碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后目的基因的表达

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后bFGF目的基因的表达情况,并进行影响骨髓间充质干细胞的生物学特性分析。方法:实验于2005-03/2006-02在中山大学第二附属医院医学研究中心完成。①选择近交系4周龄雄性SD大鼠10只,贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,构建含bFGF基因的腺病毒表达载体,利用腺病毒介导转染SD大鼠骨髓间充质干细胞。②传2代后,将细胞接种12孔培养板,培养至90%融合时弃上清,调整转染病毒滴度范围为50～400。荧光显微镜下通过观察绿色荧光强度检测转染效果,以流式细胞仪检测细胞转染效率。③传2代后,胰酶消化,置于6孔板内,每孔细胞数量5×105,2d后细胞贴壁生长于盖玻片上,分别转染Ad.bFGF、Ad.GFP,同时设立空白对照。转染病毒滴度选择200。应用免疫组化和Western-Blot法鉴定碱性成纤维细胞生长因子的表达,ELISA法检测培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子的浓度。观察转染后骨髓间充质干细胞形态和生长情况的变化。结果:①pcDNA3/bFGF的鉴定结果:成功构建碱性成纤维细胞生长因子腺病毒表达载体。②Ad.GFP转染骨髓间充质干细胞的效率测定:转染48h后,绿色荧光蛋白的表达明显增强。当转染病毒滴度≤200时,腺病毒的转染效率与病毒剂量呈明显的正相关(P<0.05),当>200时转染效率趋于稳定,均在96%以上。③Ad.bFGF转染骨髓间充质干细胞的表达情况:bFGF蛋白表达免疫组化检测可见转染Ad.bFGF骨髓间充质干细胞的胞浆内充满棕褐色颗粒,阳性表达率为86%,而转染Ad.GFP及空白对照的骨髓间充质干细胞均为阴性。Western-Blot示转染Ad.bFGF的细胞裂解产物中碱性成纤维细胞生长因子含量明显高于转染Ad.GFP及空白对照。ELISA检测结果表明转染Ad.bFGF的细胞培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子浓度第15天达高峰1467ng/L,此后逐渐下降,但至转染第28天时仍显著高于空白对照(441ng/L,128ng/L,t=4.31,P<0.01)。④转染Ad.bFGF对骨髓间充质干细胞增殖的影响:骨髓间充质干细胞的增殖分化没有明显变化。结论:采用腺病毒介导的基因转染技术可以将碱性成纤维细胞生长因子转染至骨髓间充质干细胞中,并有外源性基因和蛋白的表达。提示骨髓间充质干细胞是碱性成纤维细胞生长因子基因治疗的理想载体。     

碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞的表型变化

背景：外源性碱性成纤维细胞生长因子在韧带组织的愈合过程中发挥着重要作用,采用转基因方法将外源性基因转入细胞内能促进碱性成纤维细胞生长因子分泌。目的：观察碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞后表型变化及碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达。方法：取P2代骨髓间充质干细胞,分为3组,正常培养组为对照组,其他2组分别转染重组腺病毒（Ad.bFGF-eGFP）及空病毒（Ad.eGFP）。相差显微镜观察各组细胞形态变化,MTT法测定细胞增殖曲线,ELISA法分析各组细胞上清液中碱性成纤维细胞生长因子蛋白质量浓度。结果与结论：转染后细胞呈现均一的成纤维细胞表型;碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒组细胞增殖活性高于空病毒组及对照组;ELISA结果提示碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒组在7 d内上清液中碱性成纤维细胞生长因子蛋白质量浓度较空病毒组及对照组增加,差异有显著性意义（P〈0.05）。提示碱性成纤维细胞生长因子重组腺病毒转染骨髓间充质干细胞可促进其向成纤维细胞分化,增加增殖活力,促进其碱性成纤维细胞生长因子蛋白的表达。     

重组碱性成纤维细胞生长因子基因转染对于骨髓源性成骨细胞的生物学特性及对血管生成的影响

背景:碱性成纤维细胞生长因子对来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有明显的促进增殖作用,对骨髓间充质干细胞具有间接的成骨作用.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染对骨髓源性成骨细胞生物学特性和血管生成的影响,与骨髓间充质干细胞作对比.设计、时间及地点:对比分析基因转染效果实验,于2007-11-27/2008-12-01在南方医科大学珠江医院中心实验室和动物实验中心完成.材料:2月龄新西兰大白兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨细胞诱导.5周龄Wistar大鼠用于移植实验.牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒由中山大学中山医学院免疫教研室徐霖博士惠赠.方法:分离兔骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞,采用脂质体介导将牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒分别转染体外培养的兔骨髓间充质干细胞和诱导的骨髓源性成骨细胞,G418筛选.稳定转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓源性成骨细胞与磷酸钙胶原材料复合培养,植于Wistar大鼠后腿肌袋内,正常饲养2,4周后取出植入的复合材料,观察血管新生情况.主要观察指标:碱性成纤维细胞生长因子转染前后骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性参数的比较以及骨髓源性成骨细胞转染碱性成纤维细胞生长因子前后新生血管数目的比较.结果:利用RT-PCR、免疫细胞化学染色分析转染细胞的碱性成纤维细胞生长因子表达情况.从形态、增殖特性和细胞周期、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原等方面分析稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性.重组牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒成功转染目的细胞,经G418筛选稳定表达.转染的细胞有大量目的基因mRNA转录和目的蛋白表达.转染碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生长均加快,细胞周期中增殖期细胞比例明显增加,细胞形态无明显变化.转染与未转染的骨髓源性成骨细胞比较,碱性磷酸酶的分泌量无明显变化(P＞0.05),转染后骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶分泌量小于骨髓源性成骨细胞(P＜0.01).骨髓源性成骨细胞转染与未转染碱性成纤维细胞生长因子基因组均有Ⅰ型胶原mRNA表达,但是,转染和未转染的骨髓间充质干细胞中均无Ⅰ型胶原基因mRNA转录.转染有外源性碱性成纤维细胞生长因子基因的复合材料部分被增生纤维结缔组织包绕,内有新生血管生成,随着时间的延长而增多.结论:稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞增殖较快,但作为组织工程骨的种子细胞,骨髓源性成骨细胞较骨髓间充质干细胞更理想.外源碱性成纤维细胞生长因子基因转染后稳定表达,对新生血管的形成具有促进作用,可以作为组织工程化人工骨种子细胞转染的目的基因.     

腺病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染促进人骨髓间充质干细胞的成骨特点

目的：课题组以前的实验证实，人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒可高效感染人骨髓间充质干细胞，使之大量表达人血管内皮生长因子165，促进局部新生血管生成，有利于组织修复。实验观察腺病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨能力的影响。 方法：实验于2005—03／2006—01在郧阳医学院附属人民医院临床研究所和创伤骨科完成。人骨髓间充质干细胞取自健康成年男性自愿者，得到医院伦理道德委员会批准。将人骨髓间充质干细胞体外扩增纯化后随机分为4组：①人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组。②β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组。③阳性对照组：培养液中添加地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠。④空白对照组：不给予特殊处理。各组细胞处理后12d，应用全自动生化分析仪检测各组培养上液碱性磷酸酶活性；于处理后14d，应用VonKossa染色法检测人骨髓间充质干细胞中骨胶原结节形成情况。 结果：①经多次换液传代，人骨髓间充质干细胞呈均一梭形形态。处理后人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组细胞形态逐渐趋于扁平，突起减少；β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组形态无明显变化。②Yon Kossa染色人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组可见大量红色骨胶原结节形成，明显多于β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组。③人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组培养上清碱性磷酸酶活性显著高于β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组（F=165．18，P=0．00）。结论：人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒基因转染对人骨髓间充质于细胞成骨能力具有促进作用，验证了转染人血管内皮生长因子165的人骨髓间充质干细胞移植治疗骨疾病的可行性。     

腺病毒介导入血管内皮生长因子_165基因转染促进人骨髓间充质干细胞的成骨特点

目的：课题组以前的实验证实，人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒可高效感染人骨髓间充质干细胞，使之大量表达人血管内皮生长因子165，促进局部新生血管生成，有利于组织修复。实验观察腺病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨能力的影响。 方法：实验于2005—03／2006—01在郧阳医学院附属人民医院临床研究所和创伤骨科完成。人骨髓间充质干细胞取自健康成年男性自愿者，得到医院伦理道德委员会批准。将人骨髓间充质干细胞体外扩增纯化后随机分为4组：①人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组。②β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组。③阳性对照组：培养液中添加地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠。④空白对照组：不给予特殊处理。各组细胞处理后12d，应用全自动生化分析仪检测各组培养上液碱性磷酸酶活性；于处理后14d，应用VonKossa染色法检测人骨髓间充质干细胞中骨胶原结节形成情况。 结果：①经多次换液传代，人骨髓间充质干细胞呈均一梭形形态。处理后人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组细胞形态逐渐趋于扁平，突起减少；β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组形态无明显变化。②Yon Kossa染色人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组可见大量红色骨胶原结节形成，明显多于β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组。③人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组培养上清碱性磷酸酶活性显著高于β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组（F=165．18，P=0．00）。结论：人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒基因转染对人骨髓间充质于细胞成骨能力具有促进作用，验证了转染人血管内皮生长因子165的人骨髓间充质干细胞移植治疗骨?     

Ad-hBMP-2与Ad-hTGF-β1基因共转染骨髓间充质干细胞后的体外成骨诱导

背景：重组DNA技术的进展为骨组织工程研究的发展提供巨大动力,将其应用于组织工程骨构建可以显著提高骨修复的质量和效率。目的：拟将Ad-h BMP-2联合Ad-h TGF-β1转染骨髓间充质干细胞体外成骨诱导,观察二者在成骨过程中的相互关系。方法：以腺病毒Ad Max为基因转移载体,将携带转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2基因的高滴度腺病毒感染SD大鼠骨髓间充质干细胞,利用外源性基因编码的生长因子诱导其表达,通过RT-PCR、ELISA、MTT实验及碱性磷酸酶水平检测等方法鉴定。结果与结论：腺病毒感染骨髓间充质干细胞后RT-PCR可检测出外源基因的表达,MTT实验和碱性磷酸酶活性检测双基因共转染的骨髓间充质干细胞增殖能力最强,碱性磷酸酶活性最高。结果表明联合应用Ad-h TGF-β1和Ad-h BMP-2转染可明显促进骨髓间充质干细胞的成骨化,效果优于单用一种生长因子。     

骨髓间充质干细胞的基因转染

1人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达,2011年15卷10期1769页。2体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定,见2010年14卷19期3507页。3碱性成纤维细胞生长因子基因转染兔骨髓间充质干细胞,见2009年13卷49期9687页。     

骨髓间充质干细胞的基因转染

1人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达,2011年15卷10期1769页。2体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定,见2010年14卷19期3507页。3碱性成纤维细胞生长因子基因转染兔骨髓间充质干细胞,见2009年13卷49期9687页。     

体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景:骨髓间充质千细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长,定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点.目的:探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响.方法:将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序.利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆.采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Westem-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期.结果与结论:脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位丰要位干胞浆.转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P<0.05).提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖.     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染免骨髓间充质干细胞

背景:碱性成纤维细胞生长因子对于创伤修复具有明显的促进作用,但局部应用难以持久地发挥作用.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞后的表达情况.设计、时间及地点:细胞基因学体外观察,于2009-03/08在云南大学生命科学院完成.材料:日本大耳白兔1只,购于昆明医学院动物科.pCDNA3.1质粒为美国Invitrogen产品.方法:抽取兔髂前上棘骨髓,采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,待细胞融合至培养瓶底80%时消化传代.参考GeneBank碱性成纤维细胞生长因子cDNA序列设计合成基因,电泳纯化后xhol I、BamH I双酶切回收凝胶,以限制性核酸内切酶对PcDNA Vector质粒进行酶切、电泳和凝胶回收,连接碱性成纤维细胞生长因子DNA与PcDNA Vector质粒,构建pCDNA-碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体,运用脂质体转染法将重组体转染至兔骨髓间充质干细胞中,并筛选稳定转染株.主要观察指标:骨髓间充质干细胞表面抗原的表达,Western blot法检测目的蛋白的表达.结果:流式细胞仪检测结果示所培养细胞表面抗原呈CD90,CD44阳性,CD45呈阴性;免疫组化检测结果示骨髓间充质干细胞血管源性细胞表面抗原CD34呈阴性,而相对特异性标记物CD44呈阳性.转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞提取的细胞裂解液中,在M_r 23 000处有一条明显阳性杂交带;而转染pCDNA3.1(-)空载体的骨髓间充质干细胞提取蛋白未见阳性条带.结论:实验成功地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞,该目的基因可稳定表达.     

Liposomal gene transfer of multiple genes is more effective than gene transfer of a single gene

Liposomal gene transfer is an effective therapeutic approach for the treatment of several pathophysiologic states. The purpose of the present study was to define whether gene transfer of multiple genes is a feasible approach and whether this approach would be more effective than the single transfer of cDNA. Rats were inflicted an acute wound and divided into four groups to receive weekly subcutaneous injections of liposomes plus the Lac-Z gene (0.22 microg, vehicle), or liposomes plus the insulin like-growth factor-I (IGF-I)cDNA (2.2 microg) and Lac Z gene (0.22 microg), or liposomes plus the keratinocyte growth factor (KGF) cDNA (2.2 microg) and Lac Z gene (0.22 microg), or liposomes plus the IGF-I/KGF cDNA (2.2 microg) and Lac Z gene (0.22 microg). Planimetry, immunological assays, histological and immunohistochemical techniques were used to determine molecular mechanisms after gene transfer, protein expression, dermal and epidermal regeneration. IGF-I/KGF cDNA transfer increased IGF-I and KGF protein concentration and caused concomitant cellular responses, for example,by increasing IGFBP-3, P<0.05. IGF-I/KGF cDNA gene transfer improved epidermal regeneration by exhibiting the most rapid area and linear wound re-epithelization by almost 250% compared to control and each growth factor given individually, P<0.001, which was probably due to promitogenic and antiapoptotic effects on basal keratinocytes when compared to controls, P<0.001. Dermal regeneration was improved in IGF-I/KGF cDNA-treated animals by an increased collagen deposition and morphology when compared with vehicle, IGF-I and KGF, P<0.001. IGF-I/KGF cDNA increased VEGF concentrations and thus neovascularization when compared with vehicle, IGF-I and KGF, P<0.001. In the present study, we showed that exogenous gene transfer of multiple cDNA sequences have an additive effect on intracellular and biological responses when compared to the same gene administered as a single cDNA sequence. Our findings demonstrate that gene therapy with multiple genes is feasible, and that the gene transfer of multiple genes can enhance and accelerate physiologic and biological effects.     

基因转染新方法--声化学基因转染

目的 基因转染效率低下一直是限制基因研究与基因治疗进一步发展和广泛应用的瓶颈问题。笔者将生物技术和超声技术有机结合,提出一种基因转染新方法即声化学基因转染或声化学内在化,为提高基因转染效率提供新的思路和新手段。     

炭疽芽孢杆菌基因芯片探针的制备

目的制备炭疽芽孢杆菌(BA)基因芯片探针,应用于BA基因芯片的检测。方法采用PCR方法,以BA疫苗株A16R基因组DNA为模板,扩增pXO1质粒上的8个特异性片段,连接至pMD19-T Simple载体,构建分别包含8个探针序列的重组质粒,以其为PCR扩增模板获取探针DNA。结果基因测序证明,成功获得BA的3个探针。结论 BA基因探针的成功获取,为炭疽芽孢杆菌基因芯片的制备奠定了基础。     

Contributions of gene marking to cell and gene therapies

The first human genetic modification studies used replication-incompetent integrating vector vectors to introduce marker genes into T lymphocytes and subsequently into hematopoietic stem cells. Such studies have provided numerous insights into the biology of hematopoiesis and immune reconstitution and contributed to clinical development of gene and cell therapies. Tracking of hematopoietic reconstitution and analysis of the origin of residual malignant disease after hematopoietic transplantation has been possible via gene marking. Introduction of selectable marker genes has enabled preselection of specific T-cell populations for tumor and viral immunotherapy and reduced the threat of graft-versus-host disease, improving the survival of patients after allogeneic marrow transplantation. Marking studies in humans, murine xenografts, and large animals have helped optimize conditions for gene transfer into CD34(+) hematopoietic progenitors, contributing to the achievement of gene transfer efficiencies sufficient for clinical benefit in several serious genetic diseases such as X-linked severe combined immunodeficiency and adrenoleukodystrophy. When adverse events linked to insertional mutagenesis arose in clinical gene therapy trials for inherited immunodeficiencies, additional animal studies using gene-marking vectors have greatly increased our understanding of genotoxicity. The knowledge gained from these studies is being translated into new vector designs and clinical protocols, which we hope will continue to improve the efficiency, effectiveness and safety of these promising therapeutic approaches.     

Virus-mediated gene transfer for cutaneous gene therapy

Cutaneous gene therapy offers unique opportunities and limitations in the use of viral vectors for corrective gene transfer. Skin presents a formidable barrier to microbial invasion and is nourished by small blood vessels, thus ruling out the possibility of directed virus delivery through cannulated blood vessels. However, skin is physically accessible and its resident keratinocyte stem cell population is susceptible to direct in vivo transduction with retroviral vectors. Furthermore, keratinocyte stem cells transduced in culture have been shown to persist and to express the encoded transgene when grafted to immunocompromised mice. Cutaneous gene therapy trials are likely to involve virus-mediated transduction as a principal means of gene transfer.     

金黄色葡萄球菌耐消毒剂基因及5类抗生素耐药相关基因检测

目的了解本地区临床分离的金黄色葡萄球菌（SA）的耐药特点,探讨SA中耐消毒剂基因（qacA）、β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯-林可霉素-链阳菌素B类（MLSB）、四环素类、糖肽类药物耐药基因的存在情况。方法采用聚合酶链反应（PCR）法对20株SA进行β-内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶基因、MLSB类基因、四环素类基因、糖肽类基因、耐消毒剂基因检测。结果 PCR结果显示20株SA中13种耐药相关基因检出率分别为mecA75%、TEM90%、aac（6＇）/aph（2″）70%、ant（4＇,4″）15%、ant（6）-Ⅰ25%、ermA100%、ermC55%、msrA20%、msrB55%、tetM65%、qacA60%,vanA、vanB基因均为阴性。结论多数SA菌株具有耐多药特征,存在耐β-内酰胺类、氨基糖苷类、MLSB类、四环素类等多种抗生素耐药基因,且对胺类、胍类消毒剂耐受。