弓形虫蛋白激酶C受体1蛋白的表达与抗原性分析

目的构建弓形虫蛋白激酶C受体1基因的pET-30a（＋）-RACK1重组质粒,表达、纯化RACK1蛋白。方法PCR扩增RACK1基因的cDNA序列,用SacI、NcoI限制性内切酶对RACK1基因的PCR产物及pET-30a（＋）质粒进行双酶切,连接,转化大肠杆菌BL21,构建重组质粒。IPTG诱导表达,亲和层析柱纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行分析鉴定。结果PCR扩增出 966 bp的RACK1完整基因序列,成功构建RACK1基因的pET-30a（＋）-RACK1重组质粒,表达出约36kDa的RACK1蛋白,蛋白具有抗原性。结论成功构建弓形虫RACK1基因的pET-30a（＋）-RACK1重组质粒,纯化出RACK1蛋白,为进一步进行RACK1蛋白在弓形虫入侵分子机制中的作用研究奠定基础。     

柔嫩艾美尔球虫病毒RDRP部分序列的克隆及原核表达

目的构建柔嫩艾美尔球虫病毒RNA依赖RNA聚合酶（RDRP）蛋白部分区段的原核表达重组质粒,并在大肠埃希菌中表达目的蛋白。方法根据柔嫩艾美尔球虫病毒RDRP基因序列设计引物,以病毒基因组dsRNA为模板,RT-PCR扩增目的片段;扩增产物与pMD-18T克隆载体相连接,经测序鉴定序列正确后,将该质粒酶切,酶切目的片段与原核表达载体pET-28a连接构建原核表达质粒,转化入Transetta（DE3）中,经IPTG诱导表达重组蛋白,用SDSPAGE和Western blot分析目的蛋白表达。结果成功克隆柔嫩艾美尔球虫病毒RDRP基因部分序列,其长度为1 330bp,DNA测序表明重组原核表达质粒构建成功,推导的编码氨基酸序列与GenBank中布氏艾美尔球虫病毒RDRP氨基酸序列同源区段同源性为36%。经SDS-PAGE和Western blot分析,柔嫩艾美尔球虫病毒部分RDRP蛋白得到表达,表达蛋白的分子质量单位为52ku,与理论值相符,且该重组蛋白可被His标签单克隆抗体识别。结论构建的重组原核表达载体pET-28a-RDRP在大肠埃希菌中高效表达柔嫩艾美尔球虫病毒RDRP蛋白部分区段,为进一步研究该病毒奠定了基础。     

肠道病毒71型VP1包涵体蛋白的复性与纯化

目的 利用原核表达系统,经优化诱导条件及变、复性将包涵体形式肠道病毒71型结构蛋白VP1进行纯化。方法 通过RT-PCR扩增VP1基因,并应用基因克隆技术将VP1基因与pET-28a原核表达载体连接,之后将重组载体转化至大肠埃希菌Rosseta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后对包涵体进行变、复性,采用His镍柱亲和层析对VP1蛋白进行纯化,利用SDS-PAGE和Western blot对VP1蛋白进行分析鉴定。结果 PCR扩增出891 bp的EV71-VP1基因,双酶切鉴定原核重组质粒pET-28a-EV71-VP1构建正确。重组载体转化DE3后经IPTG诱导表达VP1蛋白,且以包涵体形式存在。将包涵体变、复性,经SDS-PAGE分离后进行镍柱纯化,得到较纯的目的蛋白,Western blot分析该蛋白能被相应抗体识别。结论 构建的原核重组质粒pET-28a-EV71-VP1转化DE3后经IPTG诱导表达以包涵体形式存在的VP1蛋白,复性后纯化的VP1蛋白具有免疫原性,为EV71 VP1蛋白的研究与开发奠定了基础。     

淡色库蚊抗性转录因子FTZ-F1蛋白原核表达与鉴定

目的 对淡色库蚊抗性转录因子FTZ-F1蛋白进行原核表达并鉴定。方法 对转录因子FTZ-F1蛋白进行生物信息学分析,包括蛋白的理化性质,二级结构及三维同源模型。采用PCR技术扩增FTZ-F1基因,比对分析后选取FTZ-F1基因保守区和功能区片段,片段长度为1122bp,然后将其连接至pET-32a(+)载体,构建重组质粒pET-32a(+)-FTZ-F1,再转化入感受态细胞BL21(DE3)后用IPTG诱导重组质粒pET-32a(+)-FTZ-F1的表达,运用SDS-PAGE和Western blot初步鉴定重组蛋白FTZ-F1的表达,采用His标签镍离子蛋白纯化柱对表达产物进行纯化和增加蛋白的量,用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白FTZ-F1的表达。结果 FTZ-F1蛋白有744个氨基酸,相对分子质量为79.57×10³。1%琼脂凝胶鉴定PCR扩增为单一条带,大约为2 240 bp,测序结果表明重组质粒pET-32a(+)-FTZ-F1构建正确。采用SDS-PAGE检测重组蛋白FTZ-F1,结果表明蛋白FTZ-F1在原核表达系统中主要以可溶...     

裂谷热病毒Gn蛋白主要抗原区的表达、纯化及抗原性分析北大核心CSCD

目的通过原核表达系统制备裂谷热病毒Gn片段主要抗原区蛋白,获取纯化蛋白,并分析抗原性。方法将合成的裂谷热Gn基因用PCR的方法扩增具有保护性抗原表位的两段Gn1和Gn2,并将其定向插入原核表达质粒pColdⅠ中,构建重组表达质粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2,并将重组质粒转化到BL21(DE3)感受态中,以IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达蛋白和表达量,并利用His-tag Ni柱进行亲和层析纯化,Western-blot鉴定表达蛋白。结果所构建的质粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2序列正确,SDS-PAGE检测到目的蛋白,Western-blot显示截断的Gn蛋白具有很好反应原性。结论成功纯化了裂谷热病毒Gn主要抗原区的表达蛋白。     

裂谷热病毒Gn蛋白主要抗原区的表达、纯化及抗原性分析

目的 通过原核表达系统制备裂谷热病毒Gn片段主要抗原区蛋白,获取纯化蛋白,并分析抗原性。方法 将合成的裂谷热Gn基因用PCR的方法扩增具有保护性抗原表位的两段Gn1和Gn2,并将其定向插入原核表达质粒pColdⅠ中,构建重组表达质粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2,并将重组质粒转化到BL21(DE3)感受态中,以IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达蛋白和表达量,并利用His-tag Ni柱进行亲和层析纯化,Western-blot鉴定表达蛋白。结果 所构建的质粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2序列正确,SDS-PAGE检测到目的蛋白,Western-blot显示截断的Gn蛋白具有很好反应原性。结论 成功纯化了裂谷热病毒Gn主要抗原区的表达蛋白。     

柔嫩艾美尔球虫EGF-like结构域基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达柔嫩艾美尔球虫（Eimeriatenella）微线蛋白4（EtMIc4）的EGF-like结构域。方法收集并纯化柔嫩艾美尔球虫子孢子,用Trizol法提取总RNA,并反转录成cDNA,利用RT-PCR技术扩增EtMIC4EGF-like基因;回收PCR产物,与pMDl8-T载体连接,构建重组克隆质粒pMDl8-T-EGF-like,然后亚克隆至原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-30a-EGF-like并转化至Transetta感受态,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE和Westernblot分析。结果成功克隆了EtMIC4EGF-like（390bp）基因,双酶切鉴定重组表达质粒pET-30a-EGF-like构建正确。SDS-PAGE分析重组EGF-like蛋白的分子质量单位约为30ku,Westernblot显示该蛋白能被鸡抗柔嫩艾美尔球虫血清识别。结论成功构建了pET-30a-EGFlike原核表达质粒,并证明其原核表达产物EGF-like蛋白具有反应原性,为该蛋白的功能研究奠定了基础。     

SARS冠状病毒N蛋白的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化SARS冠状病毒的N蛋白,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-N中切取N基因的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达N蛋白,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果N基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌表达了SARS冠状病毒的N蛋白;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被重组N蛋白的GST融合蛋白的免疫血清识别,并诱导小鼠产生了高滴度的抗体和Th1/Th2型的免疫应答。结论成功构建了N蛋白的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。     

重组弓形虫GRA8的表达及其诱导的免疫应答

目的表达和纯化弓形虫RH株GRA8的截短型片段,分析其诱导的免疫应答。方法从重组克隆pMD18-GRA8中切取GRA8的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达GRA8,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答。结果GRA8基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌中未见GRA8的明显表达;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被弓形虫感染兔血清识别。结论成功构建了GRA8的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性。     

A族链球菌类胶原样蛋白Scl1的原核表达及纯化

目的构建A族链球菌Scl1的重组体并进行原核表达及表达蛋白的纯化,为进一步研究该蛋白的空间结构及其与A族链球菌所引起的多种疾病之间的关系奠定基础。方法根据A族链球菌M1型国际标准菌株SF370基因组设计Scl1基因扩增引物,通过聚合酶链反应(PCR)获得Scl1目的基因,与原核表达载体pet28a分别通过EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后进行连接,构建重组质粒Scl1-pet28a,并进行序列测定,与原序列比对确定序列的一致性。将Scl1-pet28a转入E.coli BL21中,用IPTG诱导后经MALDI-TOF-MSMS质谱鉴定Scl1的表达,用AKTA全自动蛋白纯化系统对表达蛋白进行纯化。结果获得序列正确的Scl1基因及原核重组表达质粒Scl1-pet28a,MALDI-TOF-MSMS证实重组质粒能够在E.coli BL21中表达,纯化的表达产物为分子质量单位约50ku的单一Scl1蛋白。结论成功构建了Scl1原核表达载体,在E.coli中表达出目的蛋白并获得纯化蛋白Scl1。     

亚洲带绦虫60S核糖体蛋白L8基因的克隆表达和免疫学分析

目的原核克隆表达亚洲带绦虫成虫60S核糖体蛋白L8基因（TaRPI。8）,探索其应用前景。方法用RT—PCR方法从亚洲带绦虫成虫cDNA中获取RPI．8基因,克隆到原核表达质粒pET一28a（＋）中,在大肠埃希茵BL21／DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a（＋）一TaRPL8重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL21／DE3中获得高效表达,亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别但不能够被正常大鼠血清识别,表明其具有免疫原性。结论亚洲带绦虫成虫TaRPI．8基因可在大肠埃希菌BL21／DE3中获得具有免疫原性的表达,为进一步的功能研究奠定了基础。     

犬瘟热病毒M蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的对犬瘟热病毒(CDV)弱毒株M基因进行克隆及原核表达,并制备鼠抗CDV M蛋白多克隆抗体。方法针对犬瘟热病毒弱毒株(CDV-LP)的M基因序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-30a(+)并转化至宿主菌BL21(DE3),在0.4mmol/L IPTG和37℃条件下诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。以纯化的M蛋白免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后采血,分离血清,制备鼠抗CDV M蛋白多克隆抗体。结果通过RT-PCR成功扩增出大小为1 014bp的CDV M基因,构建的重组质粒pET-30a(+)-M在大肠埃希菌中诱导表达出分子质量单位为43ku的重组M蛋白,与预期值相符;重组蛋白主要以包涵体形式表达,Western blot检测显示M重组蛋白能被抗CDV多克隆抗体识别;免疫小鼠制备的多抗能与纯化的重组蛋白发生特异性反应。结论本研究成功构建了pET-30a(+)-M并表达了CDV M蛋白,制备了鼠多克隆抗体,为建立CDV M蛋白的ELISA抗原检测方法,鉴定表达M蛋白的重组杆状病毒奠定了基础。     

猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因的克隆表达及免疫学分析

目的对猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因（malate dehydrogenase,MDH）进行克隆,表达及免疫学特性的初步研究。方法将猪带绦虫MDH基因克隆到原核表达质粒pET-28a（＋）中,在大肠埃希菌BL21/DE3中用异丙基--βD-半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹（Western Blot）进行免疫学分析。结果成功构建pET-28a（＋）-MDH重组质粒,并获得高纯度蛋白,该重组蛋白可被其免疫SD大鼠血清识别,同时也能被感染猪带绦虫的病人及猪、感染牛带绦虫病人及感染亚带绦虫病人血清所识别。结论猪带绦虫苹果酸脱氢酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

牛带绦虫亚洲亚种乳酸脱氢酶基因的克隆表达及免疫原性分析

目的 对牛带绦虫亚洲亚种成虫乳酸脱氢酶基因（LDH）进行克隆、表达和免疫原性分析。 方法 将牛带绦虫亚洲亚种成虫TaLDH克隆到原核表达质粒pET-30a（+）中,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白pET-30a（+）-TaLDH用蛋白质印迹（Western blotting）分析其免疫原性。 结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均显示重组质粒pET-30a（+）-TaLDH构建成功。SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白,浓度为0.9 mg/ml。Western blotting分析结果显示,重组蛋白pET-30a（+）-TaLDH能识别感染牛带绦虫亚洲亚种的猪血清和患者血清,在相对分子质量(Mr)35 000处有一清晰条带,表明其具有免疫反应性。 结论 牛带绦虫亚洲亚种成虫乳酸脱氢酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达。     

亚洲牛带绦虫磷脂酰肌醇转移蛋白α基因的克隆表达和免疫学分析

目的原核克隆表达亚洲牛带绦虫成虫磷脂酰肌醇转移蛋白α基因(Ta PITPα),探索其应用前景。方法将亚洲牛带绦虫成虫PITPα克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹(Western Blotting)进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-Ta PITPα重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清和感染了亚洲牛带绦虫的猪血清识别,表明其具有免疫活性。结论亚洲牛带绦虫成虫磷脂酰肌醇转移蛋白α基因可在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得具有免疫活性的高效表达,为进一步的功能研究奠定了基础。     

H5N1亚型禽流感病毒核蛋白NP的原核表达及抗体制备

目的制备H5N1亚型禽流感病毒NP重组蛋白和抗体,为研制含NP组分的人禽流感亚单位疫苗和建立评价方法提供检测抗原和抗体。方法以H5N1亚型禽流感病毒A/chicken/Hubei/489/2004(H5N1)NP基因cDNA克隆质粒pMD-NP为模板,PCR扩增获得NP基因抗原区片段,克隆到原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-ΔNP,转化大肠杆菌BL21-CondonPlus(DE3)-RIL,IPTG诱导重组蛋白表达。采用Ni亲和层析方法纯化NP重组蛋白,免疫家兔,收集免疫血清,ELISA测定抗体效价;间接免疫荧光检测所制备抗体与真核细胞表达NP蛋白的反应性。结果与结论成功的制备了高效价兔抗NP抗体,抗体效价在105以上,该抗体能与原核和真核系统中表达的NP蛋白特异性反应,为研制以NP蛋白为抗原组分的人禽流感亚单位疫苗和建立评价方法奠定了基础。     

日本血吸虫新基因Sjnanos的克隆、表达及免疫保护效果评估

目的扩增、表达日本血吸虫Sjnanos编码基因并评估其重组蛋白诱导的免疫保护效果。方法从42d龄的日本血吸虫成虫中扩增了一个日本血吸虫性别差异表达的基因,GenBank登录号为AY814948,并对其进行生物信息学分析。将该基因亚克隆入原核表达载体pET28a,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用纯化的重组蛋白免疫小鼠,ELISA检测其血清特异性抗体效价,蛋白印迹分析检测其抗原性,以看家基因NADH为内参,应用荧光定量PCR技术分析该基因在血吸虫各个阶段的表达状况。结果同源性分析表明,该基因为日本血吸虫的一个新基因,其编码序列的开放阅读框(ORF)为525bp,编码174个氨基酸,理论相对分子量为19.9,PI为8.2。荧光定量PCR技术分析显示该基因在7d、13d、18d、23d、32d、42d虫体均有表达,但在18d和13d虫体的表达量明显高于其他天数的虫体,在雄虫的表达量高于雌虫。成功构建了该基因的重组表达质粒pET28a(+)-Sjnanos,并在大肠埃希菌中获得表达,Western-blot分析表明重组蛋白具有较好的免疫原性,动物免疫保护试验获得了31.4%的减虫率和53.8%的肝脏减卵率。结论获得日本血吸虫新的抗原基因Sjnanos,该基因的重组蛋白在小鼠中诱导了部分免疫保护作用。     

华支睾吸虫Rap2B样基因的生物信息学分析及其克隆、表达

目的从华支睾吸虫cDNA文库中筛选Rap2B样基因并分析其结构和功能,初步进行克隆和表达纯化,为进一步研究其功能奠定基础。方法利用多种生物信息学分析软件,分析华支睾吸虫Rap2B蛋白的拓扑学结构、生物学和免疫学功能特征。设计引物,从华支睾cDNA质粒文库中扩增目的基因cDNA序列,构建原核重组质粒并初步表达纯化。结果华支睾吸虫Rap2B样基因长度为847bp,其全长编码序列为426bp,编码141个氨基酸,理论分子量是15851.1。重组的原核表达质粒pET-28a(+)-Rap2B经PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒构建成功。该基因在大肠杆菌中能高效表达。经His亲和层析柱获得了纯化的重组蛋白,Western blotting证实Rap2B重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别。结论华支睾吸虫Rap2B蛋白经生物信息学预测为ras原癌基因家族成员,可能在华支睾吸虫致癌过程中有一定作用。该基因可在原核表达系统中高效表达,并得到了纯化的重组蛋白,为进一步研究该蛋白的功能以及在致病尤其是可能促发肿瘤的作用方面奠定一定基础。     

金黄色葡萄球菌α-溶血素基因表达及溶血活性检测

目的为了进一步研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)α-溶血素(Hla)的分子致病机理及其抗原性,对S.aureusHla进行了表达纯化。方法用聚合酶链式反应(PCR)技术,从S.aureuswood46株中扩增出hla基因,将该基因经BamHI和SalI双酶切后克隆到表达载体PET-32a中,获得重组质粒pET-32a(+)/hla,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析,然后进行纯化和用溶血试验检测其活性。结果扩增的hla基因序列与已发表的hla基因序列同源性为100%,构建的重组表达质粒pET-32a(+)/hla在E.coliBL21(DE3)中得到表达,重组α-溶血素蛋白为53kDa,纯化后的溶血活性为5000HU。结论成功表达并获得了有活性的重组Hla蛋白。