pcDNA3.1-preS1-GFP重组质粒构建及其小鼠精子表达

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与乙型肝炎病毒（HBV）preS1基因的重组真核表达载体并观察其在小鼠精子内的表达。方法采用PCR方法 ,以HBV全基因组质粒为模板扩增HBVpreS1基因片段,利用DNA重组技术将其定向插入到含有GFP的真核表达载体pcDNA3.1-GFP,经酶切及测序鉴定后,用脂质体介导法转染小鼠精子,在荧光显微镜下观察并应用PCR技术检测HBVpreS1基因的存在与表达情况。结果成功构建了pcDNA3.1-preS1-GFP真核表达载体,将其转染小鼠精子后,在荧光显微镜下观察到转染精子头部有绿色荧光,PCR扩增得到位于HBVpreS1基因区域内长约589bp的片段。结论重组质粒pcDNA3.1-preS1-GFP的成功建立及其在小鼠精子内的表达,为建立新的HBVDNA垂直传递的小鼠模型奠定了实验基础。     

Cx43和GFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的构建间隙连接蛋白43（Cx43）和绿色荧光蛋白（GFP）双基因共表达重组腺病毒载体。方法利用PCR方法从真核表达载体pcDNA3.0-Cx43扩增Cx43片断,利用DNA重组技术,将目的基因Cx43克隆至含有报告基因GFP的穿梭质粒pAdTrack-CMV,然后在BJ5183细胞中将重组穿梭质粒pAdTrack-Cx43与pAdeasy-l质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体pAd-Cx43-GFP,用PacⅠ单酶切鉴定重组载体;将pAd-Cx43-GFP转入293细胞中包装,荧光显微镜观察报告基因GFP的表达,Western blot方法检测293细胞中Cx43表达。结果（1）通过PCR方法从载体pcDNA3.0-Cx43扩增出单一条带,与Cx43片断大小相符;（2）重组穿梭质粒pAdTrack-Cx43经NotⅠ/XhoⅠ双酶切后,电泳可见2个大小约为9、1kb条带,证明pAdTrack-Cx43构建成功;（3）同源重组产物pAd-Cx43-GFP经PacⅠ酶切后,电泳可观察到2个大小约为31、4kb左右条带,与预期结果相符,提示同源重组成功;（4）荧光显微镜下观察可见转染pAd-Cx43-GFP后293细胞在培养1-2d即有绿色荧光表达;（5）利用WesternBlot法检测到转染pAd-Cx43-GFP后293细胞中Cx43的表达较未转染组增强。结论Ad-Cx43-GFP重组腺病毒载体构建成功。     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI基因真核表达载体的构建及表达

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori)尿素通道蛋白编码基因(ureI)的真核表达重组载体,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的研制奠定基础。方法以H.pyloriSS1株基因组为模板,PCR扩增ureI目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;通过酶切、PCR及测序鉴定,筛选阳性重组载体;脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,Western blot检测其在HeLa细胞中的表达。结果以H.pyloriSS1株基因组DNA为模板扩增出特异的ureI基因片段,大小约585 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论成功构建了真核重组载体pcDNA3.1(+)/ureI,并能在HeLa细胞中表达。     

人HSP 40基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建人热休克蛋白40(HSP40)的2种同源物HDJ-1和HDJ-2基因真核表达载体,观察其在人成神经细胞瘤细胞株(SK-N-SH)中的表达.方法 从流产胚胎脑组织中抽提总RNA,RT-PCR扩增HDJ-1和HDJ-2 cDNA,经限制性内切酶双酶切后,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)和pEGFP-N1质粒中.HDJ-1和HDJ-2基因测序结果与基因库登录序列比对,序列正确的重组质粒用脂质体转染SK-N-SH细胞, Western blot和荧光显微镜观察基因表达情况.结果 HDJ-1和HDJ-2基因测序结果与基因库登录序列比对显示完全一致.Western blot证实pcDNA3.1(+)/HDJ-1转染SK-N-SH细胞24 h后有HDJ-1的过表达,至少持续72 h;pEGFP-N1/HDJ-1和pEGFP-N1/HDJ-2转染的细胞有HDJ-1/GFP和HDJ-2/GFP融合蛋白的表达,至少持续72 h.荧光显微镜观察到pEGFP-N1/HDJ-1和pEGFP-N1/HDJ-2转染的细胞中有绿色荧光蛋白的表达.结论 本实验成功构建pcDNA3.1(+)/HDJ-1、pEGFP-N1/HDJ-1和pEGFP-N1/HDJ-2真核表达质粒,并在SK-N-SH细胞中表达.     

真核表达载体pcDNA6/myc-hisB-GFP的构建

目的 构建带绿色荧光蛋白(GFP)的pcDNA6/myc-hisB的真核表达载体. 方法 采用亚克隆的技术扩增得到GFP的开放阅读框序列,Hind Ⅲ和Kpn Ⅰ双酶切后插入pcDNA6/myc-hisB,重组体经质粒PCR和酶切鉴定,并转染HEK 293T细胞后观察绿色荧光的表达,同时经Western blot检测GFP和标签蛋白myc的表达. 结果 PCR扩增得到特异的GFP开放阅读框序列,质粒PCR和酶切鉴定显示pcDNA6/myc-hisB-GFP构建成功,细胞转染结果 表明重组体可以表达GFP和myc蛋白.结论 获得带有绿色荧光蛋白的pcDNA6/myc-hisB-GFP的真核表达载体,为此载体的应用拓展了更大的空间.     

小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1的构建及表达

目的:通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1,并检测其在CHO细胞中的表达。方法:通过PCR扩增FGFR1的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体包裹转染CHO细胞,Western blot检测FGFR1目的蛋白的表达。结果:经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染CHO细胞后可表达FGFR1目的蛋白。结论:成功构建的pcDNA3.1(+)-FGFR1重组质粒能在体外表达FGFR1目的蛋白。     

Smad2/3/4真核表达质粒的构建及重组蛋白表达

目的:构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内表达。方法:以pcDNA3.1-Smad2/3和pGEX2T-Smad4质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Smad2/3/4全长编码基因,亚克隆至含有pcDNA3.1myc-HisA 标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293 中,提取细胞蛋白进行 Western blotting 检测。结果：Smad2/3/4 全长基因序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1myc-HisA中,酶切鉴定片段为1 401、1 275和1 656 bp。Western blotting检测到融合蛋白pcDNA3.1myc-HisA- Smad2/3/4的表达。结论:成功构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,同时鉴定其融合蛋白的表达。     

uPA和PAI-1基因克隆及真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆人卵巢上皮癌组织uPA和PAI-1基因cDNA全长,构建表达uPA和PAI-1基因的真核表达载体。方法：采用RT-PCR技术从人卵巢上皮癌组织总RNA中逆转录uPA和PAI-1基因的cDNA全长,克隆到pGEM-TEasy Vector上,通过酶切和测序进行鉴定;酶切后与真核表达载体pcDNA3.1/myc-his（-）B连接,酶切及测序再次鉴定;采用脂质体法将重组质粒DNA转染至卵巢癌上皮细胞SKOV3细胞;采用有限稀释法和G418分别加压筛选并培养SKOV3-uPA和SKOV3-PAI-1细胞及对照细胞;Western blot法检测转染前后SKOV3细胞uPA和PAI-1基因的表达。结果：成功扩增出uPA和PAI-1基因的cDNA的全长,并克隆入T载体,DNA测序证实序列正确,通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3.1-uPA和pcDNA3.1-PAI-1,Western blot能检测到uPA和PAI-1基因蛋白分别在SKOV3-uPA和SKOV3-PAI-1细胞中的表达。结论：成功构建了uPA和PAI-1表达基因的真核表达载体,为进一步研究uPA和PAI-1基因在卵巢癌侵袭转移中的作用提供了实验基础。     

HO-1基因真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1的构建及表达

目的:构建人HO-1真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1并检测其表达。方法:利用分子生物学技术,将hHO-1基因与质粒pcDNA3.1连接,构成重组质粒并用RT-PCR及Western blotting方法检测重组载体在Eca-9706细胞中的表达情况,最终确定重组载体是否构建成功。结果:用HindⅢ和BamHⅠ双酶切,RT-PCR检测,Western blotting检测证明hHO-1成功克隆入表达载体pcDNA3.1中。结论:本部分实验成功构建了能够在细胞内大量表达HO-1基因产物的真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1,为进一步实验奠定基础。     

SIRPα-GFP真核表达载体构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的：构建信号调节蛋白α-绿色荧光蛋白（SIRPα-GFP）真核表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达SIRPα-GFP融合蛋白的细胞系,研究SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞的膜定位。方法：将SIRPα质粒和带有GFP的表达载体分别用限制性内切酶MluⅠ和SgfⅠ进行双酶切,将SIRPα基因克隆到pLenti-GFP载体中,构建pLenti-SIRPα-GFP质粒;将pLenti-SIRPα-GFP质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对重组质粒pLenti-SIRPα-GFP进行DNA测序;采用Lipofectamine 3000转染试剂将pLenti-SIRPα-GFP质粒转染到HEK293T细胞中,通过荧光显微镜观察SIRPα-GFP在稳定转染HEK293T细胞中的表达,采用Western blotting法检测HEK293T细胞中SIRPα-GFP融合蛋白的表达。结果：酶切鉴定和DNA测序,重组质粒pLenti-SIRPα-GFP构建成功。荧光显微镜检测,SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞膜上表达。Western blotting法检测,SIRPα蛋白在pLenti-SIRPα-GFP质粒转染的HEK293T细胞中成功表达。结论：成功构建了pLenti-SIRPα-GFP质粒。通过在HEK293T细胞中转染pLenti-SIRPα-GFP质粒,成功制备了稳定表达SIRPα-GFP的细胞系。SIRPα-GFP蛋白定位于HEK293T细胞的细胞膜上。     

重组人半乳糖苷结合凝集素-9质粒的构建及表达

目的构建人半乳糖苷结合凝集素-9(Galectin-9)的真核表达质粒pGalectin-9,并检测其表达。方法通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆Galectin-9基因,插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pGalectin-9瞬时转染中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary,CHO)细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法检测Galectin-9的表达。结果 DNA测序和酶切鉴定证明Galectin-9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点;以重组质粒pGalectin-9瞬时转染CHO细胞,通过Western blot、RT-PCR和间接免疫荧光方法,在分子和细胞水平证实Galectin-9的表达。结论成功构建pGa-lectin-9的重组质粒,并证实其在CHO细胞中可以成功表达。     

人脑组织中STUB1基因的克隆构建及表达

目的 构建人STUB1基因全长cDNA的真核表达载体DNA3.1-STUB1.观察STUB1基因在人脑胶质瘤细胞(U251细胞)中的表达.方法 RT-PCR技术扩增获得人脑组织STUB1基因全长cDNA,将扩增的产物进行TA克隆,经酶切、DNA测序鉴定正确,将STUB1基因酶切后构成pcDNA3.1-STUB1的真核表达重组质粒.用脂质体将重组质粒转染入U251胶质瘤细胞系,48h以后通过Western blotting实验观察重组质粒的表达情况.结果 RT-PCR扩增获得人脑组织中STUB1 cDNA全长912bp,构建完成真核表达重组质粒pcDNA3.1-STUB1,经DNA测序与GenBank中的人STUB1 cDNA序列一致.经neomycin(neo)筛选获得稳定表达重组质粒的单克隆细胞株后,经过Western blotting显示转染重组质粒的细胞中有高水平的STUB1基因表达.结论 成功构建了pcDNA3.1-STUB1真核表达质粒,并发现其在U251细胞中过量表达,为进一步研究STUB1基因在胶质瘤发生发展中的作用奠定了基础.     

单纯疱疹病毒2型感染细胞蛋白27重组真核表达质粒的构建及表达

目的构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)感染细胞蛋白27(ICP27)基因与pcDNA3.1(+)真核表达质粒的重组质粒pcDNA3.1(+)/ICP27。方法通过RT-PCR方法从HSV-2培养物中提取RNA制备ICP27的编码基因UL54DNA,将其与载体pcDNA3.1(+)连接。通过双酶切和测序鉴定重组质粒是否构建成功,Western blot法鉴定重组质粒在真核细胞COS-7中表达。结果重组质粒pcDNA3.1(+)/ICP27构建成功,可在COS-7中表达。结论成功构建了可在真核细胞内表达的pcDNA3.1(+)/ICP27重组质粒,为下一步研究该重组质粒作为DNA疫苗的免疫学效应奠定了基础。     

lefty1基因真核表达载体构建鉴定及转染

目的:构建lefty1基因与pcDNA3.1(+)相融合的真核表达载体,并在lefty1基因的下游加上Flag标签,转染人肾小管上皮细胞株验证重组质粒活性。方法:设计并合成lefty1基因上下游引物,同时加上Flag标签序列,PCR扩增基因,并将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,双酶切图谱分析和扩增产物测序鉴定所构建的真核表达载体。脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.1(+)-lefty1-Flag和pcDNA3.1(+)分别转染至人肾小管上皮细胞株HK-2,qPCR和Western blot检测lefty1在mRNA和蛋白水平的表达。结果:以lefty1基因质粒模板扩增得到的片段约1 150bp,双酶切得到目的基因片段,测序的结果显示与lefty1基因序列相同。转染肾小管上皮细胞后,pcDNA3.1(+)-lefty1-Flag能表达lefty1蛋白。结论:成功构建lefty1基因真核表达载体,为一步研究lefty1基因功能奠定了基础。     

pcDNA3.1(-)/UBE2C质粒在Chang Liver细胞中的表达和鉴定

[摘要] 目的 构建pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒并建立人正常肝细胞Chang Liver的稳定表达株。方法 采用RT-PCR法从HepG2细胞中克隆得到UBE2C cDNA全长序列, 将之与pMD18-T载体连接。双酶切和测序鉴定后,再将UBE2C片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)。构建好的pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒经双酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将其转入Chang Liver细胞株中,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再用Western blot法检测转染后UBE2C的蛋白表达水平。结果 pcDNA3.1(-)/UBE2C质粒经双酶切鉴定和DNA测序证实,目的基因UBE2C的序列完全正确,真核表达质粒成功构建。Western blot检测显示,转pcDNA3.1(-)/UBE2C组UBE2C的蛋白表达水平高于转pcDNA3.1(-)组,具有统计学意义（P﹥0.01）。结论 成功构建UBE2C基因的真核表达质粒并建立其稳定表达的Chang Liver细胞株,为下一步研究奠定基础。     

人同源盒基因NKX3.1cDNA真核表达载体的构建及表达

目的：构建人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体,研究其在前列腺癌细胞PC 3、LNCaP中的表达情况。方法：以人前列腺癌细胞LNCaP细胞中的总RNA为模板,RT PCR扩增NKX3.1基因全长编码片段,T/A克隆至pCR2.1载体中。经酶切、测序鉴定后,将NKX3.1cDNA重组到真核表达载体pcDNA3.1（+）中。将pcDNA3.1 NKX3.1表达载体瞬时转染前列腺癌细胞PC 3和LNCaP 细胞,RT PCR和Western blot法检测NKX3.1cDNA在转录水平和蛋白水平的表达。结果：人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1经酶切及测序鉴定正确。 pcDNA3.1 NKX3.1转染PC 3和LNCaP细胞后,经RT PCR和Western blot证明在mRNA和蛋白水平均能有效表达NKX3.1。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1, 转染前列腺癌细胞PC 3和LNCaP后能有效表达。     

人APE1/Ref-1基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的 构建含人APE1/Ref-1基因全长cDNA片段的真核表达质粒pcDNA3.1 APE1,以期进一步研究该基因对细胞DNA损伤的保护作用.方法 采用RT-PCR法定向克隆人APE1/Ref-1基因全长cDNA片段,构建pGM-T Easy/APE1质粒,测序鉴定APE1/Ref-1基因cDNA序列正确后,将目的片断亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1 上,构成pcDNA3.1 APE1表达质粒,并用Western blotting法检测转染人脐静脉内皮细胞APE1/Ref-1蛋白的表达水平.结果 经酶切及测序证实APE1/Ref-1基因真核表达质粒pcDNA3.1 APE1构建成功,Western blotting法检测到转染pcDNA3.1 APE1后,细胞内APE1/Ref-1蛋白表达明显增加.结论 成功构建含人APE1/Ref-1基因全长cDNA片段的真核表达质粒,为探讨APE1/Ref-1对细胞电离辐射损伤的保护作用奠定了基础.     

溃疡性结肠炎大鼠iNOS真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的:构建溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)大鼠结肠组织中i NOS基因的真核表达载体,并表达于COS-7细胞,以便进一步研究i NOS在UC发病机制中的作用。方法:从溃疡性结肠炎大鼠结肠组织提取总RNA,经逆转录获得cDNA,以PCR方法克隆i NOS的基因片段,并对其序列进行测定。将测序正确的i NOS编码序列插入pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO中,构建真核表达载体;采用脂质体法转染COS-7细胞,用倒置荧光显微镜和Western blot的方法观察绿色荧光蛋白(Greenfluorescence protein,GFP)的表达。结果:PCR方法扩增出3598bp的基因片段,插入pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO构建真核表达载体后,经以质粒为模板的PCR扩增和测序鉴定表明,克隆出UC大鼠结肠组织i NOS的编码序列同GeneBank收录的序列一致。将重组体转染COS-7细胞后,倒置荧光显微镜观察到绿色荧光,Western blot检测表明细胞中可表达融合蛋白。结论:本研究成功构建了pcD-NA3.1/CT-GFP-TOPO-i NOS重组质粒,并能高效转染COS-7细胞,为下一步i NOS基因功能研究及其在UC发病机制中的研究奠定了基础。     

转录因子Kaiso真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建并鉴定转录因子Kaiso的表达质粒pEGFP-Kaiso.方法 采用PCR的方法扩增pCS2-Kaiso中人Kaiso的全长序列,克隆至载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-Kaiso,以酶切及基因测序方法鉴定重组质粒的准确性.利用LipofectamineTM 2000将重组质粒转染至肺癌细胞系A549,24h后荧光显微镜观察绿色荧光信号,48 h后Western blot鉴定Kaiso蛋白表达变化.结果 限制性双酶切及DNA测序分析结果显示插入的DNA片段长度约为2 022 bp,与预期Kaiso基因片段大小相同.转染pEGFP-Kaiso重组质粒后,荧光显微镜观察到明确的绿色荧光蛋白(GFP)的绿色荧光信号,Western blot证实转染pEGFP-Kaiso质粒后的Kaiso蛋白表达量显著上调(P＜0.05).结论 成功构建了人Kaiso基因真核表达载体,为深入研究Kaiso的生物学功能提供了有力的实验工具.