诱导对骨髓间充质干细胞移植后凋亡影响的实验研究

目的 研究兔骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导与移植细胞凋亡的关系.方法 无菌条件下采集兔MSCs,一部分不诱导,一部分经5-氮胞苷诱导使其向类心肌细胞分化;将干细胞移植于兔心肌梗死区.实验动物随机分两组:MSCs组(n=20)心梗后1 h在心梗区域注入MSCs;经诱导组(n=20)心梗后1 h在心梗区域注入经诱导的MSCs.2周后用荧光显微镜观察移值细胞是否存活,利用TUNEL法检测植入细胞的凋亡率.结果 MSCs经5-氮胞苷诱导,传代培养2～4周,细胞表达肌钙蛋白T(trponin T),证明MSCs向心肌细胞转化.移植2周后,用荧光显微镜观察,在梗死区组织标本中可见DAPI标记带蓝色荧光的供体细胞核,形态呈椭圆形类似心肌细胞核,并与心肌纤维排列方向一致,证明移植细胞已存活.利用TUNEL法检测,两组移植细胞均出现细胞凋亡,差异无统计学意义.结论 MSCs移植入心肌组织后的凋亡与5-氮胞苷诱导无关.     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血损伤的治疗作用

分离和培养大鼠骨髓问充质干细胞（MSCs）,并用线拴法制作大脑中动脉闭塞（MCAO）模型,将大鼠随机分为立体定向移植组、尾静脉移植组及模型组,其中移植组中又包括预诱导和未诱导MSCs。移植组在造模7天后分别经立体定向和尾静脉途径将MSCs植入MCAO大鼠脑内,比较MSCs不同移植时间的神经功能缺损（NSS）评分以及免疫组化染色的差异。结果移植后1d各组NSS评分无统计学差异;在2周及1、2、3个月时各移植组NSS评分均低于对照组;2、3个月时立体定向移植组的NSS评分低于尾静脉组;2个月时预诱导组NSS低于未诱导组;免疫组化结果显示立体定向组在梗死侧半球有大量Brdu阳性细胞,尾静脉组双侧半球均可见少量Brdu阳性细胞。移植后1个月可见MSCs分化为Brdu＋NSE、Brdu＋GFAP免疫组化双阳性细胞。认为MSCs可以在体外分离、培养和传代,以立体定向和尾静脉两种途径移植的MSCs可在宿主脑内存活和分化,并改善神经功能;立体定向途径移植效果优于尾静脉途径。     

骨髓间充质干细胞输注对血管性痴呆大鼠海马细胞凋亡的影响

目的观察颈内动脉输注骨髓间充质干细胞(marrow stemcells,MSC)对血管性痴呆(vascular dementia,VaD)大鼠海马细胞凋亡及认知功能的影响。方法取幼年雄性清洁Wistar大鼠股骨骨髓单核细胞,贴壁培养后,取3⁴代MSC诱导分化,用5-溴脱氧尿核苷(BrdU)标记。选老龄Wistar大鼠90只分为对照组、模型组、治疗组,每组30只,每组又分为2、4、8周3个时间点,每个时间点10只。制作VaD大鼠模型,治疗组于术后24h颈内动脉移植0.5ml 1.2×107/ml的BrdU标记细胞。术后2、4、8周3个时间点以穿梭箱对大鼠行为学进行检测。用TUNEL法对大鼠海马凋亡细胞进行检测。结果与对照组比较,模型组和治疗组大鼠术后2、4、8周学习记忆显著降低(P<0.01);与模型组比较,治疗组大鼠术后2、4、8周学习记忆显著改善(P<0.01)。治疗组大鼠术后2、4、8周海马凋亡细胞比例显著低于模型组(P<0.01)。结论颈内动脉移植MSC对VaD大鼠海马细胞有明显保护作用,且显著改善VaD大鼠的学习记忆能力。     

骨髓间充质干细胞移植对脑缺血大鼠脑组织凋亡相关蛋白的影响

目的 探讨经静脉移植的骨髓间充质干细胞(MSCs)在脑缺血大鼠脑组织的分布情况及对凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase 3)及Bcl-2蛋白表达的影响.方法 体外培养及扩增MSCs后,用绿色荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)标记,通过静脉途径移植给大脑中动脉缺血2 h再灌注的SD大鼠,按不同时间点取材,荧光显微镜下观察MSCs在脑内的分布,免疫组化染色检测大鼠脑内Caspase 3、Bcl-2蛋白表达情况.结果 移植组6、12、24、72 h及7 d时,Caspase 3免疫组化阳性目标面密度分别为(2.81±0.35)%、(3.98±0.67)%、(5.58±0.92)%、(3.51±0.63)%、(1.64±0.29)%,明显低于对照组[(3.92±0.44)%、(5.23±0.30)%、(6.89±0.57)%、(4.39±0.57)%、(2.29±0.21)%],两组比较差异有统计学意义(t值分别为4.37、3.34、2.60、2.32、3.90,P＜0.05或＜0.01);移植组6、12 h及7 d,Bcl-2阳性目标面密度分别为(4.70±0.16)%、(5.61±0.26)%、(3.00±0.28)%,明显高于对照组[(3.28±0.27)%、(4.54±0.59)%、(2.15±0.62)%],两组比较差异有统计学意义(t值分别为8.32、3.25、2.54,P＜0.05或＜0.01).结论 MSCs可能通过下调Caspase 3蛋白表达、上调Bcl-2蛋白表达的方式对脑缺血再灌注损伤起保护作用.     

血运重建对骨髓间充质干细胞移植后凋亡影响的实验研究

目的 研究血运重建与兔骨髓间充质干细胞移植后凋亡之间的关系.方法 无菌条件下采集兔骨髓间充质干细胞,用荧光标记.直接结扎法建立兔心肌梗死模型,实验动物随机分两组:①1 h后开放阻断的冠脉,将干细胞移植于兔心肌梗死区(20只).②不开放冠脉,1 h后将干细胞移植于兔心肌梗死区(20只).心梗后1 h在心梗区域注人MSCs.2周后用荧光显微镜观察移值细胞是否存活,利用TUNEL法检测植入细胞的凋亡率.结果 移植2周后,用荧光显微镜观察梗死区组织,可见DAPI标记带蓝色荧光的供体细胞核,形态呈椭圆形类似心肌细胞核,并与心肌纤维排列方向一致,证明移植细胞已存活.利用TUNEL法检测,两组移植细胞均出现细胞凋亡,差异无统计学意义.结论干细胞移植入心肌组织后的凋亡与植入区血运重建有关.     

静脉注射人脐血间充质干细胞对大鼠脑损伤细胞凋亡的影响

目的观察脑损伤后静脉注射人脐血间充质干细胞(HUCBMSC)对大鼠脑损伤细胞凋亡的影响,探讨其脑保护的作用机制。方法清洁级健康雄性SD大鼠90只,随机分为假伤组、损伤组和注射HUCBMSC治疗组(治疗组)。每组30只。每组按时间再分为注射后3、7、14、21和28d,每个时间点6只。采用改进的Feeney自由落体法制作大鼠创伤性脑损伤模型。治疗组尾静脉注入3×106个HUCBMSC,损伤组及假伤组注入等体积的PBS液。在不同时间点,采用HE染色、免疫组织化学法、原位杂交法对大鼠脑组织形态学变化、5-溴脱氧尿核苷标记、细胞凋亡情况进行检测。结果假伤组细胞凋亡呈弱阳性表达。与假伤组比较,损伤组在相同时间点脑组织凋亡细胞明显增多,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与损伤组比较,治疗组在相同时间点脑组织凋亡细胞明显减少,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论在创伤性脑损伤中,静脉注射HUCBMSC可以减少损伤局部细胞凋亡,改善局部微环境,促进神经元的修复。     

洛伐他汀抑制大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的实验研究

目的体外以缺氧无血清条件模拟心肌梗死后的心脏缺血微环境,研究洛伐他汀是否能够抑制缺氧无血清引起的骨髓间充质干细胞（MSCs）凋亡。方法以Hoechst33342染色法及AnnexinV／PI流式细胞术检测洛伐他汀的抗凋亡作用,检测线粒体膜电位变化,进一步采用Western blot方法检测洛伐他汀对细胞色素C释放及caspase-3活化的影响。结果洛伐他汀0．01～1μmol／L能够有效地抑制缺氧无血清引起的MSCs凋亡。洛伐他汀抑制线粒体凋亡途径,增强线粒体膜电位水平、抑制细胞色素C释放,降低caspase-3活化水平。结论洛伐他汀能够抑制线粒体途径介导的凋亡,阻止caspase-3的活化,发挥抗缺氧无血清引起的MSCs凋亡,为提高移植干细胞的存活率提供了一种可能有效的干预措施。     

兔骨髓间充质干细胞移植后移植细胞凋亡的实验研究

目的利用TUNEL法检测5-氮胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）移植后的凋亡情况。方法5-氮胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞MSCs向肌源性心肌细胞分化,通过免疫组化,鉴定诱导后的MSCs是否向类心肌细胞转化。建立兔心肌梗死模型,将细胞移植于心梗区域。移值2周后,利用TUNEL法检测植入细胞的凋亡率。结果移植2周后,可见DAPI标记带蓝色荧光的供体细胞核,分布比较广泛,形态呈椭圆形类似心肌细胞核,并与心肌纤维排列方向一致,证明移植细胞已存活。移值细胞表达troponinT,证明移植的MSCs分化为类心肌细胞。移植细胞均出现不同程度细胞凋亡。结论移植的MSCs细胞可在缺血的心肌组织存活,并分化为类心肌细胞,但移植细胞均出现不同程度凋亡。     

5-氮胞苷诱导对骨髓间充质干细胞凋亡影响的实验研究

目的：研究5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)对体外培养的兔骨髓间充质干细胞(mensenchymal stem cell, MSC)凋亡的影响。方法：体外分离培养兔 MSC,用不同浓度5-aza 诱导不同时间,观察 MSC 凋亡情况。结果：正常培养兔 MSC 有轻度细胞凋亡；5-aza 诱导浓度达15μmol/L 时凋亡率明显增加(P＜0.01),当浓度达10μmol/L, 诱导时间延长则细胞凋亡率明显增加(P＜0.05),超过15μmol/L 时出现成片细胞死亡。结论：5-aza 诱导对体外培养兔骨髓间质干细胞有诱导细胞凋亡作用,其作用程度与诱导时间及浓度有关。     

骨髓间充质干细胞静脉移植对心肌梗死大鼠心功能的影响

目的探讨静脉途径移植骨髓间充质干细胞(MSCs)对急性心肌梗死(AMI)大鼠心功能的影响。方法雄性SD大鼠20只,分为干细胞移植组(10只)和对照组(10只)。结扎大鼠左冠状动脉建立心肌梗死模型。同种异体大鼠MSCs体外分离、纯化、扩增,4’,6-二脒-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)标记,并通过尾静脉于心肌梗死后1周移植入AMI大鼠体内,对照组则注射等量培养液。4周后测定心功能,并行免疫组织化学检测。结果心肌梗死4周后,干细胞移植组心肌组织冷冻切片中可以观察到DAPI标记细胞存在,免疫组织化学显示阳性标记细胞a-Actin肌动蛋白检测阳性。干细胞移植组心功能较对照组有明显改善(P<0.05)。结论MSCs经静脉移植可以归巢至梗死心肌处,并能改善受损的心功能。     

亚砷酸诱导人骨髓间充质干细胞凋亡的研究

目的研究亚砷酸（ATO）体外对人骨髓间充质干细胞（MSC）凋亡的影响。方法在正常人髂后上棘穿刺获得MSC,体外培养传代,取第3代细胞鉴定后进行实验。纯化的MSC与1、5、10μmol／L的ATO共孵育,分别在6、12、24h用HE染色观察细胞形态学变化,透射电镜观察细胞超微结构,流式细胞术（FCM）分析细胞凋亡情况。结果ATO可致MSC形态明显改变;不同浓度ATO对MSC作用24h可见不同阶段的凋亡细胞;FCM检测表明,ATO可诱导MSC凋亡,该作用随ATO浓度和作用时间增加而增强。结论ATO可在体外诱导MSC凋亡,并呈时间和浓度依赖性。     

兔骨髓间充质干细胞诱导分化为血管内皮细胞的实验研究

干细胞移植治疗是当今一种极为先进的医疗技术,该治疗方法对于临床中某些疑难杂症的医治带来了希望的曙光,而干细胞移植有着让人体组织细胞修复、重建的作用。MSCs在人体中属于骨髓间充质干细胞,其可以对骨髓中的造血干细胞有促进、支持等作用[1]。近年来,干细胞移植治疗在临床组织再生各方面应用广泛,但是干细胞是具有多向分化潜能的细胞,移植后有成瘤的风险,其安全性需进一步研究[2,3]。     

系统性红斑狼疮患者骨髓间充质干细胞凋亡相关研究

目的 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者骨髓间充质干细胞(BMSCs)的凋亡变化及凋亡相关因子的表达.方法 密度梯度离心和贴壁筛选法分离培养SLE患者及健康人骨髓MSCs,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡;流式细胞术检测细胞表面Fas、Bcl-2表达水平及Caspase 8活性;实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术榆测Fas、Bcl-2、Bax、Bcl-w、Caspase 8及凋亡细胞蛋白酶激活因子(Apaf)-1 mRNA表达水平;免疫组织化学染色检测胞质细胞色素C表达水平;统计学采用Mann-Whitnev秩和检验.结果 SLE患者BMSCs凋亡明显高于健康对照组[(64±10)%和(14±9)%,U=0,P<0.05];SLE患者BMSCs抗凋亡因子Bcl-2蛋白表达显著低于健康对照组[(11±9)%和(56±18)%,U=0,P<0.05],其mRNA表达水平同样显著低于健康对照(0.2±0.2和2.4±0.7,U=24.P<0.05);SLE患者BMSCs胞质中细胞色素C表达显著增多[(56±21)%和(16±16)%,U=1,P<0.05].SLE患者BMSCs细胞内Caspase 8活性增强[(49±14)%和(16±12)%,U=0,P<0.05],但基因表达水平与健康对照组比较差异无统计学意义(U=28,P>0.05);SLE患者与健康对照组BMSCs均高表达Fas,差异无统计学意义(U=19,P>0.05).结论 SLE患者BMSCs凋亡增多,可能与Bcl-2表达减少、胞质中细胞色素C表达增多和Caspase 8活性增强,从而激活内源性及外源性凋亡途径相关.

Abstract：

Objective To investigate the apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)from systemic lupus erythematosus(SLE)patients and the expression of apoptotic molecules.Methods BMSCs were isolated from bone marrow of SLE patients and normal controls by density eentrifugation and adhesive culture in vitro.The apoptosis of BMSCs were evaluated by TUNEL assay.The expressions of Fas.Bcl-2 and the activity of Caspase 8 were detected by flow cytometry.Real-time PCR technique was used to determine the gene expressions of Fas,Bcl-2,Bax,Bcl-w,Caspase 8 and Apaf-1.Meanwhile,cytochrome C was detected by immunocytochemistry.Statistical analysis was conducted with t-test and Mann-Whitney rank test.Results The percentage of apoptotic BMSCs increased in SLE patients compared with healthy donors[(64±10)%vs [14±9)%,U=0,P<0.05 ].The expression of Bcl-2 in BMSCs of SLE patients was lower than the normal controls at protein leve[(11±9)%vs(56±18)%,U=0,P<0.05 ],and mRNA level(0.2±0.2vs 2.4±0.7,U=24,P<0.05).More cytochrome C positive pellets in the cytosolic fraction could be detected in BMSCs from SLE patients compared with healthy controls [(56±21)%vs (16±16)%,U=1,P<0.05].The activity of Caspase 8 was enhanced[(49±14)%vs(16±12)%,U=0.P<0.05 ],although with no significant difierence at mRNA Ievel.Both groups expressed Fas but with no significant difference (U=19,P>0.05).Conclusion BMSCs from SLE patients undergo more apoptosis,the mechanisms may be associated with the down regulation of Bcl-2,up-regulation of Cytoehrome C in cytoplasm and the activation of Caspase 8,which directs the intrinsic and extrinsic apoptosis pathways.     

骨髓间充质干细胞归巢研究进展

骨髓问充质干细胞（BMMSCs）,是一种多能干细胞,具有多向分化潜能,可分化为骨细胞、软骨细胞、内皮细胞、心肌细胞等,并能分泌大量细胞因子,参与组织修复。因此,BMMSCs成为科研工作者研究的热点和焦点,并取得了不少令人欣喜的成果,但是其到底是怎么归巢到靶器官,仍不是很清楚。本文就BMMSCs归巢的机制和影响因素进行简要综述。     

骨髓间充质干细胞在造血重建中的作用

目的 探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSC)在造血损伤修复中的作用.方法 将同系小鼠股骨、骨壳、注入骨髓条的塑料管及经20 Gy γ-射线照射的股骨分别植入同一小鼠腹部皮下,观察1、2、3、4 w各移植物造血重建情况.观察髓腔内微循环结构与机能、组织学、分化不同阶段的造血细胞数目与机能等变化,以及骨皮质体外间充质干细胞(MSC)培养与扩增规律.结果 乏造血干细胞(HSC)的骨皮质异位移植完全可以造血重建,在移植后4 w,移植物已形成完整的封闭的具有正常造血组织的股骨,其重建的程序、速度与具有大量HSC的完整股骨移植的重建基本一致.而经射线破坏和注入塑料管内的骨髓条完全失去造血重建功能.结论 骨皮质可能是骨髓MSC的源泉,BM-MSC是造血重建的不可缺少的因素.     

Resovist标记大鼠骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死的磁共振成像监测

目的探讨MRI监测Resovist体外标记大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗脑梗死后在脑内的分布及迁移。方法 16只大鼠随机分为对照组8只和移植组8只。BMSCs传至P3代后,Resovist体外标记BMSCs。采用改良Longa法制作大鼠脑梗死模型,移植组缺血对侧顸叶脑皮质移植Resovist标记的BMSCs,对照组不移植。2组大鼠均于移植后1 d和1、2、4周行MRI动态观察。移植后4周行脑组织HE染色及普鲁氏蓝染色。结果移植组大鼠移植后1 d和1、2、4周MRI序列上,均可显示缺血对侧半球移植的Resovist标记BMSCs所致的低信号,移植后2周可见沿胼胝体腹侧走行的线状低信号影,移植后4周细胞所致的彗星状改变更为明显,彗星尾向缺血侧延伸。脑组织普鲁氏蓝染色显示,移植组大鼠胼胝体内迁移的蓝染细胞呈条带状排列。结论临床应用型MRI可获得满意图像质量及实验数据,不仅可显示移植位点BMSCs所致的低信号,还可明确显示BMSCs经由胼胝体的迁移。     

骨髓干细胞移植可影响心肌梗死后心肌细胞的凋亡

目的观察骨髓单个核细胞（bone marrowmononuclear cells,BM-MNCs）移植对大鼠急性心肌梗死（AMI）后心肌细胞凋亡的影响。方法健康雄性Wistar大鼠30只,随机均分为实验组和对照组。用结扎冠状动脉左前降支的方法建立大鼠AMI模型,将制备的BM-MNCs悬液和培养液分别经心外膜下植入实验组和对照组梗死心肌周围。移植术后4周末,检测心肌细胞凋亡情况及Bcl-2、Fas、FasL蛋白在心肌细胞中表达水平,并观察梗死区心肌内移植BM-MNCs及其周边区组织形态学特点。结果移植后4周末,实验组心肌细胞凋亡指数显著低于对照组（P<0.05）;与对照组相比,实验组Bcl-2蛋白吸光值显著升高（P<0.05）,Fas、FasL蛋白吸光值显著降低（P<0.05）;实验组心肌梗死区内有BrdU标记阳性的BM-MNCs存活。结论同种异体大鼠BM-MNCs移植可调节Bcl-2、Fas、FasL蛋白表达,抑制AMI后心肌细胞凋亡发生。     

骨髓间充质干细胞移植对心力衰竭大鼠心功能的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）对心衰大鼠心功能的影响及其机制。方法腹腔注射阿霉素（2mg／kg,每周1次,连续6周）至近交系F344大鼠体内,建立心衰大鼠模型。存活大鼠（32只）随机分为2组：心衰组（16只）和细胞移植组（16只）。分离纯化大鼠MSCs进行体外培养,予4,6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）进行标记;经股静脉注射MSCs或DMEM至心衰大鼠体内。细胞移植后4周,应用多导生理记录仪测量大鼠心功能;通过免疫组织荧光及化学染色,观察移植细胞存活情况,并计算血管数量;通过天狼猩红染色计算心肌胶原容积分数（CVF）和血管周围胶原面积（PVCA）。结果移植后4周,细胞移植组大鼠心肌组织见到DAPI标记的移植细胞存活,并表达心肌特异性抗原心肌肌球蛋白重链（β—MHC）。与心衰组相比,细胞移植组最大左室收缩末压（LVSP）、左室内压最大（最小）变化速率（LV＋dp／dtmax）均明显升高（P〈0．05）,而左室舒张末压（LVDP）明显下降（P〈0．05）;细胞移植组左室血管数量明显高于心衰组[（11．83±1．40）个比（7．78±1．39）个,P〈O．05],细胞移植组左心室内膜CVF及PVCA明显低于心衰组（4．53±1．98比7．79±1．99,10．91±2．31比14．17±2．49,P〈0．05）。结论MSCs移植可改善心衰大鼠心功能,其机制可能与MSCs归巢至心脏,分化为心肌样细胞,并且促进血管新生、抑制心肌纤维化有关。     

骨髓间充质干细胞移植治疗脑出血

脑出血起病急骤、病情凶险、病死率很高,目前缺乏真正有效的治疗措施和药物.骨髓间充质干细胞在特定微环境诱导下具有向多种细胞分化的潜能,而且已在不同微环境条件下将其成功诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞、心肌细胞、神经元、神经胶质细胞等,为脑出血的治疗带来了新的希望.     

人脐血间充质干细胞抑制心肌细胞凋亡的作用与安全性

目的探讨人脐带血来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)诱导后的安全性及其与人心肌细胞共培养下的抗凋亡作用。方法在知情同意的原则下,取得10位供者分娩时的脐带血。脐带血来源的MSCs经5-氮杂胞苷处理后向心肌细胞诱导分化。观察诱导分化的MSCs端粒酶活性,G带显带技术下的染色体组型,裸鼠体内诱导肿瘤形成,RT-PCR以及共培养下对心肌细胞凋亡的抑制作用。结果脐带血来源的MSCs可在体外经5-氮杂胞苷诱导分化为心肌细胞,诱导后的细胞具有端粒酶活性,未观察到异常的染色体组型。p53、cyclinA、Cdk2、β-肌动蛋白、c-fos、h-TERT和c-myc在5-氮杂胞苷处理前后的MSCs中表达相似。注射到裸鼠体内未见肿瘤形成。脐带血来源的MSCs对人心肌细胞凋亡有明显的抑制作用。结论脐带血来源的MSCs是一种安全有效的移植治疗的细胞来源,共培养下能抑制人心肌细胞的凋亡。