Polo-like激酶l反义RNA对肺癌细胞A549生长的实验研究

目的： 探讨Polo-like激酶1（Plk1）基因表达下调对肺癌细胞周期分布及其生长的影响。方法： 培养肺腺癌细胞株A549，构建表达Plk1反义RNA的质粒pcDNA3-Plk1，通过脂质体介导转染A549细胞，采用RT-PCR和Western blotting的方法检测Plk1基因的表达，细胞计数、BrdU脉冲标记检测细胞增殖，流式细胞仪分析细胞周期变化和凋亡，MTT法检测长春瑞宾（NVB）对各组细胞的生长抑制率。结果： A549细胞转染pcDNA3-Plk1后24 h，Plk1 mRNA及蛋白表达均下降；细胞变圆、漂浮、增殖减慢；S期细胞百分数（BrdU标记指数）显著低于对照组（P<0.05）；转染后48 h A549细胞出现G₂/M期阻滞（P<0.05）并发生凋亡；等浓度化疗药物诺维本对转染pcDNA3-Plk1细胞的抑制率明显高于各对照组（P<0.05），转染pcDNA3与未转染的对照细胞差异无显著（P>0.05）。结论： pcDNA3-Plk1的转染能下调Plk1基因的表达，抑制A549细胞增殖，诱导凋亡，并能增加A549细胞对化疗药物的敏感性。     

RNA干扰技术抑制Polo-like激酶1表达对A549细胞的影响

目的： 观察RNA干扰技术能否有效抑制非小细胞肺癌细胞株A549细胞中Polo-like激酶1（Plk1）的表达水平，以及抑制后对A549细胞生长的影响。方法： 运用脂质体法，以Plk1为靶点，构建能产生siRNA的质粒载体psiRNA-hH1-Plk1并转入A549细胞。RT-PCR检测Plk1 mRNA表达的变化、Western blotting检测Plk1、cyclin B1、p53蛋白的表达变化、细胞计数分析细胞增殖、流式细胞术分析细胞周期变化和凋亡、免疫荧光染色检测α微管蛋白的表达。结果： psiRNA-hH1-Plk1质粒能特异地抑制Plk1基因的表达并使其活性下降，致使cyclin B1及p53蛋白的表达水平升高，微管聚集障碍或形成单极的纺锤体；A549细胞增殖减慢，出现G2/M期阻滞和凋亡。结论： 上述结果提示针对Plk1基因的RNA干扰有望用于肿瘤的基因治疗。     

microRNA干扰Id3基因表达对A549细胞增殖和凋亡功能的影响

目的:研究微小RNA(miRNA)干扰细胞分化抑制因子3(Id3)基因表达对人肺腺癌细胞株A549细胞体外增殖和凋亡作用的影响。方法:构建含靶向Id3 mRNA的miRNA所对应寡核苷酸的重组干扰载体pcDNATM6.2-GW/EmGF-PmiRId3(pcDNA/miRId3),通过脂质体转染技术将miRNA干扰质粒pcDNA/miRId3和含Id3基因的重组表达载体pEGFP/Id3共转染A549细胞。荧光显微镜观察EGFP表达情况;流式细胞术(FCM)分析转染24 h后A549细胞的EGFP表达效率;半定量RT-PCR和Western blot技术检测转染后A549细胞内Id3 mRNA及蛋白的表达;MTT法和Annexin V-FITC/7-AAD双染法结合FCM检测靶向Id3基因的miRNA转染A549细胞后对增殖和凋亡的影响。结果:RT-PCR和Western blot结果表明,将pEGFP/Id3和pcDNA/miRId3共转染A549细胞24 h后,A549细胞中外源性Id3 mRNA和Id3蛋白质的表达量均明显受到抑制。MTT和Annexin V/7-AAD双染法结果表明,pEGFP/Id3转染A549细胞24 h后,对A549细胞增殖功能有明显抑制作用,细胞早期凋亡率明显增加,与pEGFP对照组相比均呈统计学差异(P0.01),但pEGFP/Id3与pcD-NA/miRId3共转染A549细胞后,细胞增殖率和凋亡率均未发生明显变化。结论:外源性Id3基因在A549细胞中的表达能够抑制细胞增殖并诱导凋亡,同时导入靶向Id3 mRNA的miRNA干扰质粒pcDNA/miRId3,可逆转外源性Id3表达对细胞增殖的抑制和致凋亡作用,重组MiRNA表达载体的构建及应用为研究Id3致A549细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用机制奠定了实验基础。     

WWOX基因在肺腺癌中表达及对A549细胞增殖和凋亡的影响

目的研究WWOX基因在肺腺癌组织的表达及在肺腺癌细胞系A549细胞增殖和凋亡的作用,探讨肺腺癌与临床病理特征之间的关系。方法应用免疫组化技术检测62例肺腺癌组织WWOX蛋白的表达;将携有WWOX基因的表达载体转染肺腺癌细胞系A549细胞,用Western blot法检测A549细胞WWOX蛋白的表达情况;运用细胞计数法检测细胞的增殖情况;流式细胞仪观察其对A549细胞凋亡的影响。结果肺腺癌组中WWOX的阳性表达率为45.2%,明显低于癌旁正常组织(82.9%,=0.000)。WWOX在肺腺癌的表达与分化程度(=0.023)、TNM分期(=0.007)、远处转移有关(=0.009),与患者的性别、年龄以及肿瘤的大小无关(0.05)。A549细胞转染WWOX基因后,WWOX蛋白表达明显高于空载质粒组及未转染组(未检测到WWOX蛋白的表达);生长曲线可见pcDNA3.0-WWOX转染组的A549细胞的增殖速度比pcDNA3.0组和未转染组明显下降;流式细胞仪分析表明pcDNA3.0-WWOX转染组的凋亡率明显高于pcDNA3.0空载体组。结论 WWOX的表达能够抑制肿瘤细胞的增殖,促进其凋亡。     

靶向沉默Ku80增强顺铂诱导的人肺腺癌细胞凋亡

目的:观察沉默Ku80能否增强顺铂诱导的人肺腺癌耐药细胞的细胞凋亡。方法:首先采用RT-PCR、Westernblot方法比较Ku80在人肺腺癌亲代(A549)与耐药细胞系(A549/DDP)的表达水平;将Ku80siRNA及si-Scramble转染至A549/DDP细胞后,加药组转染后48小时加顺铂作用24小时;应用MTT法检测顺铂对各组细胞的抑制率,采用流式细胞仪检测凋亡率,Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3活化程度。结果:Ku80 mRNA、蛋白在A549/DDP表达水平显著高于其亲代A549;si-Ku80组A549/DDP细胞的Ku80的mRNA、蛋白表达水平下调;顺铂对si-Ku80组细胞的抑制率明显高于si-Scram-ble组与Control组;在6μg/ml顺铂作用24小时后,si-Ku80组细胞凋亡率及Caspase-3活化程度高于si-Scramble组和Control组(P<0.05)。结论:靶向Ku80siRNA导入人肺腺癌耐药细胞特异性下调Ku80的表达,增强顺铂诱导的人肺腺癌耐药细胞凋亡作用。     

集缩素NCAPG对非小细胞肺癌增殖和凋亡的影响及其可能机制

目的 探讨非小细胞肺癌细胞中集缩素NCAPG表达对A549与H1299细胞增殖、凋亡的影响及其机制.方法 构建shRNA-NCAPG慢病毒载体转染A549及NCI-H1299细胞,实时定量PCR法(qRT-PCR)及免疫印迹法(Western blot)验证两种细胞中NCAPG表达情况.应用CCK-8方法检测对照组及下调组的细胞增殖差异,明确NCAPG表达对细胞增殖的抑制作用.Annexin V/PI双染法流式细胞术检测两组细胞中早期凋亡及晚期凋亡细胞比例.Western blot法比较两组细胞中Caspase-3、Bax及Bcl-2的表达水平.结果 shRNA-NCAPG转染组细胞的NCAPG表达量低于对照组.下调NCAPG表达抑制A549及NCI-H1299细胞增殖,增加早期凋亡及晚期细胞凋亡比例,增加肺癌细胞促凋亡相关蛋白Caspase-3及Bax的表达、抑制Bcl-2蛋白表达.结论 下调NCAPG表达诱导非小细胞肺癌A549及H1299细胞增殖,通过线粒体通路抑制其细胞凋亡.     

PKCα siRNAs有效序列的筛选及其对肺癌A549细胞的作用

目的 探讨人蛋白激酶 Cα（PKCα）小干扰RNA(siRNA)对肺癌A549细胞生长增殖及凋亡的影响。方法 设计并化学合成6条PKCαsiRNAs,转染A549细胞，通过改良MTT法及RT-PCR筛选;对3条效果较好的PKCαsiRNAs,进一步采用克隆形成抑制实验，Hoechst33258染色，PI单染和AnnexinⅤ/PI双染以及Western blot 检测。结果 6条PKCαsiRNAs均显著下调了PKCαmRNA水平，除No.5 siRNA外均显著地抑制了A549细胞增殖（P<0.05)。3条效果较好的PKCαsiRNAs转染组PKCα蛋白的表达显著下调，克隆形成抑制率，亚二倍体百分率和早期凋亡细胞比例均显著高于对照组（P<0.05)，并出现了核固缩、边聚和裂解等凋亡形态学变化。结论 本实验发现3条能显著抑制A549细胞增殖并诱导其凋亡的PKCαsiRNAs。     

雷公藤甲素对非小细胞肺癌细胞系A549增殖的抑制和凋亡的诱导

目的探讨雷公藤甲素(TP)通过调控趋化因子受体4(CXCR4)基因表达对人非小细胞肺癌(A549)细胞增殖和凋亡的影响。方法实验分为4组:对照组、TP组(100 nm/L TP处理细胞)、CXCR4+TP组(转染质粒及TP处理细胞)和NC+TP组(转染空载质粒及TP处理细胞)。RT-qPCR和Western blot检测CXCR4表达以及转染效果;MTT法检测细胞增殖;AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡;Western blot检测增殖及凋亡相关蛋白表达。结果雷公藤甲素能够抑制A549细胞中CXCR4 mRNA和蛋白的表达(P<0. 05)。雷公藤甲素可抑制A549细胞增殖,诱导其凋亡(P<0. 05)。转染pc DNA-CXCR4能够上调CXCR4 mRNA和蛋白的表达(P<0. 05)。上调CXCR4的表达能够部分逆转雷公藤甲素对A549细胞增殖抑制和凋亡诱导的作用(P<0. 05)。结论雷公藤甲素可能通过下调CXCR4的表达抑制A549细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

鸟氨酸脱羧酶抗酶-1过表达促进非小细胞肺癌细胞系A549凋亡

目的探讨上调鸟氨酸脱羧酶(ODC)抗酶-1(AZ-1)对非小细胞肺癌细胞系A549多胺代谢酶表达和细胞凋亡的影响。方法制备靶向提高人源性AZ-1表达的pcDNA3.1-HOAZ-1质粒,用其与空载质粒pcDNA3.1(-)分别转染A549细胞,并设立未经任何处理的空白对照组,48 h后分别收集总RNA和蛋白质,通过反转录聚合酶链反应和蛋白质印记分析分别检测AZ-1、ODC和鸟氨酸脱羧酶抗酶抑制剂-1(AZIN-1)的表达;同样的处理条件下应用流式细胞计量术检测细胞凋亡。结果在转染pcDNA3.1-HOAZ-1质粒后,ODC表达被明显抑制,AZIN-1的表达调节不明显;过表达AZ-1引起细胞凋亡增加(P0.05)。结论过表达AZ-1能抑制ODC表达和促进A549细胞凋亡。     

STAT3siRNA对肺腺癌A549细胞STAT3表达和细胞生物学行为的影响

目的:观察经RNA干扰沉默STAT3基因对人肺腺癌细胞A549生长和凋亡的影响。方法:设计并经化学合成了针对STAT3基因不同位点的3条小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)序列(STAT3siRNA1、STAT3siRNA2、STAT3siRNA3),在脂质体(LipofectamineTM2000)介导下转染人肺腺癌细胞株A549,采用RT-PCR法检测STAT3mRNA表达变化,筛选出抑制作用最强的STAT3-siRNA。免疫印迹法检测细胞STAT3、Cyclin D1、BAX、Bcl-2、Caspase-9蛋白表达。AM-BLUE法测定A549细胞体外增殖情况。流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:经RNA干扰能有效降低A549细胞STAT3mRNA表达水平(P0.05),转染STAT3siRNA后,A549细胞STAT3、Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表达水平均显著降低(P0.05),而BAX、Caspase-9蛋白的表达水平升高(P0.05)。STAT3蛋白表达分别与CyclinD1、Bcl-2蛋白表达呈正相关(r=0.854,0.910,P0.05);与BAX蛋白表达呈负相关性(r=-0.848,P0.05);与Caspase-9蛋白表达呈无相关性(r=-0.787,P0.05)。RNA干扰法沉默STAT3基因表达后,A549细胞增殖受到明显抑制,细胞凋亡率明显增加。结论:STAT3siRNA可有效抑制A549细胞STAT3表达,抑制A549细胞生长并促进其凋亡。     

LKB1基因转染对人肺腺癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨外源性LKB1基因表达对人肺腺癌细胞生物学行为的影响。方法:应用巢式PCR方法扩增LKB1基因编码区,利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA-LKB1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别导入A549细胞,经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆,Western blot检测LKB1和STAT3在A549细胞中的表达变化。通过绘制生长曲线和克隆形成试验检测获得性表达LKB1基因后肺癌细胞的增殖变化,流式细胞术(FCM)分析其细胞周期及其凋亡的变化。结果:成功获得了稳定表达外源性LKB1基因的A549细胞系,与转染空白载体组比较,转染LKB1基因的细胞生长速度明显减慢,细胞周期中G1/G0期比例明显增加,S期比例减少,细胞凋亡率升高;同时STAT3蛋白的磷酸化水平明显降低。结论:LKB1可能通过下调STAT3蛋白磷酸化水平的表达从而抑制A549细胞的恶性生物学行为。     

反义Bmi-1 RNA转染对人肺癌细胞株A549体外增殖的影响

目的 研究转染反义Bmi-1 RNA对人肺腺癌细胞A549的体外增殖及细胞周期和凋亡的影响.方法 将表达反义Bmi-1 RNA的真核表达载体稳定转染A549细胞株,GA18筛选挑取阳性克隆.应用即时荧光定量RT-PCR及Western blot检测转染后Bmi-1基因在mRNA水平及蛋白水平的表达;应用MTT比色法及平板克隆形成实验检测A549细胞体外生长能力;用PI单染及Annexin-V-PI双染技术在流式细胞仪上检测细胞周期及凋亡情况.结果 Western blot结果显示转染反义Bmi-1RNA使A549细胞中Bmi-1蛋白表达量减少了95%;MTT检测细胞生长曲线表明反义Bmi-1 RNA使A549细胞生长速度明显减慢;平板克隆形成实验结果显示转染反义Bmi-1 RNA的A549细胞在平板中形成集落的数目(0.67±0.50)明显低于未转染组(73.0±4.1)及转染空质粒组(67.0±4.0,P<0.01);流式细胞仪结果显示反义Bmi-1使A549细胞阻滞在G_0/G_1期,但对细胞凋亡没有影响.结论 反义Bmi-1 RNA在体外对A549细胞增殖有明显的抑制作用,其抑制作用是通过使A549细胞阻滞在G0/G1期实现的.     

ING4基因真核表达载体的构建及其功能

目的：构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,观察ING4基因对人肝癌SMMC7721细胞周期及凋亡的影响。方法：小鼠肝组织经RT-PCR扩增,构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,分别用双酶切、PCR、基因测序进行鉴定,将其转导进入人肝癌SMMC7721细胞,检测ING4基因的表达情况及其对细胞周期的影响,应用荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况。结果：RT-PCR产物为约750bp的条带,基因测序正确,转导进入人肝癌细胞株SMMC7721后可延长G2期,其凋亡率（23.66％）明显高于对照组（13.75％）。结论：成功分离得到了小鼠ING4基因并成功构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4,该质粒转染人肝癌SMMC7721细胞后可延长G2期并可促使细胞凋亡。     

HIV-1 Vpr对细胞周期的影响和致凋亡作用的研究

目的 研究人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的vpr基因和不同变异株对宿主细胞周期和凋亡的影响,以及其致细胞周期变化和致细胞凋亡机制的两者间的可能关系.方法 将14个带有不同变异位点的中国感染者HIV-1 upr片段分别连入pcDNA3.1(+)真核表达载体,构建重组质粒.将这些重组质粒电转染Jurkat细胞,并设立保守株vpr基因转染细胞、突变株vpr-Fs基因转染细胞、空载体转染细胞和未转染细胞作为对照.经G418选择培养及RT-PCR检测目的基因转染成功后,PI染色,流式细胞仪检测被转染细胞的细胞周期分布和细胞凋亡.结果 流式细胞仪检测上述14个带有不同变异位点的HIV-1 vpr基因片段的Jurkat细胞,发现转染保守片段HIV-1 vpr的Jurkat细胞,其细胞周期出现G_2期阻滞和细胞凋亡率明显升高,但转染vpr C端截断的vpr-Fs片段的细胞、空载体peDNA3.1(+)转染细胞和未转染的Jurkat细胞无此现象.转染了,HIV-1 vpr基因序列相对应的Vpr蛋白中含有70V、85P、86G、94G突变的片段,较vpr保守片段其致感染细胞G_2期阻滞和凋亡的能力明显下降,且Vpr蛋白的AE亚型致细胞周期阻滞和致凋亡能力较其他亚型普遍为低.初步发现vpr诱导G2期阻滞百分比越高其所致凋亡率越高.结论 HIV-I vpr基因有明显的致感染细胞G_2周期阻滞和致细胞凋亡的作用,但vpr C端截断的vpr-Fs片段无此功能.首次发现中国感染者HIV-1 vpr基因表达蛋白的70V、85P、86G、94G位点突变能使其致感染细胞G_2期阻滞和凋亡的能力下降,Vpr的AE亚型致细胞周期阻滞和凋亡能力较其他亚型普遍为低.对14个变异片段的分析显示vpr诱导G_2期阻滞的程度与其致凋亡水平可能相关,提示两者的发生机制可能有一定的关联.本研究为进一步探讨HIV-1致病机制和探索可能的基因干预措施打下基础.     

CDK1 siRNA干扰在Taxol诱导细胞凋亡中的作用

目的 研究转染细胞周期依赖性蛋白激酶1(cyclin-dependent kinase 1,CDK1)siRNA、以及转染后进行凋亡刺激对细胞周期和凋亡的影响,探讨CDK1在细胞凋亡中的确切作用,揭示细胞周期与细胞凋亡协调的分子机制.方法 以人宫颈癌细胞株HeLa细胞为研究对象,脂质体转染CDK1 siRNA,转染后48 h加紫杉醇(Taxol) (20 μg/ml)刺激凋亡,Western印迹检测CDK1和抗凋亡蛋白BCL2表达,AnnexinV/PI法检测细胞的凋亡,流式细胞仪分析DNA含量检测细胞周期.结果 转染CDK1 siRNA后,CDK1蛋白的表达下降,细胞周期G2/M期比例增加,细胞凋亡率与对照相比没有明显升高.只加Taxol刺激12 h后细胞凋亡率增加并伴有S期和G2/M期比例增加. 转染CDK1 siRNA后再用Taxol刺激,其细胞凋亡率没有明显改变,G2/M期阻滞效应也没有叠加.BCL2蛋白只在加Taxol刺激组表达下降,与CDK1表达减少没有相关性.结论 siRNA沉默导致的CDK1表达降低只导致细胞周期G2/M期阻滞,没有引起细胞凋亡;CDK1的表达降低对紫杉醇所诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡效应没有明显影响.     

Survivin-2B诱导人乳腺癌细胞凋亡的初步研究*

 目的：探讨存活蛋白2B (survivin-2B)在诱导肿瘤细胞凋亡中的分子机制。方法：将survivin-2B基因插入真核表达载体pCDNA3.1,得到重组载体pCDNA3.1-survivin-2B。将空载体pCDNA3.1及重组载体pCDNA3.1-survivin-2B分别转染人乳腺癌细胞株MCF7,转染后48 h,用annexin V/7-AAD染色法分析细胞凋亡情况,利用碘化丙啶染色法分析转染对细胞周期的影响;同时提取总RNA并反转录成cDNA,进行多重聚合酶链反应。利用GeXP多基因表达分析系统检测21个与肿瘤相关基因的表达情况。结果：过表达survivin-2B基因导致MCF7细胞凋亡与细胞周期阻滞,并引起8个基因表达上调,2个基因表达下调。变化最大的为醛脱氢酶4家族成员A1（ALDH4A1）,表达下降48%;变化最小的为胞质分裂调控蛋白1（PRC1）,上调1.08倍。结论：Survivin-2B能够诱导细胞凋亡与细胞周期G2/M期阻滞,并引起部分肿瘤相关基因的表达变化。     

Hsp701A的RNA干涉诱导K562细胞凋亡

目的：研究RNA干涉（RNAi）Hsp701A基因的表达及其诱导慢性粒细胞白血病（慢粒）细胞株K562的凋亡。方法：构建Hsp701A基因小干涉RNA（siRNA）的真核表达载体，转染K562细胞并证实RNAi的有效性。用MTF比色法、AnnexinV-FITC／PI染色和流式细胞术，分别检测K562细胞的增殖、凋亡和细胞周期。结果：构建了Hsp701A siRNA的真核表达载体。将其稳定转染K562细胞后，RNAi组细胞中Hsp701 ARNA和蛋白的表达水平明显下降。Hsp701A siRNA能抑制K562细胞增殖并诱导其细胞凋亡，将其阻滞于G1期。结论：RNAi Hsp701A基因诱导的表达有望成为一种新的慢粒的治疗策略。     

曲古柳菌素A对肺癌A549细胞凋亡的影响

目的:检测不同浓度的组蛋白去乙酰化酶抑制剂古曲柳菌素A(TSA)对A549细胞周期及细胞凋亡的影响,探讨TSA抑制A549肺癌细胞的分子机制.方法:以流式细胞术分析,Annexin V/PI 法,免疫印迹研究 TSA 对A549 细胞的细胞周期、凋亡及Bax蛋白水平变化的影响.结果:TSA处理后,100nmol/L和400nmol/L引起细胞G0/G1及G2/M期阻滞.Annexin V/PI法显示TSA可诱导细胞凋亡.Bax蛋白的表达随着TSA浓度的增高而增强.结论:不同浓度的TSA对A549细胞周期阻滞影响不同,低浓度可诱导细胞凋亡.