人脐静脉内皮细胞的分离培养和冻存

目的研究体外分离、培养、冻存人脐静脉内皮细胞的有效方法以获得大量人脐静脉内皮细胞，为构建含血管的组织工程皮肤提供种子细胞。方法新鲜脐带内灌注胶原酶消化，获得内皮细胞，用含20％胎牛血清的M199液进行培养。倒置显微镜观察细胞形态，结合Ⅷ因子免疫组化鉴定细胞来源。内皮细胞加入10％甘油的冻存液，分别置于渡氮保存1周和4周，复苏后血球计数板计数，绘制生长曲线。结果脐静脉内灌注胶原酶法可获取高纯度的内皮细胞，与未冻存细胞相比，复苏的细胞活力保持在80％以上，复苏后生长曲线与未冻存细胞相似。结论脐静脉灌注酶消化法可获取大量高纯度的内皮细胞。冻存的内皮细胞复苏后仍保持较高的体外增殖能力，可作为制备含血管的组织工程皮肤的种子细胞来源。     

乙型肝炎病毒对肾小管上皮细胞直接作用的实验研究

目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）在体外对人肾小管上皮细胞（HKC）的直接致病作用。方法：①HBV体外感染HKC：培养的HKC传至6孔板中，接种密度为1×10^6个／ml，孵育24h后分受感染和阴性对照两组。受感染组加入0．5ml HepG2．2．15细胞上清液（含有HBV）；阴性对照组加入0．5ml 10％FCS—DMEM／F—12培养液。两组HKC继续孵育72h，消化，离心沉淀，PBS清洗，实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）检测两组HKC中的HBV DNA含量。②HBV对体外培养的HKC细胞直接作用：HKC细胞传至24孔板中，接种密度为1×10^5个／ml，受感染组分三个亚组，分别加入100μl、200μl和300μl的感染用HepG2．2．15细胞上清液；阴性对照组为接种HKC后加入培养液常规培养；阳性对照组为HepG2．2．15细胞上清液。各组的每孔终体积均为2ml，每组设3复孔。孵育72h后收集各孔上清液，ELISA法检测转化生长因子β1（TGF-β1）的表达。结果：①受感染组HKC的基因组中检测到HBV DNA。②受感染组的三个亚组细胞培养上清的TGF-β1与阴性对照组比较差异均有显著性。结论：HBV可感染HKC并促进其分泌TGF-β1。     

细胞凋亡显像剂^99mTc-膜联蛋白V的制备与体内分布

将本室改造的毕赤酵母接入100ml BMGY培养基培养24h，离心收集酵母细胞并重悬于100ml BMMY培养基，每12小时加入终浓度为0．5％甲醇诱导表达具有内在金属螯合位点的突变型人膜联蛋白V。48h后离心沉淀培养基，获得的上清经硫酸氨沉淀、分子筛分离纯化蛋白；SDS—PAGE鉴定其相对分子质量为36000，并测定其纯度为95％。纯化后的蛋白加入终浓度为1mmol／L二硫苏糖醇，37℃保温15min恢复活性，     

程控冻存对NK细胞杀伤作用影响的研究

以~3H-TdR释放法和效靶细胞结合试验检测程控冻存前后单个核细胞(MNC_(?))中NK细胞杀伤活性。结果当效靶细胞比例为20∶1、60∶1、100∶1时,程控冻存后即刻、冻存7天和冻存30天的MNC(?)中NK细胞杀伤活性与冻存前无显著性差异,冻存复苏后早期效靶细胞结合率降低,在预培养12小时左右恢复至冻存前水平。以间接免疫荧光法检测冻存前后MNC_(?)中heullb、leul9阳性细胞亚群百分率无显著差异。     

肺腺癌细胞株培养方法改进

目的：探讨培养条件及冻存方法对肺腺癌细胞株的影响。方法：在培养基中放弃使用抗生素,控制细胞传代、消化条件,采用快速冻存法保存细胞。结果：37℃,5％CO2孵箱培养2h左右开始贴壁,8h左右完全贴壁,48－60h可形成单层。结论：（1）只要切实注意无菌操作规程,培养基中无需常规使用抗生素;（2）控制胰酶条件、离心速度可减少细胞培养过程中的损伤;（3）细胞快速冻存法优于传统的慢速冻存法。     

低温-18℃冷冻保存人肝癌细胞的实验研究

目的：了解低温－１８℃保存人肝癌细胞Ｂｅｌ７４０２回收率,并观察其复苏后培养的形态。方法：采用不同浓度的二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）为冻冻保护剂,直接于－１８℃冰箱中冻存人肝癌细胞株Ｂｅｌ７４０２,于冻存后１周、１个月、２个月和３个月分别取样观察分析。结果：冻存３个月后,台盼蓝拒染存活率〉７０％,置瓶培养后第４天细胞均可贴壁生长、形成克隆。结论：用－１８℃普通冰箱冻存肿瘤细胞效果好,方法简单易行。     

冻存人体皮肤皮块培养与细胞悬液培养的比较

目的：细胞增殖能力是评价冻存皮肤整体活力的重要指标之一，本研究为了比较冻存的人体皮肤皮块培养与细胞悬液培养成功率的差异，为客观评价冻存皮肤质量提供较可靠的方法，方法：将液氮中保存1周－2月的人体皮复温后，分别取标本进行皮块培养与细胞悬液培养，观察其培养的成功率，以新鲜皮肤对照，结果：冻存皮肤皮块培养成功率显著高于细胞悬液培养的成功率，结论：用皮块培养方法来判断冻存皮肤的增殖能力比细胞悬液培养更可靠。     

人脐静脉内皮细胞分离及冷冻保存的技术

目的 研究分离、培养、扩增人脐静脉内皮细胞及进行冷冻保存技术，探讨建立脐带血管内皮细胞库的可能性。方法 新鲜脐带42条，脐静脉内灌注消化酶消化，获得内皮细胞：以含20％的胎牛血清M199液进行培养。采用Ⅷ因子免疫荧光染色及扫描电镜检查，鉴定所获内皮细胞及其纯度：内皮细胞加入含10％DMSO冷冻保存液，置于液氮进行保存，复苏后进行锥虫蓝试验，四氮唑盐(MTT)试验以及细胞凋亡的流式细胞仪检测。结果 血管内灌注消化液法可获取高纯度的内皮细胞，与未冻存细胞相比，复苏的细胞活力保持在95％以上。复苏后的内皮细胞的生长曲线与未冻存细胞的生长曲线无差异。冻存内皮细胞的凋亡率较未冻存细胞高，但无统计学意义。结论 脐静脉灌注酶消化法可获取足够数量及纯度的内皮细胞。冻存的内皮细胞复苏后仍保持较高的活力及体外增殖能力，可作为制备组织工程学血管的种子细胞来源。     

人的复合人工皮肤组织工程学研究—角朊细胞库的构建

目的：介绍成我包皮角细胞的分离、培养、传代、冻存、复苏及鉴定技术。方法：采用细胞工程技术及免疫组化技术。结果：采用细胞工程技术至少可将角朊细胞传至６代以上，此时的细胞数至少原代培养的细胞数的１万倍，经冻存、复苏后，此角朊细胞仍既能增殖、又能分化，生长状态与原代培养的角朊细胞相类似；免疫组化显示：ＡＥ１反应阳性。结论：可以认为我们建立了角朊细胞库。     

人胚神经干细胞的冻存与复苏

目的：研究神经干细胞浆存复苏后的成活率及再培养生长情况。方法：利用无血清培养基短期体外培养胚胎来源的神经干细胞后，以冻存液（体积分数为70％DMEM／F12，体积分数为20％胎牛血清，10％DMSO）进行冻存，于1周，4周，8周，12周，16周，20周，24周分别复苏，计活细胞比例并进行再培养。结果：复苏后神经干细胞的成活比例分别为68％、65％、65％、62％、61％、60％、60％，再培养生长良好。结论：本实验对神经干细胞成功地进行了冻存，复苏和再培养，对临床择期进行神经干细胞移植手术和建立“神经干细胞库”具有重要的意义。     

人胚肺细胞的体外培养及生物学特性

本文在长期培养人胚肺细胞的过程中，对体外培养细胞的生长曲线，不同代次细胞染色体数目分析以及细胞的冻存和复苏存活率等生物学特性作了初步研究.结果表明：体外培养的人胚肺细胞符合二倍体细胞的生长曲线，形态为成纤维细胞.检测不同代次培养细胞中的染色体数目，其中２ｎ＝４６条的占８７～９０％，长期冻存的细胞，复苏后２４ｈ接种存活率大多在９０％以上.体外培养的人胚肺细胞符合二倍体细胞的生物学特征，液氮中冻存的种子细胞可长期作为实验对象.     

HL60细胞冻存复苏生物学特性对比分析

目的探讨不同冻存复苏条件对白血病细胞株HL60生物学特性的影响,并优化培养方法与条件。方法对比不同浓度DMSO冻存条件、不同复苏方法对复苏后细胞生物学特性的影响,并确定培养液血清最佳浓度。结果采用5%DMSO冻存防护效果好于其他组,改良后细胞的复苏存活率明显高于传统复苏方法。结论以5%DMSO作为HL60细胞冻存保护剂并采用改良复苏方法,可使细胞保持最佳生物学特性,12%血清为HL60细胞常规培养的最适浓度。     

苦参碱联合DMSO大规模冻存人胎肝细胞的实验研究

目的 应用苦参碱联合DMSO大规模冻存人胎肝细胞,观察苦参碱对大规模低温冻存人胎肝细胞功能的影响。方法 改良肝细胞获取方法分离人胎肝细胞,经过1h预培养后。将5种不同浓度（1×107,2.5×107,5×107,7.5×107,10×107)的胎肝细胞以6mg/L苦参碱+5%DMSO冻存保护液置于骨髓干细胞冻存袋在液氮中冷冻保存1个月。1个月后复苏,进行活率、形态学及功能检测。结果 五种不同浓度的细胞冻存一月后,细胞浓度为2.5×107/ml组复苏后存活率与其余四组相比差异有统计学意义（P<0.05）且明显高于其余四组。复苏后细胞存活率和24h贴壁率分别为73%、69%,经过短期培养后,细胞功能逐渐恢复。结论 (1苦参碱对低温冻存之人胎肝细胞有保护作用,与二甲基亚砜联合使用可降低后者的浓度;（2）以5%DMSO+6mg/L苦参碱作为冻存保护剂,细胞浓度在2.5×107冻存效果最佳。该大规模冻存方法基本上可以满足生物人工肝肝细胞应用的需求。     

人胚血管平滑肌细胞的体外培养、冻存与复苏

目的：介绍人胚动脉血管平滑肌细胞（VSMCs）体外培养和保存方法。方法：从人工流产的胎儿主动脉分离动脉中膜组织。应用组织块培养方法进行人胚VSMCs培养,并行形态学观察及免疫组化鉴定;将第4代的人胚VSMCs冻存,2周,1、2、6个月后将细胞复苏,观察复苏后人胚VSMCs的生长情况。结果：培养的人胚VSMCs经鉴定为平滑肌细胞,培养的人胚VSMCs经冻存,复苏率超过80％。结论：人胚VSMCs体外培养、冻存及复苏成功,使人胚VSMCs培养体系更加完善,为心血管疾病药物的研究及组织工程化血管提供丰富的细胞来源。     

YAC-1细胞冻存方法的研究

目的研究YAC-1细胞保种的冻存方法。方法用3种不同的冻存方法对YAC-1细胞进行冷冻保存,在冻存1年内不同时间段对细胞存活率及复苏24小时后细胞的生长状况进行比较。结果用不同的冻存方法冻存YAC-1细胞,不同时间段复苏后细胞存活率不同,3种方法无显著性差异,生长状况均良好,为实验室选择适合的冻存方法提供了依据。     

骨髓基质细胞的培养和保存方法

目的：建立大量生产骨髓基质细胞的培养和保存方法。为组织工程骨的培养提供种子细胞。方法：从4～5月龄新西兰大白兔胫骨上端髓腔抽吸骨髓，接种、培养及液氮冻存。通过显微镜观察其生物学表现，测定碱性磷酸酶，鉴定其生物学特征。结果：在培养过程中，未分化的骨髓基质细胞选择性粘贴于培养皿底，形态为成纤维细胞样，并呈集落生长。培养值至9-10天时，贴壁细胞单层融合。传代后的细胞形成集落的趋势明显下降，但细胞形态仍表现为成纤维细胞样，复苏细胞贴壁时间延迟，但增殖速度和形成没有改变。可测出碱性磷酸酶活性。结论：成功地建立了骨髓基质细胞的培养和冻存方法。     

YAC-1细胞冻存方法的研究

目的 研究YAC-1细胞保种的冻存方法.方法 用3种不同的冻存方法对YAC-1细胞进行冷冻保存,在冻存1年内不同时间段对细胞存活率及复苏24小时后细胞的生长状况进行比较.结果 用不同的冻存方法冻存YAC-1细胞,不同时间段复苏后细胞存活率不同,3种方法无显著性差异,生长状况均良好,为实验室选择适合的冻存方法提供了依据.     

冻存骨髓基质细胞体外成骨潜能的实验研究

目的 观察冻存骨髓基质细胞（BMSC）的体外生长特点及诱导与非诱导条件下的成骨能力。方法 取冻存11个月犬BMSC复苏后进行体外扩增培养，传代培养中加入10^-8mol／L地塞米松、50mg／L Vit C和10mmol／L β-甘油磷酸钠进行诱导分化，观察细胞形态、细胞诱导前后增殖情况、细胞碱性磷酸酶（ALP）含量以及形成矿化结节能力的改变。结果 冻存BMSC复苏后呈成纤维样表现，增殖力强。在诱导液的作用下冻存BMSC增殖性能降低，ALP活性增加，诱导5d后可见矿化结节。结论 冻存BMSC增殖能力强，经诱导后表现出明显的成骨活性，可作为骨组织工程的种子细胞。     

大体系冻存对细胞因子诱导的杀伤细胞免疫表型及细胞杀伤活性的影响

目的探讨大体系(50 mL)冻存对细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞免疫表型及细胞杀伤活性的影响。方法采集6例健康志愿者的外周血,采用Ficoll法分离得到单个核细胞,用细胞因子诱导培养CIK细胞。收集冻存1个月后复苏的CIK细胞,采用流式细胞术检测其冻存前后的细胞活率和免疫表型;通过与乳腺癌细胞共培养(效靶比10∶1和40∶1)的方法测定其杀伤活性,与新鲜未冻存的细胞杀伤活性进行比较,同时并对不同效靶比冻存前后的细胞杀伤活性进行比较。结果 CIK细胞大体系冻存前平均细胞活率(97.79±1.92)%,显著高于复苏后的(83.61±3.42)%(P<0.05)。复苏后CIK细胞中CD3~+、CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+、CD3~+CD56~+表型CIK细胞所占比例虽较冻存前稍有降低,但差异均无统计学意义(P>0.05)。效靶比10∶1、40∶1时冻存前细胞和复苏后细胞杀伤率比较差异均无统计学意义(P>0.05);效靶比40∶1时冻存前细胞和复苏后细胞杀伤率均显著高于效靶比10∶1时(P<0.05)。结论大体系(50 mL)冻存对于CIK细胞活率虽有影响,但对免疫表型和细胞活性均未影响。     

人角膜缘干细胞初步建系研究

目的：探讨建立人角膜缘干细胞系，为组织工程研究提供足够的细胞储备。方法：取健康人角膜缘深部色素区组织块，经消化后，在含有RPMI—1640、20％胎牛血清的培养瓶和以羊膜细胞外基质为培养载体的培养皿中分别进行体外培养，并对连续传代的细胞行光镜、扫描电镜观察，比较细胞形态的变化并进行细胞计数与冻存处理。结果：人角膜缘干细胞具有人上皮细胞培养的特性，在培养液中传33代后，细胞仍然保持旺盛的分化、增殖能力，并且更适宜在羊膜细胞外基质上生长；目前我们冻存细胞的复苏率为82．2％。结论：将人角膜缘干细胞经体外培养33代并逐代冻存后初步建立了人角膜缘干细胞系。