电穿孔转染酸性成纤维细胞生长因子基因对骨骼肌卫星细胞的影响

背景：课题组早期研究表明体外一定剂量酸性成纤维细胞生长因子对骨骼肌卫星细胞增殖有促进作用。目的：进一步验证电穿孔转染酸性成纤维细胞生长因子基因对骨骼肌卫星细胞生长、增殖及分化的影响。方法：原代培养、纯化骨骼肌卫星细胞,将带有酸性成纤维细胞生长因子基因的质粒pSectag-GFP-aFGF通过电转染的方法转染大鼠骨骼肌卫星细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况并计算转染率,以流式细胞仪分析转染后细胞周期,绘制细胞生长曲线,观察转染后肌管形成情况,Western Bloting检测酸性成纤维细胞生长因子基因的表达。结果与结论：①免疫细胞化学检测：骨骼肌肌动蛋白呈阳性表达。②转染效率：pSectag-aFGF 质粒电转染12 h后即可看见散在发绿色荧光的卫星细胞,72-96 h达高峰,阳性表达率约90%。③细胞周期检测：电转染后S期所占的百分比明显多于未转染对照组(P <0.05)。④细胞生长曲线检测：电转染细胞接种后第3天进入对数生长期,第5天后开始减少。⑤分化能力观察：电转染组肌管较未转染对照组明显减少,老化细胞较少。⑥Western-blot：酸性成纤维细胞生长因子基因在转染骨骼肌卫星细胞中表达。结果表明,通过电穿孔法可以将酸性成纤维细胞生长因子基因转染进骨骼肌卫星细胞并获得高效持久的表达,并有促进骨骼肌卫星细胞增殖及抑制分化为肌管的作用。     

联合诱导兔脂肪源性基质细胞的成肌潜能*☆

背景：成肌种子细胞是构建工程化成肌复合物的基础,如何优化其扩增是过渡到临床应用的核心。目的：分析将 MyoD、转化生长因子β1及5-氮杂胞苷不同模式下联合诱导兔脂肪源性基质细胞体外成肌潜能的变化。方法：取兔腹部脂肪,采用胶原酶消化法分离获取脂肪源性基质细胞,分别以不同方式进行成肌细胞诱导：5-氮杂胞苷诱导组;MyoD+转化生长因子β1诱导;5-氮杂胞苷+ MyoD+转化生长因子β1联合诱导组;并设空白对照。于诱导第1,4,8,12,16,20,24,28天观察细胞形态学特点,行 MTT 比色法、流式细胞仪和免疫组织化学检测鉴定细胞,检测Ⅲ型胶原含量。结果与结论：联合诱导组与其他组相比,细胞生长迅速,16 d 增殖达高峰,20 d 肌管数量增多,体积增大,排列规则,呈结蛋白强阳性表达,细胞周期显示联合诱导组脂肪源性基质细胞的 DNA 复制期细胞比例增加,间隙期细胞减少,Ⅲ型胶原含量明显增高,差异有显著性意义。结果提示,多因子联合5-氮杂胞苷模式能有效促进脂肪源性基质细胞向成肌细胞定向分化,细胞增殖显著,是成肌细胞体外诱导的理想方法。     

电穿孔介导外源性基因转染大鼠骨骼肌卫星细胞的可行性

目的:电穿孔的原理是应用短暂高压电脉冲使细胞膜形成纳米级的微孔,外源DNA通过这些微孔或者伴随微孔关闭时膜成分的再分布而直接进入细胞内.实验拟验证电穿孔法介导外源性基因转染大鼠骨骼肌卫星细胞的可行性和转染效率,以获得基因治疗自体移植的载体.方法:实验于2006-10/2007-09在暨南大学医学院中心实验室完成.①材料:清洁级1～3 d龄SD大鼠3只,购于广东省医学实验动物中心,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.基因转染过程应用的pEGFP-N1质粒由本课题组保存.②实验方法:大鼠颈椎脱臼处死,在无菌条件下分离四肢肌组织,剪碎成1 mm×1 mm×1 mm组织块,采用改良酶消化法分离骨骼肌卫星细胞,再以差速贴壁和非连续梯度离心法分两步进行纯化,细胞均匀增殖至培养面80%或局部增殖过度密集时胰酶消化传代.取第3代处于对数生长期的骨骼肌卫星细胞,消化离心后调整细胞数为2.0×107L-1,取400 μL注入4 mm电击杯中,再加入pEGFP-N1质粒15 μg混匀,将电击杯放入电转槽静置5 mim.电击条件为电容1050 μF,电压180 V,脉冲时间20 ms,脉冲数2次,脉冲间隔时间1 min,电击缓冲液为不含钙镁的磷酸盐缓冲液.放电后电击杯冰浴,并用不含血清的DMEM清洗,将清洗液转入培养瓶中,4h后换用体积分数为0.1胎牛血清的完全培养基,于37℃、体积分数为0.05的CO2无菌细胞培养箱中培养.同时设不加质粒的空白对照.③实验评估:倒置显微镜下观察细胞生长状况.免疫细胞化学检测肌动蛋白的表达.随机计数多个低倍视野,计算电穿孔pEGFP-N1质粒转染卫星细胞的效率.绘制细胞生长曲线,并用流式细胞仪测量细胞周期.结果:①骨骼肌卫星细胞的形态:原代培养48～72 h细胞完全贴壁,呈梭形或纺垂形,长轴平行排列,胞核圆形,核仁明显.5 d时细胞町伸出一个或数个突起.随培养时间的延长,卫星细胞连接成网状.当延迟分瓶或使用分化培养基,相邻的细胞会融合成肌管,继而形成串联,且能看见肌管的跳动.传代后细胞形态旱更加一致的梭形,6 h即完全贴壁,细胞增殖速度明显加快,生长更为旺盛.传至8代卫星细胞出现老化现象.②免疫细胞化学检测:骨骼肌肌动蛋白呈阳性表达.③转染效率:pEGFP-N1质粒电转染8 h后即可看见散存发绿色荧光的卫星细胞,48～72 h达高峰,阳性表达率约35%.④细胞生长曲线及细胞周期检测:电转染细胞接种后第3天进入对数生长期,第7天由于接触抑制导致增殖速度减慢,81.5%处于G0/G1期,19.3%处于S G2 M期.未转染细胞生长曲线、细胞周期均与其相似.结论:电穿孔法介导外源性基因表达于大鼠骨骼肌卫星细胞具有较高的转染效率,操作简便,重复性好,且对卫星细胞生物学行为无明显影响.     

Noxa基因转染乳腺癌MCF-7细胞后的体外实验研究

目的:探讨Noxa基因转染乳腺癌MCF-7细胞后对MCF-7细胞的影响.方法:利用脂质体将真核表达载体pIRES2-EGFP-Noxa瞬时转染至乳腺癌MCF-7细胞.通过RT-PCR检测转染后mRNA的表达情况.MTT比色法测定细胞增殖的抑制.Hoechst 33342检测细胞的凋亡情况.结果:Noxa基因转染后在乳腺癌MCF-7细胞中成功表达,其转染后24、48、72 h后mRNA表达量逐渐增高.Noxa基因的表达使得乳腺癌MCF-7细胞出现增殖抑制,其24、48、72 h抑制率之间的差异具有显著性(P＜0.05).Hoechst 33342染色显示Noxa基因转染后细胞出现凋亡,其24、48、72 h凋亡率与阴性对照组相比,差异具有显著性(P＜0.05).结论:Noxa基因特染乳腺癌MCF-7细胞后能够抑制细胞增殖并促进其凋亡.     

丹参及细胞因子对成纤维细胞增殖和细胞凋亡的影响

本文探讨了丹参注射液、人重组白细胞介互２（ＩＬ－２）和重组干扰素α－２ｂ（ＩＦＮ）对体外培养成纤维细胞增殖的作用。结果表明ＩＦＮ和ＩＬ－２均可促进成纤维细胞的增殖，发挥丝裂原作用。丹参则显著抑制细胞增殖活性，使成纤维细胞崩成圆形或块状结构，内含细胞器，线粒体和内质网变性，呈曲型的细胞凋亡改变，提示丹参通过抑制成纤维细胞增殖，促使细胞凋亡，发挥抗纤维化作用。     

新生小鼠骨骼肌卫星细胞在成肌过程中的形态学变化

背景:目前对于大鼠、恒河猴等骨骼肌卫星细胞的研究较多,但有关小鼠骨骼肌卫星细胞的研究报道较少。目的:观察体外培养的小鼠骨骼肌卫星细胞在成肌过程中的光电镜结构及免疫组织化学特性。设计:单一样本研究。单位:天津中医学院组织胚胎学教研室。材料:实验在北京大学基础医学院人体解剖学与组织胚胎学系唐军民导师研究室完成。新生5d昆明种小鼠5只,雌雄不限(购自北京大学医学部实验动物中心)。干预:分离新生小鼠骨骼肌卫星细胞,进行体外培养。在倒置显微镜下观察肌卫星细胞的成肌过程,并应用透射电镜及免疫细胞化学技术观察小鼠成肌细胞的超微结构及结构蛋白的分布。主要观察指标:①小鼠骨骼肌卫星细胞的分离纯化与原代培养的形态学观察。②免疫组织化学观察。结果:卫星细胞生长、分化良好,最终由单个核圆形细胞逐渐变化为多个核的长圆柱的肌管状细胞。免疫细胞化学技术显示,细胞呈α-肌动蛋白阳性。结论:采用两步消化法分离,得到的骨骼肌卫星细胞质量较好;且α-肌动蛋白对鉴定小鼠骨骼肌卫星细胞具有特异性。     

新生小鼠骨骼肌卫星细胞在成肌过程中的形态学变化

背景：目前对于大鼠、恒河猴等骨骼肌卫星细胞的研究较多，但有关小鼠骨骼肌卫星细胞的研究报道较少。目的：观察体外培养的小鼠骨骼肌卫星细胞在成肌过程中的光电镜结构及免疫组织化学特性。设计：单一样本研究。单位：天津中医学院组织胚胎学教研室。材料：实验在北京大学基础医学院人体解剖学与组织胚胎学系唐军民导师研究室完成。新生5d昆明种小鼠5只，雌雄不限(购自北京大学医学部实验动物中心)。干预：分离新生小鼠骨骼肌卫星细胞，进行体外培养。在倒置显微镜下观察肌卫星细胞的成肌过程，并应用透射电镜及免疫细胞化学技术观察小鼠成肌细胞的超微结构及结构蛋白的分布。主要观察指标：①小鼠骨骼肌卫星细胞的分离纯化与原代培养的形态学观察。②免疫组织化学观察。结果：卫星细胞生长、分化良好，最终由单个核圆形细胞逐渐变化为多个核的长圆柱的肌管状细胞。免疫细胞化学技术显示，细胞呈a一肌动蛋白阳性。结论：采用两步消化法分离，得到的骨骼肌卫星细胞质量较好；且a一肌动蛋白对鉴定小鼠骨骼肌卫星细胞具有特异性。     

人血管内皮细胞生长因子基因体外转染皮肤成纤维细胞后的表达效应

目的:观察外源性人血管内皮细胞生长因子基因导入正常真皮成纤维细胞后,能否表达及分泌血管内皮细胞生长因子,为进一步构建转VEGF165基因组织工程皮肤在创伤修复中的应用提供新移植物。方法:实验于2001-06/2005-06在长春吉林大学完成。①真核表达载体pcDNA3.0-hVEGF165的扩增、纯化和鉴定过程为大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备→pcDNA3.0-hVEGF165质粒DNA细菌转化→pcDNA3.0-hVEGF165质粒大量制备(碱裂解法)→质粒纯化→质粒含量纯度测定。提取的质粒载体用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定。②选取清洁级新生日本大耳白兔2只,无菌条件下取新生兔皮肤,尽量去除皮下组织,切成宽0.3cm小条块,Ⅰ型胶原酶消化,进行真皮成纤维细胞的分离与培养。脂质体介导真核表达质粒pcDNA3.0-hVEGF165转染体外培养的兔皮肤成纤维细胞,经G418筛选,获得阳性转染细胞克隆,并进行传代扩增。③酶联免疫吸附法检测转染后不同时间段的血管内皮细胞生长因子蛋白表达水平;原位杂交显示转基因细胞内VEGF165mRNA的表达情况;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况;透射电子显微镜观察转染后真皮成纤维细胞的超微结构。结果:①质粒酶切鉴定结果:提取的质粒经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后可得到5.4kb和0.57kb两个片段,与原质粒图谱符合,表明所提取的质粒为重组质粒pcDNA3.0-VEGF165。②pcDNA3-hVEGF165基因转染真皮成纤维细胞情况:共进行15次转染试验,35孔(皿)均有G418抗性集落形成,表明pcDNA3.0-hVEGF165经脂质体介导可有效转染正常皮肤成纤维细胞。③血管内皮细胞生长因子蛋白的表达:pcDNA3.0-hVEGF165转染成纤维细胞后,24h即有较高水平的血管内皮细胞生长因子蛋白表达,高达(3280±2054)ng/L,并于48,72h呈下降趋势。④血管内皮细胞生长因子cDNA原位杂交检测结果:转染后成纤维细胞可见散在的阳性细胞表达hVEGFmRNA。G418应用2～4周后,可成功筛选出转基因成纤维细胞克隆,筛选后可见大量阳性的转染细胞表达hVEGFmRNA。⑤成纤维细胞的细胞周期分布及凋亡检测:转染后成纤维细胞S期细胞比例增加,G1和G2期细胞减少,表明细胞DNA的合成以及细胞的增殖活动加强。但细胞凋亡率逐渐升高,转染前为1.26%,转染后2d为2.64%,至12代时高达17.35%。⑥转染后成纤维细胞超微结构观察:细胞表面有较多微绒毛,核呈不规则形,胞质内可见较多的粗面内质网、线粒体,沿膜可见一些膜包被颗粒。结论:真核表达质粒pcDNA3.0-hVEGF165成功导入家兔皮肤成纤维细胞,在短时期内可高水平地表达分泌血管内皮细胞生长因子,在治疗缺血性疾病和促进创伤修复及以其作为种子细胞构建转基因组织工程皮肤治疗皮肤缺损等方面显示出较好的应用前景。     

人血管内皮细胞生长因子基因体外转染皮肤成纤维细胞后的表达效应

目的：观察外源性人血管内皮细胞生长因子基因导人正常真皮成纤维细胞后，能否表达及分泌血管内皮细胞生长因子，为进一步构建转VEGF165基因组织工程皮肤在创伤修复中的应用提供新移植物。 方法：实验于2001—06／2005—06在长春吉林大学完成。①真核表达载体pcDNA3．0-hVEGF165的扩增、纯化和鉴定过程为大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备→pcDNA3．0-hVEGF165质粒DNA细菌转化→pcDNA3．0-hVEGF165质粒大量制备（碱裂解法）-质粒纯化-质粒含量纯度测定。提取的质粒载体用EeoRⅠ和xbaⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定。②选取清洁级新生日本大耳白兔2只，无菌条件下取新生兔皮肤，尽量去除皮下组织，切成宽0．3cm小条块，Ⅰ型胶原酶消化，进行真皮成纤维细胞的分离与培养。脂质体介导真核表达质粒pcDNA3．0-hVEGF165转染体外培养的兔皮肤成纤维细胞，经G418筛选，获得阳性转染细胞克隆，并进行传代扩增。③酶联免疫吸附法检测转染后不同时间段的血管内皮细胞生长因子蛋白表达水平；原位杂交显示转基因细胞内VEGF165 mRNA的表达情况；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况；透射电子显微镜观察转染后真皮成纤维细胞的超微结构。 结果：①质粒酶切鉴定结果：提取的质粒经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后可得到5．4kb和0．57kb两个片段，与原质粒图谱符合，表明所提取的质粒为重组质粒pcDNA3．0-VEGF165。②pcDNA3-hVEGF165基因转染真皮成纤维细胞情况：共进行15次转染试验，35孔（皿）均有G418抗性集落形成，表明pcDNA3．0-hVEGF165经脂质体介导可有效转染正常皮肤成纤维细胞。③血管内皮细胞生长因子蛋白的表达：pcDNA3．0-hVEGF165转染成纤维细胞后，24h即有较高水平的血管内皮细胞生长因子蛋、白表达，高达（3280&;#177;2054）ng／L，并于48，72h呈下降趋势。④血管内皮细胞生长因子cDNA原位杂交检测结果：转染后成纤维细胞可见散在的阳性细胞表达hVEGF mRNA。G418应用2-4周后，可成功筛选出转基因成纤维细胞克隆，筛选后可见大量阳性的转染细胞表达hVEG FmRNA。⑤成纤维细胞的细胞周期分布及凋亡检测：转染后成纤维细胞S期细胞比例增加，G1和G2期细胞减少，表明细胞DNA的合成以及细胞的增殖活动加强。但细胞凋亡率逐渐升高。转染前为1．26％，转染后2d为2．64％，至12代时高达17135％。⑥转染后成纤维细胞超微结构观察：细胞表面有较多微绒毛，核呈不规则形，胞质内可见较多的粗面内质网、线粒体，沿膜可见一些膜包被颗粒。 结论：真核表达质粒pcDNA3．0-hVEGF165成功导人家兔皮肤成纤维细胞，在短时期内可高水平地表达分泌血管内皮细胞生长因子，在治疗缺血性疾病和促进创伤修复及以其作为种子细胞构建转基因组织工程皮肤治疗皮肤缺损等方面显示出较好的应用前景。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染对人牙周韧带细胞的作用

背景:主要来源于因正畸或阻生拔除的健康牙培养而成的人牙周韧带细胞已成为牙周组织工程理想的种子细胞来源之一。目的:了解采用重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染对体外培养的人牙周韧带细胞增殖及细胞周期的影响。方法:体外培养人牙周韧带细胞,经重组腺相关病毒作为载体介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染,分为3组:对照组、空载病毒组、碱性成纤维细胞生长因子转染组。用RT-PCR,Western blot检测人牙周韧带细胞在转染前后碱性成纤维细胞生长因子基因和蛋白的表达。应用细胞生长曲线、四甲基偶氮唑蓝比色法观察细胞生长的优化作用;采用流式细胞术测定细胞周期分布的变化。结果与结论:对照组、空载病毒组未检测到碱性成纤维细胞生长因子mRNA和蛋白表达;碱性成纤维细胞生长因子转染组碱性成纤维细胞生长因子mRNA和蛋白水平均有表达,细胞的生长速度明显增快,细胞周期G0/G1期减少,S期细胞数增多。各组间比较差异有显著性意义(P<0.05)。     

卫星细胞与肌肉肥大关系及成肌因子的运动性调控

背景:卫星细胞是成体肌肉发生重要的"原料",它的增殖、分化和融合增加了肌纤维的细胞核数量或肌纤维数的数量,继而引起肌肉功能和形态学的变化,但是肌肉肥大是否一定有卫星细胞参与还存在争议.成肌因子是肌肉发生调节的核心因子,在肌肉发生的多个阶段发挥重要作用,但是目前对它们功能上特点和差异的了解仍然不够深入.目的:总结并讨论卫星细胞和成肌因子在肌肉发生和肌肉肥大以及在肌肉训练中的作用.方法:由第一作者用计算机检索中国期刊全文数据库(CNKI:2000/2010)和Medline(2000/2010)数据库,检索词分别为"骨骼肌,肥大,运动,肌肉发生,卫星细胞,成肌因子"和"skeletal muscle,hypertrophy,exercise,myogenesis,satellite cell,MRF",语言分别设定为中文和英文.从卫星细胞与肌肉肥大、成肌因子的作用及成肌因子的运动性调控特点2方面进行总结,对卫星细胞及成肌因子在肌肉发生中的作用及其调节机制和肌肉重塑等方面进行介绍.结果与结论:共检索到177篇文章,按纳入和排除标准对文献进行筛选,共纳入30篇文章.结果表明肌肉发生是肌肉肥大的生物学基础,卫星细胞是成体肌肉发生关键,但肌肉肥大早期过程可能没有卫星细胞的参与,以DNA含量来衡量卫星细胞改变可能有较大误差,成肌因子是肌肉发生核心因子.目前研究对成肌因子成员之间功能的异同和成肌因子的运动性调控特点的了解仍不深入.     

血管内皮细胞生长因子基因体外转染小鼠NIH3T3细胞的生物活性

目的:用基因工程方法改造成纤维细胞,使其分泌血管内皮细胞生长因子,观察成纤维细胞作为基因转染的靶细胞的可行性。方法:实验于2005-11在解放军第四军医大学西京医院全军整形外科研究所完成。PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒的扩增、提取、纯化和鉴定后,将培养14d细胞融合约80%的小鼠NIH3T3细胞在24孔板中进行转染,细胞随机分为3组,每组10孔,分别为PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组。采用免疫组织化学化学检测血管内皮细胞生长因子表达。ELISA方法检测血管内皮细胞生长因子外分泌。四甲基偶氮唑盐法检测小鼠NIH3T3细胞对PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染的敏感性。结果:①PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒的基因测序结果显示序列正确。②免疫组织化学染色显示:小鼠NIH3T3细胞转染4d后胞浆内可观察到阳性表达产物,对照组呈阴性结果。③ELISA检测结果:小鼠NIH3T3细胞转染14d后,PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组3组培养上清中血管内皮细胞生长因子浓度分别346±23,0,0ng/L(P<0.05)。④四甲基偶氮唑盐法检测结果:PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组所测的490nm的A值比较差异均无显著性(依次为0.96±0.11,0.91±0.10,0.98±0.16,P>0.05)。PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染对小鼠NIH3T3细胞增殖无影响。结论:小鼠NIH3T3细胞可作为血管内皮细胞生长因子基因转染的靶细胞,用于基因治疗。     

血管内皮细胞生长因子基因体外转染小鼠NIH3T3细胞的生物活性

目的：用基因工程方法改造成纤维细胞，使其分泌血管内皮细胞生长因子，观察成纤维细胞作为基因转染的靶细胞的可行性。 方法：实验于2005-11在解放军第四军医大学西京医院全军整形外科研究所完成。PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒的扩增、提取、纯化和鉴定后，将培养14d细胞融合约80％的小鼠NIH3T3细胞在24孔板中进行转染，细胞随机分为3组，每组10孔，分别为PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染组．空质粒转染组和不转染质粒组。采用免疫组织化学化学检测血管内皮细胞生长因子表达。ELISA方法检测血管内皮细胞生长因子外分泌。四甲基偶氮唑盐法检测小鼠NIH3T3细胞对PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染的敏感性。 结果：①PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒的基因测序结果显示序列正确。②免疫组织化学染色显示：小鼠NIH3T3细胞转染4d后胞浆内可观察到阳性表达产物，对照组呈阴性结果。③ELISA检测结果：小鼠NIH3T3细胞转染14d后，PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组3组培养上清中血管内皮细胞生长因子浓度分别346&;#177;23，0，0ng／L（P〈0．05）。④四甲基偶氮唑盐法检测结果：PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组所测的490nm的A值比较差异均无显著性（依次为0．96&;#177;0.11，0．91&;#177;0．10，0．98&;#177;0．16，P〉0．05）。PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染对小鼠NIH3T3细胞增殖无影响。 结论：小鼠NIH3T3细胞可作为血管内皮细胞生长因子基因转染的靶细胞，用于基因治疗。     

碱性成纤维细胞因子在异基因外周血造血干细胞移植患者中的应用

目的 研究碱性成纤维细胞因子(b—FGF)喷雾剂对异基因外周血造血干细胞移植患口腔溃疡的影响。方法 34例进入血液层流室的异基因外周血造血干细胞移植患，随机分为实验组与对照组，分别观察口腔溃疡发生情况、愈合时间、溃疡分布、平均愈合天数及溃疡VAS疼痛评分。结果 实验组与对照组的口腔溃疡发生率无明显差异，但口腔溃疡伪膜发生率、平均愈合天数及患口腔溃疡VAS疼痛评分明显低于对照组。结论b—FGF可减少患口腔溃疡伪膜的发生，使口腔溃疡面提前愈合，提高患痛感，降低患疼痛感，有助于以较好状态；度过造血干细胞移植期。     

体外转染绿色荧光蛋白基因的肌源性干细胞移植修复大鼠脊髓损伤

背景:肌源性干细胞易于提取、分离及扩增,在特定条件下可分化为骨、软骨、肌肉等中胚层组织细胞,还可以跨胚层分化为神经细胞等,是组织工程临床用于脊髓损伤修复的理想种子细胞.目的:观察肌源性千细胞移植对脊髓半切损伤大鼠运动功能的修复作用.方法:40只成年SD大鼠随机数字表法分为移植组和对照组,每组20只.均进行脊髓半切损伤,伤后9 d,移植组于伤处移植体外转染绿色荧光蛋白基因的大鼠肌源性干细胞,而对照组仅注射等量PBS,于移植后1,2,3,4周用斜板实验和BBB评分测大鼠的运动功能,同时进行损伤脊髓取材、快速冰冻切片进行荧光显微镜观察.结果与结论:所有大鼠脊髓半切损伤手术均成功.术后无动物死亡.肌源性干细胞移植后1周,移植组与对照组均有所恢复,斜板实验和BBB评分差异无显著性意义(P>0.05;2～4周移植组恢复明显较好,斜板实验和BBB评分显著高于对照组(P<0.05),移植组后肢活动与前后肢活动的协调性明显优于对照组.荧光显微镜观察经诱导分化和基因标记的肌源性干细胞在损伤脊髓组织局部生长良好,并且有沿着脊髓神经束向头尾两侧迁移的趋势.提示脊髓半切损伤大鼠经肌源性于细胞移植后能在损伤脊髓组织局部长期存活并明显改善其运动功能,肌源性干细胞移植对脊髓半切损伤大鼠有修复作用.     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染对鼠眼外肌成肌细胞生物学行为的影响

背景:实验证明外源性的碱性成纤维细胞生长因子可以增强骨骼肌成肌细胞的生长及成活,内源性碱性成纤维细胞生长因子对肌肉修复也有明显作用。但如将其基因转染到眼外肌中也有相同的效果吗?目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子基因转染对鼠眼外肌成肌细胞生物学行为的影响。设计:单一样本观察。单位:青岛大学医学院附属医院眼科。材料:原代大鼠眼外肌成肌细胞为前期培养得到,纯度大于90%,并成功构建人PEGFP-N3-bFGF真核表达载体(另文发表)。方法:实验于2005-09/2006-12在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。①实验干预及分组:实验分为试验组:用重组PEGFP-N3-bFGF转染的细胞;对照组1:空载PEGFP-N3转染的细胞;对照组2:培养皿中只加入F-10培养基(体积分数为0.1的胎牛血清)培养的细胞。采用脂质体转染技术,将重组PEGFP-N3-bFGF质粒转染体外培养的大鼠眼外肌成肌细胞中。③实验评估:用免疫组织化学法观察碱性成纤维细胞生长因子表达;用荧光显微镜检测转染效率;在培养的第1,3,5,7,9,11,13,15,21,28天采用ABC-ELISA法检测各组成肌细胞碱性成纤维细胞生长因子蛋白的分泌;采用四甲基偶氮唑盐法检测各组眼外肌成肌细胞增殖情况;根据已知一定浓度标准品的A值计算各组细胞肌酸激酶活性。主要观察指标:①观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染体外培养的大鼠眼外肌成肌细胞的效率;转染后的表达情况。②转染后碱性成纤维细胞生长因子蛋白的分泌情况;对大鼠眼外肌肌原细胞生长和分化的影响。结果:①碱性成纤维细胞生长因子基因转染体外培养的大鼠眼外肌成肌细胞的转染率达(42.8±1.2)%。②免疫组织化学检测试验组呈现阳性反应。③转染细胞能够分泌碱性成纤维细胞生长因子蛋白,第5天最高达662.935ng/L。④转染细胞增殖活性明显提高,其A值均比同一时相点的对照组明显增高(P<0.05)。⑤转染后细胞从第5天始至终,肌酸激酶值高于对照组(P<0.01)。结论:碱性成纤维细胞生长因子基因转入大鼠眼外肌的成肌细胞中,能够使大鼠眼外肌的成肌细胞分泌碱性成纤维细胞生长因子,具有促进细胞增殖,提高其成活率,促进其分化能力。     

酸性成纤维细胞因子复合部分脱蛋白骨修复早期股骨头缺血坏死的组织学改变

背景：以往研究显示,酸性成纤维细胞因子（acidic fibroblast growthfactor,aFGF）复合部分脱蛋白骨（partially,deproteinisedbone,PDPB）对实验动物早期股骨头缺血坏死血．管再生具有良好的促进作用,似其组织学变化尚不明确。目的：从组织学变化角度观察aFGF复合PDPB修复兔早期股骨头缺血坏死的效果。方法：用新西兰大白兔制备早期股骨头缺血坏死动物模型,建模后随机分为空白组、PDPB组和aFGF／PDPB组．PDPB组植入PDPB,aFGF／PDPB组植入aFGF／PDPB,所有动物分别丁第2,4,8周取材进行靠术精伊红染包观察成骨情况结果与结论：空白组第8周缺损区破纤维结缔组织填充,在交界处有少鬣骨样组织形成。PDPB组第4周有少最新骨生成,髓腔肜成,第8周较多植入物吸收,髓腔形成,有很多成骨细胞及髓细胞分布其中。、aFGF／PDPB组各时间点成骨都普遍优于PDPB组,4周组移植物腔填充以骨样组织,可见较多的成骨前体细胞和骨母细胞,可见较多的微血管,骨样组织开始重建。第8周植入物已被新骨取代,髓腔已形成具宵很多骨髓细胞分布其中,骨小粱交界处柯大节成骨细胞,同时仃少量破骨细胞存在可能参与骨塑形,骨陷窝可见成熟骨细胞。组织学检测结果提示．在修复股骨头缺血坏死的效果上,aFGF复合PDPB优于单独应用PDPB。     

酸性成纤维细胞因子复合部分脱蛋白骨修复早期股骨头缺血坏死的组织学改变

背景:以往研究显示,酸性成纤维细胞因子(acidic fibroblast growth factor,aFGF)复合部分脱蛋白骨(partially deproteinised bone,PDPB)对实验动物早期股骨头缺血坏死血管再生具有良好的促进作用,但其组织学变化尚不明确.目的:从组织学变化角度观察aFGF复合PDPB修复兔早期股骨头缺血坏死的效果.方法:用新西兰大白兔制备早期股骨头缺血坏死动物模型,建模后随机分为空白组、PDPB组和aFGF/PDPB组.PDPB组植入PDPB,aFGF/PDPB组植入aFGF/PDPB.所有动物分别于第2,4,8周取材进行苏木精伊红染色观察成骨情况.结果与结论:空白组第8周缺损区被纤维结缔组织填充,在交界处有少量骨样组织形成.PDPB组第4周有少量新骨生成,髓腔形成,第8周较多植入物吸收,髓腔形成,有很多成骨细胞及髓细胞分布其中.aFGF/PDPB组各时间点成骨都普遍优于PDPB组,4周组移植物腔填充以骨样组织,可见较多的成骨前体细胞和骨母细胞,可见较多的微血管,骨样组织开始重建.第8周植入物已被新骨取代,髓腔已形成具有很多骨髓细胞分布其中,骨小梁交界处有大量成骨细胞,同时有少量破骨细胞存在可能参与骨塑形,骨陷窝可见成熟骨细胞.组织学检测结果提示,在修复股骨头缺血坏死的效果上,aFGF复合PDPB优于单独应用PDPB.

Abstract：

BACKGROUND: Previous studies have demonstrated that acidic fibroblast growth factor (aFGF) combined with partially deproteinized bone (PDPB) (aFGF/PDPB) well promotes avascularization in animals with early-stage avascular necrosis of the femoral head (ANFH), but the histological results remain unknown.OBJECTIVE: To observe the histological repairing effects of aFGF/PDPB on early-stage ANFH in rabbits. METHODS: New Zealand rabbits were established models of bilateral ANFH and were randomly divided into a blank group, a simple PDPB group, and an aFGF/PDPB group. PDPB and aFGF/PDPB bone were implanted into the PDPB and aFGF/PDPB group accordingly. The blank group did not receive any implantation. At 2, 4, and 8 weeks after surgery, all animals were sacrificed for histological examination to observe the osteogenesis by hematoxylin-eosin staining.RESULTS AND CONCLUSION: Defects were filled with granulation tissues and fibrous connective tissues, only a little osteoid tissue formed at the borderline in the blank group at the end of the 8th week. In the PDPB group, a little new bone and cavitas medullaris formed. At 8 weeks, lots of graft was absorbed and cavitas medullaris formed with more osteoplasts and myeloid cells in it. The osteogenesis in the aFGF/PDPB group was better than that of PDPB group in each time point. At 4 weeks, the transplanted cavity was filled with osteoid tissues, a lot of osteogenic precursor cells and osteoblasts could be seen. Plenty of micrangium was observed, and osteoid tissues began to rebuild. At 8 weeks, the graft was replaced by bone tissues, and cavitas medullaris were formed with lots of bone marrow cells in it. At the borderline of the bone trabecula, there were lots of osteoplast and little osteoclasts, which may play a role in bone remodeling. There were mature bone cells in bone lacuna. Results indicate that aFGF/PDPB has better repair effect on rabbit model of ANFH than that of simple PDPB.     

重组反转录病毒碱性成纤维细胞生长因子基因转染对人骨髓基质细胞成骨的影响

背景:国内外有关成纤维细胞生长因子基因转染促血管和促肌肉生长的研究较多,而成纤维细胞生长因子基因促成骨的研究未见报道。目的:观察重组反转录病毒retroviruspLXSN/碱性成纤维细胞生长因子基因转染对人骨髓基质细胞成骨能力的影响。方法:从健康志愿者全骨髓中分离培养人骨髓基质细胞,体外扩增纯化后分为4组:①retroviruspLXSN/碱性成纤维细胞生长因子组:培养液中加入碱性成纤维细胞生长因子基因重组反转录病毒。②retroviruspLXSN组:培养液中加入反转录病毒空载体。③阳性对照组:培养液中添加地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠。④空白对照组:不给予特殊处理。结果与结论:经多次换液传代,人骨髓基质细胞呈均一梭形形态。处理后retroviruspLXSN/碱性成纤维细胞生长因子组与阳性对照组细胞形态逐渐趋于扁平,突起减少。免疫组织化学染色见retroviruspLXSN/碱性成纤维细胞生长因子组碱性成纤维细胞生长因子表达明显强于其他3组。retroviruspLXSN/碱性成纤维细胞生长因子和阳性对照组可引起细胞碱性磷酸酶活性增高和矿化结节及骨胶原形成。提示基因重组反转录病毒成纤维细胞生长因子转染对人骨髓基质细胞成骨能力具有促进作用。     

细胞因子对树突状细胞体外培养的影响

１导言免疫反应的产生首先需要有抗原递呈细胞（AntigenPresentingCellsAPC）捕获抗原，经加工处理后使抗原肽与MHC分子结合而递呈至细胞表面，T细胞得到抗原信息后，在强大的共刺激分子共同作用下而引起特异性的免疫反应。因此，APC是人体免疫反应产生的首要环节。树突状细胞（Den－driticCellsDC）是一类形状不规则的非单核吞噬系统细胞，特点是胞浆有许多长突起呈触须状，使整个细胞形态象个蜘蛛。DC分散于全身的上皮组织和实质性器官，其细胞数量不超过局部细胞总数的１％；也可迁移到血液和淋巴，其数量不超过血液有核细胞总数…