硝普钠诱导被动致敏的人气道平滑肌细胞凋亡

目的： 研究一氧化氮(NO)供体硝普钠（SNP）是否诱导被动致敏的人气道平滑肌细胞(HASMCs)凋亡。方法：将人气道平滑肌细胞用哮喘患者血清被动致敏后，用SNP（NO的供体）干预，通过四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定细胞生长率的变化，用原位末端标记法和流式细胞术检测SNP对被动致敏的人气道平滑肌细胞凋亡的影响。结果：（1）MTT法测定：SNP+哮喘血清致敏组的细胞存活率明显低于哮喘血清致敏组细胞存活率（n=5，P<0.05）。（2）TUNEL(原位末端标记)法检测：SNP干预的被动致敏的HASMC组的凋亡指数明显高于哮喘血清致敏组（n=4，P<0.01）。（3）流式细胞术测定SNP+哮喘血清致敏组的HASMCs凋亡率明显高于哮喘血清致敏组（n=4，P<0.05）。结论： SNP 能抑制被动致敏的HASMCs的增殖，并且能诱导被动致敏的HASMCs凋亡，这种作用可能与治疗哮喘患者的气道重建有关。     

血管内皮生长因子及其受体2与被动致敏的人气道平滑肌细胞增殖相关性研究

目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）及其受体2（KDR）在被动致敏的人气道平滑肌细胞（ASNC）中表达变化及其对ASMC增殖的影响。方法培养人ASMC，用支气管哮喘病人血清被动致敏ASMC。用免疫组织化学技术检测ASMC增殖细胞核抗原（POJA）的表达，MTT法检测细胞代谢活性及流式细胞仪分析细胞周期；用RT-PCR及Western blot方法分别检测VEGF和KDR mRNA及蛋白质在不同组人ASMC的表达程度。结果（1）被动致敏组ASMC较对照组和干预组增殖显著增加（P〈0．05）。（2）被动致敏组ASMC的VEGF121、VEGF165和VEGF189的mRNA表达分别较对照组和干预组显著增加（P〈0．05或P〈0．01）。（3）被动致敏组ASMCVEGF及KDR蛋白质的表达较对照组和干预组显著增加（P〈0．05）。直线相关性分析显示，ASMC中PCNA表达与ASMC中VEGF121、165、189及KDRmRNA表达水平呈正相关（r分别为0．73、0．82、0．77、0．70，P〈0．05）；ASMC中PCNA表达与ASMC中VEGF及KDR蛋白质表达水平也呈正相关（r分别为0．69、0．67,P〈0．05）。结论被动致敏的ASMC中VEGF及其受体KDR表达上调。并与ASMC增殖密切相关。该结果提示VEGF及其受体2可能参与了哮喘气道重建中ASMC增殖的过程。     

运动应激对慢性吸烟大鼠气道平滑肌钾通道BKCa、Kv1.5表达的影响

目的:观察运动应激对吸烟大鼠支气管平滑肌大电导的钙激活的钾通道(BK_Ca)和电压依赖性延迟整流钾通道Kv1.5蛋白和mRNA表达的影响。方法:复制大鼠慢性吸烟模型后,进行运动训练,测定气道反应性和血浆皮质醇浓度,采用HE染色、免疫组织化学染色、原位杂交和免疫印迹等方法检测肺组织病理形态学改变和BK_Ca、Kv1.5的表达变化。结果:(1)吸烟对照组的气道反应性明显高于正常对照组(P<0.01),而吸烟加运动应激组的气道反应性显著低于吸烟对照组(P<0.05);(2)运动后血浆皮质醇浓度明显高于运动前(P<0.01),但全部运动结束次日晨测定的血浆皮质醇浓度与运动前无明显差异(P>0.05);(3)HE染色显示,吸烟对照组肺组织出现明显的慢性炎症反应,吸烟加运动应激组炎症反应轻于吸烟对照组;(4)慢性吸烟大鼠大气道和小气道BK_CamRNA和蛋白表达低于正常对照组,吸烟加运动应激组BK_CamRNA表达高于吸烟对照组,但对小气道的蛋白表达无影响;(5)慢性吸烟大鼠大气道和小气道Kv1.5蛋白和mRNA表达低于正常对照组,在小气道吸烟加运动应激组高于吸烟对照组,大气道则无变化。结论:适当运动应激可降低慢性吸烟对大鼠气道平滑肌钾通道BK_Ca和Kv1.5的表达的抑制作用以及运动引起的皮质醇分泌的增加,可能是其降低由吸烟引起的气道高反应性的部分机制之一。     

1,25-二羟维生素D3负性调控被动致敏人气道平滑肌细胞中的NF-κB信号通路

 目的：探讨1,25-二羟维生素D3［1,25-(OH)2D3］对被动致敏人气道平滑肌细胞(HASMCs)中核因子κB（NF-κB）信号通路的影响。方法：原代培养HASMCs并使之被动致敏,以1,25-(OH)2D3作为干预因素。EMSA法检测NF-κB的DNA结合活性;免疫细胞化学染色技术观察NF-κB p65的核易位情况;Western blotting法检测核因子κB抑制蛋白α(IκBα)及p-IκBα蛋白的表达水平;实时荧光定量PCR检测维生素D受体(VDR)、维生素D 24-羟化酶(CYP24)和IκBα mRNA的表达水平;放线菌素D处理实验检测IκBα mRNA的表达。结果：(1) 1,25-(OH)2D3显著削弱被动致敏HASMCs中NF-κB的DNA结合活性及其亚单位 p65的核易位;(2) 1,25-(OH)2D3能通过增加被动致敏HASMCs中IκBα的mRNA稳定性及减少其蛋白磷酸化水平2个途径显著上调细胞中IκBα的表达;(3) 1,25-(OH)2D3显著上调被动致敏HASMCs中VDR的mRNA表达并诱发其功能性反应。结论：1,25-(OH)2D3能通过上调被动致敏HASMCs中IκBα的表达抑制细胞NF-κB信号通路,且这一作用与VDR有关,这可能是其调控被动致敏HASMCs的重要作用机制。     

U46619对培养的人气道平滑肌细胞增殖的作用

目的和方法：研究Ｕ４６６１９（９,１１－ｄｉｄｅｏｘｙ－１１α,９α－ｅｐｏｘｙｍｅｔｈａｎｏ－ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＦ２α）对培养的人气管平滑肌细胞增殖的作用。分离人的气管平滑肌细胞并且进行传代培养。在培养基中加入各种浓度的Ｕ４６６１９,计数细胞并且测定［３Ｈ］－胸腺嘧啶核苷（［３Ｈ］－ＴｄＲ）掺入量和三磷酸肌醇［Ｉｎｓ（１,４,５）Ｐ３］累积量。结果：Ｕ４６６１９在一定范围内（１ｎｍｏｌ／Ｌ～１００ｎｍｏｌ／Ｌ）以浓度依赖的方式增加人气管平滑肌的细胞数（Ｐ＜００１）。Ｕ４６６１９也增加［３Ｈ］－ＴｄＲ的掺入量和Ｉｎｓ（１,４,５）Ｐ３的累积量（Ｐ＜００１）。磷脂酶Ｃ抑制剂新霉素阻止Ｉｎｓ（１,４,５）Ｐ３累积量的增加（Ｐ＜００１）,但对Ｕ４６６１９的有丝分裂原的活性没有作用。结论：显示Ｕ４６６１９刺激培养的人气管平滑肌细胞增殖。     

1,25-二羟维生素D3抑制被动致敏人气道平滑肌细胞的增殖

目的: 检测1,25-二羟维生素D₃ 对被动致敏的人气道平滑肌细胞(HASMCs)增殖的调节作用,探讨其对哮喘气道重塑的可能作用。方法: 离体培养HASMCs,并将细胞分为对照组、哮喘组及1,25-(OH)₂D₃组。MTT法检测细胞增殖活力并确定1,25-(OH)₂D₃最佳作用浓度;用最佳作用浓度刺激HASMCs 48 h后以流式细胞术测定细胞周期,免疫细胞化学染色(SABC法)检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果: 1,25-(OH)₂D₃在10^-9-10^-7 mol/L范围内能显著抑制哮喘血清被动致敏的HASMCs增殖(P<0.05),且10^-7 mol/L时抑制作用最强;流式细胞术检测显示这一最佳作用浓度的1,25-(OH)₂D₃能显著抑制被动致敏HASMCs由G₀/G₁期向S期的转化;此外,1,25-(OH)₂D₃能显著抑制被动致敏HASMCs中PCNA的表达。结论: 1,25-(OH)₂D₃能抑制哮喘血清被动致敏的HASMCs增殖,有助于哮喘气道重塑的防治。     

转染Kv1.5基因抑制人气道平滑肌细胞的增殖

 目的：转染Kv1.5基因对人气道平滑肌细胞(HASMCs)增殖及凋亡的影响。方法:通过脂质体介导瞬时转染Kv1.5基因于培养的HASMCs中，以转染空载体pRc/CMV的细胞及未转染质粒的细胞为对照；用Western blotting 检测平滑肌细胞Kv1.5蛋白表达；用荧光光度法检测HASMCs胞内钙浓度；用流式细胞术观察细胞周期；用MTT法检测HASMCs 增殖及DNA 末端转移酶介导的原位缺口末端标记技术(TUNEL)检测细胞的凋亡。 结果: (1) 转染质粒组Kv1.5蛋白质的表达明显高于未转染组及空载体转染组(P<0.01); (2) 转染质粒组细胞胞内钙浓度明显低于未转染组及空载体转染组(P<0.05)，且其细胞周期中的G₀/G₁期细胞比例明显高于、细胞增殖率显著低于未转染组及空载体转染组(P<0.01)；同时，转染质粒组细胞的凋亡率明显高于未转染组及空载体转染组 (P<0.01)。 结论: 转染Kv1.5基因能抑制HASMCs的增殖、促进其凋亡，为进一步探讨哮喘气道重塑的机制及其治疗提供实验依据。     

内源性一氧化氮对哮喘大鼠支气管平滑肌细胞钾通道的影响

目的：观察体内应用一氧化氮（NO）前体左旋精氨酸（L-Arg）对哮喘大鼠支气管平滑肌细胞（BSMC）钾通道电生理特性的影响，为哮喘治疗提供理论基础。 方法： 雄性SD大鼠，随机分为对照组、哮喘组和哮喘L-Arg(300 mg/kg)治疗组（L-Arg组）。急性酶消化法分离获得大鼠单个BSMC。用常规全细胞膜片钳技术记录3组BSMC的静息膜电位（Em）、钙激活钾通道(BKCa)电流和电压依赖性钾通道（Kv）电流的差异。 结果： （1）哮喘组的静息膜电位为(-29.4±5.6) mV，显著低于对照组(-34.8±6.2)mV, (P<0.05)；L-Arg治疗组的静息膜电位为(-36.1±6.8) mV, 与哮喘组差异显著(P<0.05)。（2）钙激活钾通道电流：+50 mV电压刺激时，方波刺激模式下哮喘组大鼠BSMC的BKCa峰值电流密度［(43.8±16.5) pA/pF, n=8］低于对照组［(72.5±19.9)pA/pF, n=8］,(P<0.01)；L-Arg组的BKCa电流密度［(58.7±12.4) pA/pF, n=8］则高于哮喘组(P<0.05)。（3）电压依赖性钾通道电流：+50 mV电压刺激时，方波刺激模式下哮喘组大鼠BSMC的Kv峰值电流密度为［(32.4±8.7)pA/pF, n=8］，显著低于对照组［(57.7±9.8)pA/pF, n=8］ (P<0.01)；L-Arg组的Kv峰值电流密度［(43.6±7.9)pA/pF, n=8］，显著高于哮喘组［(32.4±8.7)pA/pF, n=8］ (P<0.05)。结论： 体内应用L-Arg可增加钙激活钾通道和电压依赖性钾通道电流，明显改善哮喘大鼠BSMC的静息膜电位，从而降低气道平滑肌细胞的兴奋性，可能具有抑制气道高反应性的作用。     

脂质体转染Kv1.5反义寡核苷酸（AsOND）对人气道平滑肌Kv活性的影响

目的： 研究人气道平滑肌细胞（HASMCs）转染Kv1.5反义寡核苷酸（AsOND）后，电压依赖延迟整流钾通道（Kv）的活性变化，探讨其基因亚型Kv1.5在调节Kv活性中的作用。方法： 采用脂质体转染、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blotting和全细胞膜片钳技术，观察转染Kv1.5 AsOND后，HASMCs Kv1.5 mRNA及蛋白表达的变化，以及转染对HASMCs Kv活性的影响。 结果： 脂质体转染Kv1.5 AsOND后，HASM细胞Kv1.5 mRNA和蛋白质的表达均下降；Kv电流值受到显著抑制；使细胞膜电位（E_m）趋向于去极化方向。 结论： 转染Kv1.5 AsOND可导致HASMCs Kv功能降低，Kv1.5基因亚型在调节Kv活性中可能起重要作用。     

白三烯D_4在促进培养的人气管平滑肌细胞增殖中的作用

目的和方法 :研究白三烯D4 (LTD4 )是否剌激培养的人气管平滑肌细胞 (ASMC)增殖。将分离的人ASMC进行传代培养 ,在培养基中加入各种浓度的LTD4 ,计数细胞并测定 [3 H]-胸腺嘧啶核苷 ([3 H]-TdR)掺入量和三磷酸肌醇 (IP3 )累积量。结果 :LTD4 在一定范围内 (0 1nmoL·L-1～ 10nmoL·L-1)以浓度依赖的方式增加人ASMC(P <0 0 1)。LTD4 也增加 [3 H]-TdR的掺入量和IP3 累积量 (P <0 0 1)。磷脂酶C抑制剂新霉素(1μmol·L-1)阻止IP3 累积量的增加 (P <0 0 1)。结论 :LTD4 剌激培养的人ASMC增殖并且可能在哮喘的气道重塑中起了作用。     

尼氟灭酸对气道平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的:探讨尼氟灭酸(NFA)对气道平滑肌细胞(ASMCs)增殖的影响及机制。方法:采用含胎牛血清的DMEM原代培养BALB／c小鼠ASMCs,[³H]-TdR掺入法检测不同剂量NFA(10和50 μmol／L)对ASMCs增殖活性的影响。激光共聚焦显微镜下观察NFA及硝苯地平对组胺致ASMCs中[Ca²⁺]i变化的影响。间接免疫荧光法观察NFA对ASMCs表达MAPK蛋白的影响。结果:10 μmol／L和50 mol／L NFA组细胞的活性明显低于对照组,并且高浓度50 μmol／L NFA组比低浓度10 mol／L NFA组更显著(P<0.01),表现出剂量依赖性。共聚焦显微镜下,对照组ASMCs胞浆和胞核呈现亮绿色荧光,胞膜周围较淡。加入激动剂组胺后,荧光亮度逐渐增强。相反,当同时存在NFA或硝苯地平干预时,镜下观察荧光强度变化不够明显。间接免疫荧光染色结果表明,培养24 h后,对照组中ASMCs细胞沿梭形胞浆出现大斑片状亮绿色荧光,而NFA干预组细胞表现为弱绿色荧光,胞浆内分布区域局限。结论:NFA能有效抑制培养ASMCs的增殖活性,这种作用可能是通过阻断钙激活性Cl^-通道对 [Ca²⁺]i的正反馈效应,以及降低MAPK的表达来实现的。     

The biophysics of asthmatic airway smooth muscle

It is clear that significant advances have been made in the understanding of the physiology, biochemistry and molecular biology of airway smooth muscle (ASM) contraction and how the knowledge obtained from these approaches may be used to elucidate the pathogenesis of asthma. Not to belittle other theories of smooth muscle contraction extant in the field, perhaps the most outstanding development has been the formulation of plasticity theory. This may radically alter our understanding of smooth muscle contraction. Its message is that while shortening velocity and capacity are linear functions of length, active force is length independent. These changes are explained by the ability of thick filament protein to depolymerize at short lengths and to increase numbers of contractile units in series at lengths greater than optimal length or L(ref). Other advances are represented by the report that the major part of ASM shortening is complete within the initial first 20% of contraction time, that the nature and history of loading determine the extent of shortening and that these findings can be explained by the finding that the crossbridges are cycling four times faster than in the remaining time. Another unexpected finding is that late in the course of isotonic relaxation the muscle undergoes spontaneous activation which delays relaxation and smoothes it out; speculatively this could minimize turbulence of airflow. On the applied front evidence now shows the shortening ability of bronchial smooth muscle of human subjects of asthma is significantly increased. Measurements also indicate that increased smooth muscle myosin light chain kinase content, via increased actomyosin ATPase activity could be responsible for the changes in contractility.     

白三烯D4在促进培养的人气管 平滑肌细胞增殖中的作用

目的和方法:研究白三烯D₄(LTD₄)是否剌激培养的人气管平滑肌细胞(ASMC)增殖。将分离的人ASMC进行传代培养,在培养基中加入各种浓度的LTD₄,计数细胞并测定 [³H]-胸腺嘧啶核苷([³H]-TdR)掺入量和三磷酸肌醇(IP₃)累积量。结果: LTD₄在一定范围内(0.1 nmoL·L^-1~10 nmoL·L^-1)以浓度依赖的方式增加人ASMC(P＜0.01)。LTD₄也增加[³H]-TdR的掺入量和IP₃累积量(P＜0.01)。磷脂酶C抑制剂新霉素(1 μmol·L^-1)阻止IP₃累积量的增加(P＜0.01)。结论:LTD₄剌激培养的人ASMC增殖并且可能在哮喘的气道重塑中起了作用。