH及其在萜类生物合成遗传改良中的研究进展。     

基于SNaPShot-FCA的乙醛脱氢酶2基因型微量检测

  目的  建立单碱基末端延伸-荧光毛细分析法(SNaPShot-fluorescence capillary analysis, SNaPShot-FCA)快速检测乙醛脱氢酶2基因(ALDH2)rs671位点的基因型。  方法  收集人外周血细胞,提取基因组DNA;采用R6G-ddATP和cy5-ddGTP作为荧光底物,用SNaPShot法扩增ALDH2基因,生成3′末端带有不同荧光标记的DNA产物;琼脂糖凝胶电泳分离并回收产物,用FCA微量检测,根据荧光光谱鉴定ALDH2 rs671的基因型;样本检测均重复3次,并与DNA测序结果相比较。  结果  优选的R6G-ddATP和cy5-ddGTP浓度分别为1.4 μmol/L和8.0 μmol/L;在最适条件下运用SNaPShot-FCA对106例样本进行了ALDH2基因型检测,检测结果显示:野生型(GG)67例,杂合型(AG)38例,突变纯合型(AA)1例,与测序结果一致。  结论  成功建立了微量检测ALDH2基因型的SNaPShot-FCA,可用于ALDH2基因的快速筛查与鉴定。     

变异链球菌CRISPR-Cas9系统csn2基因突变株的转录组学分析

  目的  对变异链球菌CRISPR-Cas9系统csn2基因突变株的转录组基因表达差异进行分析。  方法  培养变异链球菌UA159、csn2基因的缺失菌株Δcsn2及回补菌株。提取总RNA,采用高通量测序技术,进行转录组测序,基于差异表达基因GO和KEGG数据库分析的基础上,对其参与的生物学过程进行挖掘,采用qRT-PCR的方法验证转录组测序结果。  结果  转录组结果显示与UA159相比,Δcsn2中基因表达量变化在1倍以上的基因有176个（P<0.05）,其中上调表达基因72个,下调表达基因104个,通过GO功能富集分析及KEGG代谢通路富集分析,发现上调和下调的差异表达基因（DEG）均参与的功能为氨基酸转运和代谢。除此之外,上调的DEG参与的生物过程主要与碳水化合物代谢、能量产生和转化、转录等有关;下调的DEG主要与脂质代谢、DNA的复制、重组和修复、信号转导机制、核苷酸转运和代谢等生物过程有关,还有部分DEG的功能尚不清楚。qRT-PCR验证发现,与UA159及Δcsn2/pDL278-csn2 菌株相比,与支链氨基酸形成相关的基因leuA、leuC和leuD在Δcsn2中的表达显著下调。  结论  通过转录组测序和qRT-PCR验证发现Δcsn2中与支链氨基酸合成与细胞膜通透性相关的基因表达量发生了明显变化。     

TBX21 基因多态性与汉族儿童哮喘易感性的相关性研究

  目的  探讨汉族儿童T-box转录因子21(TBX21) 基因多态性,并分析其与哮喘易感性的相关性。  方法  选取2019年1月—2021年1月河南省儿童医院收治的汉族哮喘患者190例,设为哮喘组,另选取同期本院健康体检的汉族儿童135名作为对照组。采集口腔黏膜标本,分析rs9910408、rs16947078、rs2240017基因位点单核苷酸多态性(SNP),比较2组3个基因位点基因型分布及等位基因频率,采用logistic回归分析研究TBX21 基因rs2240017位点多态性与哮喘易感性的关系。  结果  Hardy-Weinberg平衡检验结果显示,rs9910408、rs16947078、rs2240017基因型在2组儿童中的分布频率未发生偏移,研究对象代表性良好。哮喘组与对照组rs2240017基因型等级分布,差异有统计学意义(P < 0.05),且哮喘组C等位基因频率显著高于对照组(89.47% vs. 40.37%,P < 0.05),G等位基因频率显著低于对照组(10.53% vs. 59.63%,P < 0.05)。2组rs9910408、rs16947078基因型等级分布,差异无统计学意义(均P＞0.05)。经logistic回归分析,TBX21 基因rs2240017的G/G、C/G、C/C基因型及G等位基因频率降低、C等位基因频率升高可能是哮喘易感性的影响因素(P < 0.05)。  结论  TBX21 基因rs2240017位点多态性与哮喘易感性密切相关。      

基于脑代谢组学研究羚珠散联合对乙酰基氨基酚对发热幼龄大鼠的解热作用

  目的  探讨中成药羚珠散(Ling-Zhu-San, LZS)和西药对乙酰氨基酚(Acetaminophen, APAP)对幼龄大鼠的解热作用及其代谢影响。  方法  采用气相色谱-质谱联用平台、多变量统计技术和通路分析等方法,通过系统的代谢组学分析,确认治疗前后大鼠脑组织中代谢物水平变化;通过体温试验和酶联免疫吸附实验(ELISA)考察大鼠体温变化及白细胞介素-1β (Interleukin-1β,IL-1β)和前列腺素E₂ (Prostaglandin E₂, PGE₂)的含量。  结果  大鼠脑内与TCA循环、色氨酸代谢、谷氨酸代谢和花生酸代谢相关的16种显著改变的代谢物(P < 0.05, FC>1.5)被认为是潜在的发热生物标志物,而联合用药后这些代谢物的浓度均基本恢复至正常水平。羚珠散和对乙酰氨基酚联用较单药解热效果最佳。  结论  羚珠散和对乙酰氨基酚联合用药对幼龄大鼠的解热作用可能与其改善脑内代谢紊乱相关。      

亨廷顿蛋白相关蛋白1基因对小鼠成纤维细胞增殖的影响

  目的  研究亨廷顿蛋白相关蛋白1（Huntingtin-associated protein 1,Hap1）基因对成纤维细胞增殖的影响。  方法  体外分离培养获得Hap1基因敲除（Hap1-/-）的原代成纤维细胞,鉴定后采用EdU增殖实验、细胞周期（流式细胞术）检测验证Hap1成纤维细胞增殖的改变;将野生型和Hap1-/-成纤维细胞送转录组测序筛选增殖相关基因,实时荧光定量PCR（qPCR）验证相关基因表达水平的改变。对小鼠进行皮肤损伤造模检测Hap1敲减（Hap1+/-）小鼠皮肤损伤修复情况;PCNA免疫组化染色检测损伤修复过程中成纤维细胞的增殖水平。  结果  成功培养原代Hap1-/-成纤维细胞;与野生型成纤维细胞相比,Hap1-/-成纤维细胞EdU阳性比例减少,进入S期的细胞比例减少;原代成纤维细胞转录组测序筛选出Cdc25C、E2f7、E2f8和Ccl5四个差异表达的增殖相关基因,qPCR验证发现E2f7在Hap1敲除后表达增多。小鼠皮肤损伤结果显示,Hap1+/-小鼠伤口面积较相同时间点野生型小鼠伤口面积大且愈合速度减慢,成纤维细胞增殖阳性密度低于野生型小鼠。  结论  Hap1可能通过抑制细胞周期负性调节因子E2f7的表达对成纤维细胞增殖起正向调节作用,其缺失将抑制成纤维细胞进入S期,从而减少细胞增殖,影响伤口修复。     

血浆miR-1181在2型糖尿病患者表达水平变化和意义

  目的  miRNA可作为预测糖尿病发生和发展的生物标志物，探索miR-1181在2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM)患者的表达情况。  方法  运用Agilent miRNA芯片对T2DM患者（n = 5）和正常对照组（n = 5）血浆样本进行差异筛选，荧光定量PCR技术（quantitative Real Time PCR，qRT-PCR）验证出差异表达的miRNA；通过生物信息学方法预测其靶基因并绘制miRNA-靶基因-代谢通路关系网络图，扩大样本检测血浆中差异表达的miRNA:miR-1181和靶基因MAP2K2、MAPK12表达水平。  结果  miRNA芯片筛选和qRT-PCR验证出与T2DM相关的差异表达miRNA:miR-1181，生物信息学分析得出miR-1181靶基因有CCND1、PI3KR2、MAP2K2和MAPK12；T2DM患者血浆中 miR-1181的表达水平明显下降（P < 0.001），而靶基因MAPK12 mRNA的表达水平明显升高（P < 0.01）。  结论  2型糖尿病患者血浆miR-1181水平降低，可能与其抑制靶基因MAPK12对MAPK通路影响有关。     

岗松中二氢黄酮的分离、绝对构型的确定及细胞毒活性

  目的  研究岗松（Baeckeafrutescens）中黄酮类成分,并评价其细胞毒活性。  方法  利用正反相硅胶柱色谱、MCI柱色谱、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20及半制备型高效液相等分离技术进行分离,根据MS、NMR及ORD与ECD计算等方法鉴定结构及其绝对构型;MTT法测定了对4种人类肿瘤细胞株的细胞毒活性。  结果  从中分离得到5个二氢黄酮类化合物并确定其绝对构型,其结构分别鉴定为（2S）-5, 7-二羟基-6-甲基二氢黄酮（ 1 ）,（±）-5-羟基-7-甲氧基-6-甲基二氢黄酮 （ 2 ）,（2S）-乔松酮 （ 3 ）,（±）-5-羟基-7-甲氧基-8-甲基二氢黄酮 （ 4 ）和（±）-6-甲基-圣草酚 （ 5 ）。  结论  化合物 1 、 3 和 5 为首次从该植物中分离得到;通过手性拆分和ECD计算判定这5个二氢黄酮类化合物分别为光学纯单体 （ 1 和 3 ）、外消旋体 （ 4 ）和不对等对映体 （ 2 和 5 ）;化合物 3 对DU145细胞株具有显著的细胞毒活性,IC₅₀值为4.56 μM。     

2 376例地中海贫血基因筛查结果分析

  目的  了解于昆明医科大学第一附属医院就诊的地中海贫血（简称“地贫”）基因筛查者地贫基因阳性率和基因突变类型及分布特征。  方法  回顾性分析2017年4月1日至2018年12月31日于昆明医科大学第一附属医院就诊的地贫基因筛查者2376例，对地贫基因进行统计分析。  结果  （1）2 376例地贫基因筛查中检出地贫基因阳性样本817例，阳性率为34.39%；其中检出α地贫基因阳性样本392例，占总阳性样本的47.98%；β地贫基因阳性样本398例，占总阳性样本的48.71%；αβ复合型地贫基因阳性27例，占总阳性样本的3.30%；（2）392例α地贫基因阳性样本中以αα/--SEA、αα/-α3.7、αα/ααCS、αα/-α4.2和-α3.7/--SEA基因型为主，分别占α地贫的50.51%、32.91%、4.34%、3.57%和2.55%；398例β地贫基因阳性样本中以CD26、CD41-42、CD17、IVS II-654、nt28基因型为主，分别占β地贫的25.38%、23.37%、20.60%、20.60%和3.27%。  结论  云南地区地贫基因携带率仍较高，其中β地贫中CD26最多，与国内其它省市人群存在差异。     

青蒿素对脑缺血/再灌注损伤大鼠白细胞介素-8表达的影响

目的探讨青蒿素对脑缺血/再灌注损伤大鼠白细胞介素-8(IL-8)表达的影响。方法将50只Wistar大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、青蒿素低、中、高浓度组,每组10只。采用大脑中动脉闭塞法复制局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠模型。假手术组和模型组均用30 mL生理盐水灌胃,青蒿素低、中、高浓度组分别溶于生理盐水中共计30 mL,剂量为400、300、200 mg.kg-1,灌胃,每日1次,连续60 d。采用放射免疫法检测血清IL-8水平,反转录-聚合酶链反应和蛋白质免疫印迹法检测组织IL-8 mRNA和蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组及青蒿素各浓度组血清IL-8水平和组织IL-8 mRNA、蛋白表达均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,青蒿素各浓度组血清IL-8水平和组织IL-8 mRNA及蛋白表达均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),且以青蒿素高浓度组下降更为明显(P<0.05)。结论青蒿素可降低脑缺血/再灌注损伤大鼠IL-8的表达,可有效控制炎症反应进程。     

毛冬青三萜皂苷对动脉粥样硬化大鼠粪便和尿液代谢组学的影响

目的 探讨毛冬青三萜皂苷(IPTS)对动脉粥样硬化(AS)模型大鼠粪便和尿液代谢组学的影响.方法 采用高脂饮食联合腹腔注射维生素D3诱导大鼠AS模型,实验分为对照组、模型组、IPTS组.检测大鼠血清中血脂四项水平,应用核磁共振(NMR)技术对粪样和尿样进行代谢组学分析.结果 IPTS干预后,大鼠血清TG含量显著下降(P...     

冠心病急性心肌梗死患者外周血差异基因表达分析及功能

  目的  探讨冠心病急性心肌梗死患者外周循环血单核细胞中差异基因表达及功能。  方法  收集2020年9月至2021 年9月在昆明市第一人民医院接受冠脉造影的患者，提取外周血单核细胞总RNA，使用DNBSEQ平台进行第2代高通量测序。检测并筛选差异表达基因，进行KEGG及GO富集分析。  结果  冠心病急性心肌梗死组与冠脉正常组对比，其中差异基因89个，上调基因67个，下调基因22个；其中差异lncRNA14个，差异mRNA72个，差异circRNA3个。完成KEGG pathway富集分析、KEGG disease富集分析、KEGG molecular富集分析。完成GO cell composition富集分析、GO cell function富集分析、GO biological process molecular富集分析。  结论  筛选出显著差异的10个mRNA、6个lncRNA、2个circRNA。富集分析中涉及感染、转录失调、PI3K-Akt信号通路、脂类合成、吞噬泡腔、细胞外基质、脂多糖结合等，与冠状动脉粥样硬化的发生与发展及急性血栓事件的发生可能相关。     

2型糖尿病患者血清与粪便的代谢组学研究

  目的  研究2型糖尿患者与健康者血清和粪便的代谢组学差异，分析差异代谢物与2型糖尿病之间的相关性。  方法  选择2018年1月至2019年3月在昆明医科大学第二附属医院内分泌科住院的2型糖尿病患者53例，以及同期常规体检健康对照人群30例，采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱技术对两组研究对象的血清代谢物及30例糖尿病患者与对照组的粪便代谢物进行非靶向和靶向的代谢组学研究。应用Spearman相关性分析方法对血清和粪便中的差异代谢物与2型糖尿病相关指标的相关性进行分析。  结果  在2型糖尿病组与健康对照组血清样本中鉴定出15个差异代谢物，在粪便样本中鉴定出的差异代谢物则有6个。其中，糖尿患者血清中的谷氨酰胺、壬二酸、癸二酸及3-羟基癸二酸等二羧酸类羟基化衍生物明显低于健康对照组，差异有统计学意义（P < 0.01），而琥珀酰乙酰乙酸、缬氨酸、亮氨酸、葡萄糖、乳酸的含量则高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.01），并且琥珀酰乙酰乙酸、乳酸与糖化血红蛋白、餐后2 h血糖及空腹血糖浓度具有较强的正相关性，而壬二酸、癸二酸及二羧酸类羟基化衍生物与血糖浓度则具有较强的负相关；在粪便代谢物中，去氧胆酸和鹅去氧胆酸等胆汁酸与受检者的血糖浓度也有着一定的正相关性，并且单变量分析结果显示，与健康对照组相比糖尿病患者血清中的去氧胆酸和鹅去氧胆酸均显著性升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。  结论  2型糖尿患者的血清代谢组学与健康者具有明显的差异，这些差异代谢物与糖尿病的发生和发展具有较强的关联性。在粪便代谢组学中，糖尿患者的胆汁酸水平与血糖的浓度变化也密切相关。     

云南省异烟肼耐药结核分枝杆菌katG和inhA基因突变特征

  目的  分析云南省异烟肼耐药结核分枝杆菌katG和inhA基因突变特征。  方法  采用PCR方法对云南省异烟肼耐药结核分枝杆菌进行katG和inhA基因扩增,并将扩增产物进行基因测序后比对分析。  结果  88株异烟肼耐药菌株中,耐药基因与表型药敏结果的符合率为82.95%（73/88）,katG和inhA基因突变率分别为75.00%（66/88）和9.09%（8/88）。最为常见的基因突变位点为katG315（67.05%）和inhA-15（7.95%）,katG315位点基因突变主要表现为Ser315Thr（59.09%,52/88）。耐多药与单耐异烟肼菌株中katG基因突变比例,差异有统计学意义（χ2 = 4.190,P = 0.041）,而inhA基因及katG315、inhA-15位点基因突变比例,差异无统计学意义（P > 0.05）。  结论  云南省异烟肼耐药以katG315和inhA-15基因突变为主,MDR菌株中katG基因突变率高于异烟肼单耐,目前基于基因突变的分子检测技术是检测异烟肼耐药的有效手段。     

青蒿气相色谱指纹特征研究

目的：建立青蒿的指纹图谱。方法：对13批青蒿的石油醚提取液进行气相色谱分析。结果：获得青蒿的气相色谱的指纹特征。结论：气相色谱的指纹特征可作为青蒿挥发性成分的质量检测标准。     

m6A结合蛋白YTHDC2对人骨髓间充质干细胞分化的影响

目的 研究N6-腺苷酸甲基化(N6-methyladenosine,m6A)结合蛋白YTH结构域蛋白2(YTH domain-containing protein 2,YTHDC2)对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)成骨及成脂分化的调控...     

顶空固相微萃取-气质联用分析喙尾琵甲挥发性成分

  目的  对喙尾琵甲干燥虫体的挥发性化学成分进行分析。  方法  采用顶空固相微萃取方法，结合气质联用技术对其中挥发性成分进行分析和鉴定，通过峰面积归一化法测定各成分的相对含量。  结果  经质谱扫描结合标准谱库检索对比，共鉴定出其中40个成分，占总峰面积的92.80%。其中烃类16种，占总含量的35.73%，以直链和支链烷烃为主；脂肪酸类8种，占总含量的35.87%，以短链脂肪酸为主；此外，还含有胺类、醇类、酯类、醛类、酚类、酮类、醚类等成分。含量在5%以上的组分有十三烷（21.47%）、3-甲基丁酸（16.88%）、2-甲基丁酸（7.67%）、三甲胺（6.59%）和乙酸（5.47%）。  结论  喙尾琵甲干燥虫体中的挥发性成分以烃类和短链脂肪酸类化合物为主，这些成分具有多种生理活性，为药用昆虫资源的进一步开发利用提供参考。