儿童下呼吸道人类偏肺病毒感染的临床流行特征

目的 了解儿童人类偏肺病毒（hMPV）呼吸道感染的流行情况及临床特征。方法 收集2004年8月-2005年1月我院452例急性下呼吸道感染儿童的呼吸道分泌物标本，采用直接免疫荧光抗体法检测呼吸道合胞病毒、流感病毒甲型和乙型、副流感病毒1～3型和腺病毒，以上病毒检测阴性的245份标本再用逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）检测hMPVM基因，随机挑选部分PCR扩增产物送核苷酸测序作基因分析。结果 245份标本中hMPV阳性例数为59例（241％），452例患儿中单一hMPV感染率13．1％。冬季月份中hMPV检出数高于其他呼吸道病毒。59例hMPV感染患儿，平均月龄27．7月，各年龄组hMPV检出率差异无显著性（P〉0．05）。hMPV感染者临床特征与其他呼吸道病毒感染无明显差异（P〉0．05）。23份hMPVM基因部分核苷酸片段与GenBank中hMPV M基因序列同源性为82．8％～100％，基因进化树分析提示存在2种不同的hMPV基因。不同hMPV基因型感染者的临床表现差异无显著性（P〉0．05）。结论 hMPV是2004年冬季我院儿童下呼吸道感染流行的病毒病原，临床表现无特征性，2种不同基因型感染的临床特征也相似。     

杭州地区2009甲型H1N1流感重症患儿中人类偏肺病毒感染状况研究

目的了解杭州地区2009甲型H1N1流感（以下简称甲流）重症患儿中人类偏肺病毒（hMPV）的感染状况。方法采集2009年11月至2010年1月确诊为甲流重症患儿的呼吸道样本79份,用传统逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量RT-PCR方法检测hMPV及其他呼吸道病毒。选择hMPV阳性样本PCR扩增产物进行核苷酸测序,将所测序列与GenBank比对分析,并绘制基因进化树。结果79份甲流病毒阳性样本中,hMPV及其它呼吸道病毒阳性率20．25％（16,79）,hMPV阳性PCR扩增产物4份,占甲流重症病例的5．06％（4,79）。其中3份hMPV阳性PCR扩增产物核苷酸序列相似性为99．1％～99．5％,与广东省流行株GD．165,泰国株155N及B1代表株高度相似,并且被GenBank收录。结论杭州地区确诊感染的2009甲型H1N1流感重症病例中存在与hMPV共同感染状况,且hMPV均为B1基因型。     

RHD基因测序方法的建立及其在弱D表型分子鉴定中的应用

目的 建立RHD基因的测序方法并对9例弱D表型作分子鉴定.方法用间接抗人球蛋白试验（IAT）筛选弱表达的D变异体,聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP）方法 扩增RHD基因特异的外显子及其侧翼序列,PCR产物直接序列分析测定核苷酸的变异.结果 用PCR-SSP方法特异扩增RHD基因,50份随机Rh阴性（ccdee）样本呈阴性结果,51例随机Rh阳性样本呈阳性结果.扩增产物测序结果表明,15份代表性Rh阳性单倍体型的RHD基因序列和标准序列一致.用所建立的方法对9份弱D表型样本进行测序分析,发现5份有845G＞A突变,3份有1 227G＞A突变,1例有1013T＞C突变.结论 所建立的RHD基因测序方法可以用于弱D的分子鉴定.9份弱D表型的分子机理得到明确.     

人偏肺病毒亚克隆的构建与鉴定

目的 从临床标本中扩增人偏肺病毒(hMPV)基因片段进行亚克隆,为进一步全面深入地研究人偏肺病毒奠定基础.方法 根据GenBank中已知的hMPV全基因序列设计引物.收集呼吸道感染住院患儿鼻咽抽吸物697例,提取病毒核酸,运用长片段RT-PCR技术扩增目的片段,切割含目的条带的凝胶进行纯化,并将目的片段连接到PJET1.2/blunt克隆载体,转化感受态细胞TOP10,经含氨苄青霉素的抗生素平板筛选,得到阳性克隆,提取质粒,最后对重组质粒进行PCR鉴定和测序鉴定.结果 随机选取5例所获的阳性条带经PCR和测序鉴定,证实确为hMPV基因片段.结论 成功构建了hMPV基因组亚克隆,可用于后续的实验研究.     

SYBR Green Ⅰ聚合酶链反应检测人白细胞抗原-DRB1*12

目的 建立一种人白细胞抗原(HLA)基因分型方法。方法 用序列特异性引物和荧光染料SYBR GreenⅠ聚合酶链式反应(PCR)方法，对1份已知HLA—DRB1*12的标本和12份未知型别的临床标本进行HLA—DRB1*12位点检测和分型。结果 12份标本的扩增产物经熔解曲线分析，有3份标本为DRB1*12，产物用离心柱纯化后，直接进行DNA测序，结果证实为DRB1*12阳性。结论 SYBR Green Ⅰ PCR操作简便，结果准确，可成为一种HLA基因分型的新方法。     

乙型肝炎病毒基因的巢式聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分型及初步应用

目的 用改进的乙型肝炎病毒(HBV)巢式聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR—RFLP)的基因分型方法初探广州地区HBV基因型分布状态。方法 设计巢式PCR扩增前S基因，经限制性内切酶AvaⅡ和DpnⅡ酶切鉴别HBV A—G基因型；并对140份乙型肝炎患者血清进行基因分型，其中随机挑选3份进行克隆测序，并对20份患者血清进行巢式PCR—RFLP重复分型试验，以验证此分型技术的稳定性和特异性。同时采用PCR和巢式PCR对92份乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)阴性血清进行HBV DNA阳性率检测比较。结果 基因分型与测序结果一致；基因分型重复试验符合率100％；92份HBeAg阴性血清经PCR和巢式PCR扩增HBV DNA的阳性率分别为20．7％和68．5％。140份乙型肝炎患者血清中HBV基因型以C型(94份)和B型(42份)为主，偶见A型(4份)。结论 巢式PCR—RFLP HBV基因分型方法具有良好的敏感性、特异性、稳定性，且操作简便，适用于临床和流行病学调查研究。     

PCR扩增产物磁珠纯化法应用于HLA测序分型的研究

目的 探讨PCR扩增产物磁珠纯化法应用于HLA测序分型的可能性.方法 采用本实验室建立的HLA-C基因测序分型方法 中的PCR扩增、测序反应和测序纯化等步骤,对96份标本特异性扩增HLA-C基因外显子1～4目的 序列片段约为2 000 bp,扩增产物分别采用OMEGA公司(瑞士)磁珠纯化法及USB公司(美国)的外切酶I...     

HLA-Cw基因测序分型的研究

目的 建立HLA-Cw位点测序分型技术,以用于无关供/受者HLA-Cw基因配型等基础应用研究.方法 对HLA-Cw位点的第2和第3外显子,设计、合成一对PCR引物和4条测序引物,探索最佳的PCR反应体系和扩增条件,采用PCR引物扩增HLA-Cw基因的第2、第3外显子和第2内含子,扩增产物经纯化后作为测序模板,进行4个测序反应,产物经酒精/EDTA/NaAc法纯化,用ABI PrismTM3100测序仪电泳检测,相关的分析软件分析HLA基因型.检测分型结果的可靠性采用基因型已知的U-CLA国际HLA室间质控的DNA样本进行验证.结果 检测6例UCLA国际HLA室间质控的DNA样本,HLA-Cw等位基因型与UCLA公布的结果完全一致.结论 本文的HLA-Cw基因测序分型方法准确、可靠,具有广泛的应用前景.     

深圳汕头地区呼吸道感染患儿人偏肺病毒的检出及病原学初步研究

目的：了解人偏肺病毒（hMPV）在深圳汕头地区的感染情况及临床特征。方法收集2010年10月～2012年6月呼吸道感染住院患儿及健康体检儿童鼻咽抽吸物及咽拭子标本共1217例,采用 RT-PCR方法对其进行 hMPV基因筛查,随机选取5份扩增阳性产物进行核酸测序,将所得序列与 GenBank中的序列进行比较和进化树分析。同时,对阳性标本的临床资料进行分析。结果1137份感染患儿标本中检测到hMPV 51份（阳性率4.49％）,2,3,4月为发病高峰,感染患儿主要在3岁以下,占检出率的80.4％,5份阳性标本基因序列与 GenBank 中公布的多株 hMPV N 基因同源性达80.8％～98.4％。进化树分析显示分属于两个不同的基因进化族。51例阳性患儿临床症状均表现为发热、咳嗽、喘息,临床诊断主要为支气管肺炎24例,喘息型肺炎17例,毛细支气管炎9例,上呼吸道感染1例。80例健康体检儿童的呼吸道标本均未检测到 hMPV特异基因片段。结论 hMPV是引起深圳汕头地区3岁以下儿童呼吸道感染的重要病原体之一,并有一定的季节性,其感染无特异的临床表现。流行的 hMPV株存在两种不同基因型。     

天津地区住院腹泻儿童轮状病毒的检测及其毒株型别分析

目的 了解天津地区5岁以下住院腹泻患儿A组RV的感染情况及其型别特点.方法 收集天津市儿童医院2008年5月至2009年4月837份住院腹泻患儿的粪便标本,用胶体金免疫层析法快速检测A组RV抗原,将检测阳性的标本进行细胞培养,产生细胞病变(CPE)后,提取病毒RNA,RT-PCR扩增病毒VP7基因,并将PCR产物阳性标本测序,证实其VP7(G)血清型.同时收集其临床相关资料.结果 837份标本RV抗原阳性率为26.3%(220/837);90.5%(199/220)的RV腹泻发生在24月龄以下患儿;发病高峰时间主要集中在2008年10月至2009年4月;208份接种的RV抗原阳性标本中,病毒分离后用PCR鉴定阳性95份,对其中35份电泳较好的PCR产物阳性标本作序列分析,除1份为G9型、2份为G3型外,其余均为RV G1型.结论 RV是天津地区婴幼儿腹泻的重要病原,流行的基因型以G1为主.     

Genotype variability and clinical features of human metapneumovirus isolated from Korean children, 2007 to 2010

This study was undertaken to determine the genotype variability of human metapneumovirus (hMPV) and its circulation pattern over a 3.5-year period, and to evaluate its clinical characteristics in Korean children. We investigated 4599 pediatric patients who were referred for a routine respiratory virus test by RT-PCR. hMPV genotype analyses were performed using a nested PCR-restriction fragment length polymorphism assay. Clinical and laboratory data obtained from medical records were reviewed retrospectively. Of the 4599 samples tested, 325 (7.1%) were positive for hMPV, and the co-infection rate among these 325 was 16%. Nested PCR-restriction fragment length polymorphism analysis clearly identified four of the five hMPV genotypes (A2a, A2b, B1, and B2) in 97.8%. The predominant genotype of hMPV changed over the 3.5-year study period from genotype A2a to B2 and then back to A2a. The most common genotype was A2a (214/325, 65.8%). Evidence of recurrent infection was obtained in one child only. Lymphocytosis was more frequent in children with a co-infection, but sputum production was less frequent than in children with a single infection. In genotype A2a hMPV-infected children, sneezing and neutrophilia were more frequent than in genotype B1 or B2 hMPV-infected children. This study broadens knowledge regarding the prevalence, the seasonal incidence, the occurrences of co-infection and re-infection, and the genotype diversity of hMPV in Korea.     

Genotyping of hepatitis B virus (HBV) by oligonucleotides microarray

Oligonuleotides (oligo) microarray is a promising method for virus genotyping. In this study, we developed an oligo microarray used for genotyping hepatitis B virus (HBV). It consists of 15 probes targeting HBV genotypes A-G and two genotypes of apes, and one conserved probe selected from the HBV pre-S region. To test a clinical sample, the gene targets of clinical samples were amplified and labelled with Cy5-dCTP in a PCR reaction using primers covering the flanking region of the HBV pre-S gene. Following purification, the labelled PCR products were hybridized to the microarray. In an analysis of 96 HBV patients' serum samples using our developed microarray, we identified 34 genotype B, 60 genotype C and 2 genotypes B/C coinfection samples. Sequencing results of 24 randomly selected samples agreed 100% with microarray data. Geographic distribution of genotypes C and B was also divergent, 95.7% (44/46) of genotype C and 64.0% (32/50) of genotype B samples were collected from Northern and Southern China, respectively. The accuracy of genotyping was confirmed by analyzing DNA sequences of 24 samples. It is demonstrated that low-density oligo microarray can serve as a reliable and time-saving method to HBV genotyping from patient's sera.     

人乳头瘤病毒基因分型质控品的建立

目的 建立HPV基因分型质控品.方法 收集宫颈脱落细胞标本300份,通过表面等离子谐振法和测序法检测标本型别,根据GenBank中参考序列设计各型别L1基因扩增引物,通过PCR扩增、连接转化构建包含不同型别L1基因重组质粒,通过30个重组质粒PCR鉴定和序列测定,并将测定序列用BLAST软件进行比对.结果 收集的标本包含了HPV 6、16、18等30种不同型别HPV感染.PCR扩增片段大小和设计引物扩增片段长度相符,除了HPV CP8304外,其余型别均在1 500～2 000 bp之间.重组质粒PCR鉴定与目的 片段相符,测序结果 与GenBank中的参考序列一致性在99%以上,在碱基数为1 500 bp的比对序列中不一致碱基数为11个.结论 建立了30种不同型别HPV L1基因分型质控品,覆盖了所有最常见型别,涵盖了14种高危型、3种中危型和13种低危型.     

人乳头瘤病毒基因分型质控品的建立

目的 建立HPV基因分型质控品.方法 收集宫颈脱落细胞标本300份,通过表面等离子谐振法和测序法检测标本型别,根据GenBank中参考序列设计各型别L1基因扩增引物,通过PCR扩增、连接转化构建包含不同型别L1基因重组质粒,通过30个重组质粒PCR鉴定和序列测定,并将测定序列用BLAST软件进行比对.结果 收集的标本包含了HPV 6、16、18等30种不同型别HPV感染.PCR扩增片段大小和设计引物扩增片段长度相符,除了HPV CP8304外,其余型别均在1 500～2 000 bp之间.重组质粒PCR鉴定与目的 片段相符,测序结果 与GenBank中的参考序列一致性在99%以上,在碱基数为1 500 bp的比对序列中不一致碱基数为11个.结论 建立了30种不同型别HPV L1基因分型质控品,覆盖了所有最常见型别,涵盖了14种高危型、3种中危型和13种低危型.     

实时荧光聚合酶链反应检测HBV基因型方法的建立和临床研究

目的 建立实时荧光聚合酶链反应（PCR）检测乙型肝炎病毒（HBV）基因型方法并对检测的慢性乙型肝炎（CHB）患者基因型进行临床分析。方法 根据GenBank中已发表的明确分型的143株HBV全序列，设计特异的组合引物探针，建立实时荧光PCR方法，检测128例慢性乙型肝炎患者基因型；同时检测HBVDNA、HBV-M。结果 （1）128例标本中B型检出率为20．3％（26／128），C型占71．9％（92／128），D型占7．8％（10／128）；18株HBV克隆标本S基因测序结果与本分型法完全一致。（2）男性与女性的HBV基因型构成比无明显差异（P=0．561）。B型与C型比较，C基因型HBVDNA含量（P〈0．05）和HBeAg阳性率（P〈0．01）明显高于B基因型。基因型B具有更高的HBeAb水平（P〈0．05）。结论 （1）实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法能够简便、灵敏、快速、准确地鉴定HBV基因型。（2）HBV基因型主要以C型为主，其次为B型、D型。在CHB患者中，性别不是基因型构成差别的因素，C基因型易引起较重的肝脏病变，B型易发生免疫逃逸，致病情较轻。     

人乳头瘤病毒基因分型质控品的建立

目的 建立HPV基因分型质控品.方法 收集宫颈脱落细胞标本300份,通过表面等离子谐振法和测序法检测标本型别,根据GenBank中参考序列设计各型别L1基因扩增引物,通过PCR扩增、连接转化构建包含不同型别L1基因重组质粒,通过30个重组质粒PCR鉴定和序列测定,并将测定序列用BLAST软件进行比对.结果 收集的标本包含了HPV 6、16、18等30种不同型别HPV感染.PCR扩增片段大小和设计引物扩增片段长度相符,除了HPV CP8304外,其余型别均在1 500～2 000 bp之间.重组质粒PCR鉴定与目的 片段相符,测序结果 与GenBank中的参考序列一致性在99%以上,在碱基数为1 500 bp的比对序列中不一致碱基数为11个.结论 建立了30种不同型别HPV L1基因分型质控品,覆盖了所有最常见型别,涵盖了14种高危型、3种中危型和13种低危型.     

反义核酸抑制PCR荧光检测乙型肝炎病毒S基因145位密码子变异株及其临床应用

目的 建立一种反义核酸抑制PCR荧光检测方法,对临床标本乙型肝炎病毒(HBV)S基因G145R/A变异株进行检测.方法 依据HBV S基因587和588位核苷酸变异设计PCR DNA扩增引物,并增加一条反义野生型引物.使其遇到野生型(不含G145R/A基因变异)核苷酸序列时不能扩增,PCR扩增被抑制,而遇到突变型核苷酸序列时能扩增,并以荧光显示G145R/A突变.结果 使用突变型DNA引物进行PCR DNA扩增,对质粒DNA和HBV临床标本进行检测,检出G145R/A突变标本12份,对此12份标本采用ELISA法检测HBsAg和HBsAb,结果均为阳性.结论 该方法简便、准确,可用于临床筛查G145R/A变异株检测.     

温州地区乙型肝炎病毒基因型分布调查及意义

目的调查乙型肝炎病毒(HBV)感染者的HBV基因型分布,探讨HBV基因型与临床的相关性。方法用SP-nPCR法检测469例HBV感染者的HBV基因型,用荧光定量PCR法检测HBVDNA载量,用ELISA法检测HBV血清学标志物。结果469份标本分出基因型430例,HBV基因型分布为:A型2.6%(11/430),B型34.9%(150/430),C型49.8%(214/430),B/C型12.8%(55/430),未检出D、E、F基因型;无症状携带者(ASC)和慢性乙肝患者(CH)以C、B基因型为主,肝硬化(LC)和肝癌(HCC)以C基因型占绝对优势。基因型分布与性别无关。30岁以下人群感染以B基因型为主,30岁以上则以C基因型为优势。结论SP-nPCR法适用于慢性HBV感染者(病人和携带者)的基因分型和流行病学调查。HBV感染以C、B基因型为主,存在B/C混合基因型和A基因型。C基因型感染与肝硬化和肝细胞癌相关。     

徐州地区急性呼吸道感染患者中人偏肺病毒的检测

目的在本实验室建立一种敏感有效的人偏肺病毒(hMPV)的检测方法、了解徐州地区急性呼吸道患者中人偏肺病毒hMPV的感染情况,分析徐州地区hMPV感染人群的流行病学特点及hMPV感染的临床特征,为hMPV的研究提供一些依据。方法在医院呼吸科门诊就诊的急性呼吸道疾病患者(RTI)中采集咽拭标本,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测hMPV的核蛋白N基因,并对扩增产物进行基因序列的测定后将之与GemBank的hMPV的全序列进行比对。结果2005年1月至2005年3月的75份标本用RT-PCR的方法检测后,确定有12份标本为N基因阳性,检出率为16.0%,扩增产物均经基因序列分析比对。结论徐州地区的急性呼吸系统疾病中存在hMPV感染,且在徐州地区急性呼吸系统疾病中约有16.0%的患者是由hMPV感染引起,其中6岁以下儿童占50%,这些hMPV感染患者的临床症状主要表现为:高烧、咳嗽。