RBM5 基因表达载体构建、稳定转染A549 细胞系的建立及功能的初步研究

目的：通过构建表达载体、建立稳定转染RNA结合基序5(RNA binding motif 5,RBM5)的A549细胞系, 初步研究RBM5基因过表达对A549 细胞增殖以及天冬-谷-丙-组氨酸盒多肽15[DEAH box polypeptide 15,DHX15]表 达的影响。方法：应用分段克隆法构建pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体;将测序验证后的重组质粒pcDNA3.1(+)/ RBM5转染肺腺癌A549细胞并以G418进行筛选,采用Western印迹鉴定RBM5基因过表达阳性细胞,流式细胞仪分别 检测经pcDNA3.1(+)/RBM5稳定转染的A549细胞[pcDNA3.1(+)/RBM5-A549]及pcDNA3.1(+)空白质粒转染的A549细胞 [pcDNA3.1(+)-A549]的周期分布;运用RT-PCR技术分别检测pcDNA3.1(+)/RBM5-A549和pcDNA3.1(+)-A549细胞中剪 接相关因子DHX15的表达情况。结果：成功构建出pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体,筛选出RBM5基因稳定转染过 表达阳性细胞株;pcDNA3.1(+)/RBM5-A549较pcDNA3.1(+)-A549细胞处于G1期细胞比例增大、S期细胞比例减小(均 P<0.01);cDNA3.1(+)/RBM5-A549较pcDNA3.1(+)-A549细胞的DHX15表达上调(P<0.01)。结论：成功构建重组质粒 pcDNA3.1(+)/RBM5,并建立了RBM5稳定转染的A549细胞系;初步证实RBM5基因过表达可抑制肺腺癌A549细胞的细 胞周期,并使DHX15表达上调。     

pcDNA3.1-Annexin A1真核表达载体对结直肠癌细胞迁移、侵袭的影响

目的探讨Annexin A1对结直肠癌细胞迁移、侵袭能力的影响。方法构建重组质粒pcDNA3.1-AnnexinA1,转染至结直肠癌细胞株SW480中,G418筛选稳定表达株,实时荧光定量PCR、蛋白质印迹检测转染前后Annexin A1mR-NA及蛋白表达;以空载体转染组及未转染SW480细胞作为对照,通过划痕修复实验和Transwell细胞侵袭实验对转染前后细胞的迁移和侵袭能力进行比较观察和分析。结果成功构建重组质粒pcDNA3.1-Annexin A1载体;实时荧光定量PCR和蛋白质印迹检测结果均显示,重组体pcDNA3.1-Annexin A1稳定转染细胞株中Annexin A1mRNA及蛋白表达均明显高于空载体转染及未转染组细胞(P<0.01),而后两者间比较差异无统计学意义(P>0.05);重组体pcDNA3.1-Annexin A1转染组SW480细胞的迁移率(0.415±0.002)明显高于空载体转染组(0.267±0.003)及未转染组细胞(0.271±0.002),差异具有统计学意义(P<0.05),而后两者间差异无统计学意义(P>0.05);与空载体转染组(162.80±12.07)及未...     

抑癌基因ING2真核表达质粒的建立及其对肺癌细胞生长的影响

目的 构建抑癌基因生长抑制因子2(ING2)真核表达载体,研究p33ING2对人肺腺癌细胞A549及人小细胞肺癌细胞NCI-H446体外生长的影响.方法 构建ING2基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-ING2,采用脂质体法分别转染A549和NCI-H446细胞,以未转染组和转染pcDNA3.1(+)空质粒组作为对照,应用RT-PCR、细胞免疫组化和Western blot法分析目的基因及其蛋白表达,CCK8试剂盒分析其对细胞生长的影响,Annexin V-FITC和PI双染流式细胞术观察细胞凋亡的情况.结果 成功构建了重组真核表达载体pcDNA3.1(+)- ING2,转染后细胞株高水平表达ING2 mRNA及p33ING2蛋白.CCK8法检测结果显示:转染pcDNA3.1(+)-ING2的A549细胞和NCI-H446细胞增殖受到抑制,抑制率与pcDNA3.1(+)空质粒转染组比较,差异有统计学意义(P<0.01).流式细胞术凋亡检测结果显示:转染pcDNA3.1(+)-ING2的A549细胞和NCI-H446细胞组凋亡率均高于未转染组和pcDNA3.1(+)空质粒转染组,差异均有统计学意义(P<0.01).结论 ING2蛋白表达能抑制人肺腺癌细胞A549和人小细胞肺癌细胞NCI-H446增殖及增加细胞凋亡率.     

细胞膜上稳定表达融合蛋白CRT/vGPCR A549细胞株的建立

目的 将人钙网蛋白(calreticulin,CRT)基因与病毒G蛋白偶联受体(virus G-protein couple receptor,vGPCR)基因进行基因重组,用此重组基因建立细胞膜上稳定高表达CRT/vGPCR融合蛋白的人肺癌A549细胞株.方法 从pSG5-vGPCR质粒中获得全长vGPCR基因片段并与CRT全长编码序列的3′端连接形成融合基因,然后将融合基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中.用此质粒转染人A549肺癌细胞,通过G418筛选建立稳定转染的A549细胞株,用RT-PCR检测重组融合基因的表达,用细胞免疫荧光分析鉴定融合蛋白的表达及其在细胞膜上的定位.结果 成功获得重组融合质粒pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR,经DNA序列测定证实融合基因两阅读框(ORF)对接无误.将上述质粒转染A549细胞后,建立了稳定转染CRT/vGPCR的A549细胞株,融合基因在A549细胞中表达并定位到细胞膜上.结论 通过与CRT基因融合重组,具有膜定位能力的vGPCR能将CRT蛋白高效包被到肿瘤细胞膜上.     

黄芩总黄酮对甲型流感病毒核蛋白表达的影响

目的探讨黄芩总黄酮(Total flavonoids of Scutellaria baicalensis Georgi,TFSB)对甲型流感病毒核蛋白(NP)的干预作用。方法本实验设HeLa细胞组、pcDNA3.1(+)空载体组、pcDNA3.1(+)/NP组、TFSB组,其中pcDNA3.1(+)空载体组、pcDNA3.1(+)/NP组分别通过瞬时转染将重组质粒pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)/NP转染到HeLa细胞中;TFSB组在将重组质粒pcDNA3.1(+)/NP转染到HeLa细胞的同时使用TFSB进行药物干预。转染48 h后,采用胶体金免疫层析试纸法测维持液中NP的表达,荧光定量RT-PCR测NP基因起始核酸量。结果胶体金免疫层析试纸法测NP表达示:pcDNA3.1(+)/NP组、TFSB组为阳性;荧光定量RT-PCR示:pcDNA3.1(+)/NP组和TFSB组NP基因起始拷贝数分别为(8.90±2.53)×106copies/μl、(6.15±1.49)×106copies/μl,采用t检验进行统计学分析:差异无统计学意义(P>0.05)。结论黄芩总黄酮对甲型流感病毒NP基因和NP的表达没有影响。     

YAP对非小细胞肺癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的：探讨长链非编码RNA （lncRNA） MALAT1在YAP调控的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞增殖和迁移中的作用,并阐明其作用机制。方法：选择A549和H1299细胞系分为Scramble siRNA组（转染Scramble siRNA）、siYAP-1组（转染siYAP-1）和siYAP-2组（转染siYAP-2）。RT-PCR和Western blotting法检测各组细胞中YAP和MALAT1mRNA及YAP蛋白表达水平;在A549和H1299细胞中分别转染pcDNA3.1-YAP质粒（pcDNA3.1-YAP组）、共转染pcDNA3.1-YAP质粒和siMALAT1-2（pcDNA3.1-YAP+siMALAT1-2组）及对照质粒（pcDNA3.1-YAP+Scramble siRNA组）,CCK-8法检测各组细胞增殖能力,细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力。结果：siYAP-1组和siYAP-2组A549和H1299细胞中YAP mRNA及蛋白表达水平均明显低于Scramble siRNA组（P<0.05）,siYAP-1组和siYAP-2组A549和H1299细胞中MALAT1mRNA表达水平低于Scramble siRNA组（P<0.05）;与pcDNA3.1-YAP组比较,pcDNA3.1-YAP+siMALAT1-2组A549和H1299细胞增殖能力降低（P<0.05）,H1299细胞迁移能力降低（P<0.05）。结论：在NSCLC细胞中,YAP通过调控lncRNA MALAT1的表达促进细胞的增殖和迁移。     

miR-210靶基因HBVSP2的鉴定

目的：构建miR-210的过表达载体,利用双荧光蛋白报告基因分析系统验证miR-210的靶基因HBVSP2。方法：构建含有miR-210前体序列的miR-210的过表达质粒pcDNA3.1(+)/pri-miR-210;选取表达绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒 pcDNA3/EGFP,将miR-210在HBVSP2上靶位点的一段特异性序列插入该质粒中,构建EGFP报告载体pcDNA3/EGFP-HBVSP2,并与miR-210ASO或者pcDNA3.1(+)/pri-miR-210及表达红色荧光蛋白质(RFP)的pDsRed2 -N1共同转染HEK293以及HepG2 2215细胞,用荧光分光光度计定量检测转染后提取的蛋白样品的荧光值。结果：共同转染pcDNA3/pri-miR-210 和pcDNA3/ EGFP-HBVSP2质粒后,EGFP/RFP的表达量明显低于pcDNA3和pcDNA3/ EGFP-HBVSP2共转染组,差异具有统计学意义(P<0.05)。pcDNA3/pri-miR-210和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组EGFP/RFP低于pcDNA3和pcDNA3/EGFP-HBVSP2共转染组(P<0.05)。共转染miR-210ASO和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组EGFP/RFP的表达量高于共转染LacZ和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组,差异具有统计学意义(P<0.05)。LacZ和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组EGFP/RFP低于LacZ和pcDNA3/EGFP组(P<0.05)。结论：成功构建miR-210的过表达质粒pcDNA3.1(+)/pri-miR-210和含有miR-210靶位点的pcDNA3/ EGFP-HBVSP2,HBVSP2 可能是miR-210的直接靶基因。     

TGFB1抑制A549细胞增殖的分子机制研究

①目的 构建并鉴定TGFB1真核表达载体pcDNA3.1/TGFB1,探讨TGFB1抑制A549细胞增殖的可能机制.②方法 采用基因重组技术将TGFB1 CDS 插入真核表达载体pcDNA3.1 (+),构建TGFB1真核表达质粒.脂质体介导转染肺癌细胞A549,分为正常对照、空质粒及转染组.MTT和集落形成实验检测各组细胞活性和细胞增殖能力.Real-time- PCR及Western blot方法 检测各组中TGFB1、p53、Bax和Fas的mRNA和蛋白的表达水平.③结果 酶切和测序结果 证实TGFB1真核表达质粒构建成功.MTT和集落形成实验结果 显示pcDNA3.1/TGFB1转染组、细胞活性和细胞增殖能力明显降低(P<0.01).pcDNA3.1/TGFB1转染组与正常对照组、空质粒组比较:TGFB1、p53、Bax和Fas mRNA表达显著增加(P<0.01);TGFB1、p53、Bax和Fas蛋白的表达水平显著增加(P<0.01).④结论 TGFB1可能通过上调p53、Bax和Fas蛋白的表达抑制肺癌细胞A549的增殖.TGFB1有可能成为肿瘤生物治疗的靶点.     

自噬基因Beclin1对上皮性卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用

目的 观察自噬基因Beclin 1在人卵巢癌细胞株SKOV3中过表达对肿瘤细胞在体内、体外生长活性的影响.方法 脂质体法将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染人卵巢癌细胞株SKOV3,MTT法分析外源性Beclin1过表达对SKOV3增殖的影响,流式细胞仪检测转染后肿瘤细胞的凋亡及自噬情况.将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后,接种到裸鼠皮下,观察体内致瘤活性及生长情况;免疫组化检测瘤组织Beclin1蛋白的表达.结果 Beclin 1在SKOV3中的过表达后抑制肿瘤细胞在体外的生长,抑制率为58.68%;pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3的凋亡率为(21.26±3.89)%,高于空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组,差异有显著性(P<0.05);流式细胞仪检测pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞MDC平均荧光强度高于pcDNA3.1转染组和未转染组.重组质粒pcDNA3.1/Beclin1使SKOV3细胞在裸鼠体内成瘤时间延长,瘤体体积及质量明显小于空质粒组和空白对照组,抑瘤率为50.27%.结论 自噬基因Beclin1在人卵巢癌细胞SKOV3中过表达可抑制SKOV3在体内、体外的增殖,针对自噬基因Beclin1的卵巢癌基因治疗可能具有可行性.     

带新霉素抗性的萤光素酶报告载体的构建

目的:构建带新霉素抗性的萤光素酶报告载体.方法:设计扩增新霉素抗性基闪neo,克隆人萤光素酶报告载体pGL3,得到pGL3-neo.分别比较pGL3、pGL3-CMV promoter瞬时转染组和经G418筛选的pGL3-neo、pGL3-neo-CMV promoter稳定转染组细胞萤光素酶活性.结果:PCR扩增出neo表达单元;酶切和DNA测序分析鉴定得到带新霉素抗性的萤光索酶报告质粒pGL3-neo.G418筛选可获得稳定转染pGL3-neO)细胞株和稳定转染pGL3-neo-CMV promoter的细胞株.荧光检测显示:瞬时转染pGL3组、pGL3-CMV promoter组及稳定转染pGL3-neo组、pGL3-neo-CMV promoter组萤光素酶活性值分别为1 047±86、1 504±107和34 819±l 479、456 109 4±15 791,稳定转染组萤光素酶活性均高于瞬时转染组,P<0.05.结论:成功构建了带新霉素抗性的萤光素酶报告基因载体,使报告基因检测数据的敏感性和可靠性显著提高.     

Inhibitory activity of nuclear factor-κB potentiates cisplatin-induced apoptosis in A549 cells

Whether inhibiting the activity of nuclear factor （NF）-κB potentiates cisplatin-induced apoptosis in non-small cell lung cell line A549 cells was investigated. The recombinant plasmid pcDNA3.1（＋）/IκBα expressing IκBα was constructed. The in vitro cultured A549 cells were transfected with pcDNA3.1 （＋）/IκBα alone, or pcDNA3.1（＋）/IκBα combined with cisplatin. The mitochondrial membrane potential （△ψm） was determined by rhodamine 123, the activity of caspase-3 was tested by colorimetric assay, and cell apoptosis was detected by flow cytometry with the annexin V/propidium iodide assay. The results showed that the activity of NF-κB in A549 cells was inhibited by transfecting pcDNA3.1（＋）/IκBα. Transfection of pcDNA3.1（＋）/IκBα alone did not promote apoptosis. Treatment of cisplatin alone had a little effect on cell apoptosis. Transfection of pcDNA3.1（＋）/IκBα combined with cisplatin treatment significantly induced apoptosis of A549 ceils. It was concluded that inhibiting the activity of NF-κB potentiated cisplatin-induced apoptosis of A549 cells.     

PGC-1α辅助激活人PEPCK基因转录

 【目的】构建人磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因启动子荧光素酶报告质粒PGL3-hPCK-luc,并探讨过氧化物酶体增殖物活化受体γ辅助激活因子1α(PGC-1α)在转录因子肝细胞核因子4α(HNF4α)介导下对人PEPCK基因启动子活性的影响。【方法】从人全血基因组DNA中克隆PEPCK启动子基因片段,并重组进荧光素酶报告载体PGL3-basic,将pcDNA3.1-PGC-1α、pcDNA3.0-HNF4α表达质粒与PGL3-hPCK-luc按不同组合共转染进人肝癌细胞株HepG2细胞或正常人肝细胞株LO2细胞,培养48 h后检测细胞裂解液中荧光素酶活性。【结果】通过酶切鉴定及测序证明扩增的人PEPCK启动子片段成功插入载体质粒中。转染后人PEPCK启动子基因荧光素酶活性较空白对照组增加60倍(P < 0.05);共转染质粒进HepG2细胞或LO2细胞后,HNF4α均可以增强人PEPCK启动子基因荧光素酶活性,在HepG2细胞,荧光素酶活性是对照组的2.69倍(P < 0.05),而在LO2细胞中,荧光素酶活性是对照组的3.64倍(P < 0.05);PGC-1α可以明显增强HNF4α对人PEPCK启动子的激活作用,在HepG2细胞,荧光素酶活性是PGL3-HPCK-luc+HNF4α组的2.01倍(P < 0.05),而在LO2细胞中,荧光素酶活性是PGL3-HPCK-luc+HNF4α组的2.82倍(P < 0.05)。而与单一转染组相比,共转染pcDNA3.1-PGC-1α与pcDNA3.0-HNF4α显著增加了PEPCK的mRNA和蛋白表达水平(P < 0.05)。【结论】人PEPCK启动子基因报告质粒成功构建,且转录因子HNF4α可以激活人PEPCK启动子活性,辅助激活因子PGC-1α可以进一步加强HNF4α的作用。     

pcDNA3．1（＋）／hTERT-tk真核表达质粒的构建及其在HepG-2细胞中的表达

目的：研究人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因核心启动子调控的人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／更昔洛韦（HSV-tk／GCV）系统对肝癌HepG-2细胞的体外杀伤作用。方法：构建hTERT基因启动子调控的tk基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）／hTERT-tk,用脂质体法分别转染肝癌细胞（HepG-2）和正常肝细胞（L-02）后给予更昔洛韦（GCV）,用TUNEL法观察自杀基因对肝癌细胞生长的影响。结果：HETRT启动子调控下的HSV-tk／GCV系统对肝癌HepG-2细胞有明显的杀伤作用,而对正常肝细胞则作用不明显。结论：hTERT-tk／GCV基因体系能够靶向杀伤肝癌细胞,有靶向治疗肝癌的潜力。     

Construction of eukaryotic expressing plasmids encodingHA andHA 1 of influenza A virus and their transient expression in HEK293 cells

Summary In order to explore the feasibility and protective efficiency of influenza DNA vaccine, we constructed eukaryotic expressing plasmids encodingHA andHA ₁ of influenza A virus (A/PR/8/34) and studied their expression in HEK293 cells.HA andHA ₁ genes were amplified by RT-PCR and cloned into pcDNA3. 1(+) to generate pcDNA3. 1(+)/HA and pcDNA3.1(+)/HA₁, respectively. After verification of the cloning fidelity by restriction endonuclease digestion, PCR, and sequencing, pcDNA3. 1(+)/HA and pcDNA3.1(+)/HA₁ were transfected into HEK293 cells using PolyFect Transfection Reagent. Immunofluorescence assay was used to detect the transient expressing cells. Fluorescence microscopy revealed strong expression of target gene in HEK293 cells transiently transfected with either pcDNA3.1(+)/HA or pcDNA3.1(+)/HA₁. Therefore, the results confirm the successful construction of eukaryotic expressing plasmids capable of driving the eukaryotic expression of influenza virus antigen HA and HA₁, which is likely to provide a basis for both further investigation of the mechanism of influenza viral infection and the development of influenza DNA vaccine. Zhang Weidong, female, born in 1970, M. D., Ph. D. This project was supported by a grant from the National Natural Sciences Foundation of China (No. 39970830).     

乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因载体的构建及表达

目的：构建乏氧（HRE）/辐射（Egr1）双敏感启动子介导的分泌型人TRAIL (shTRAIL)基因表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,观察乏氧和辐射对其表达的影响。 方法：利用化学合成HRE上、下链,PCR扩增得到双链HRE;pMD19T-Egr1经Sac Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切得到Egr1;pshuttle-shTRAIL 经Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切得到shTRAIL;利用基因重组技术构建含有HRE/Egr1双敏感启动子介导shTRAIL的表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,经酶切、PCR和测序鉴定正确。肺腺癌A549细胞分为正常组、乏氧组（1%）、照射组(6 Gy)和乏氧加照射组;表达载体转染肺腺癌A549细胞,RT-PCR及ELISA法检测shTRAIL的表达。结果：BamH Ⅰ和Sma Ⅰ酶切,所得片段大小分别为1 284和4 998　bp、2 292和3 990 bp;以Egr1和shTRAIL引物PCR扩增该载体,得到469和820 bp产物;将pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL进行测序,所得结果与设计一致,说明构建正确。转染肺腺癌A549细胞后,乏氧组、辐射组及乏氧加照射组shTRAIL mRNA和蛋白表达增加,与对照组比较差异有显著性（P<0.05）,且乏氧加照射组表达更明显。结论：成功地构建了乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因表达的载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL;乏氧及照射能够诱导TRAIL表达增加,且二者具有协同作用。     

JAB1对缺氧环境肺癌A549细胞化疗敏感性调控的研究

目的观察导入pcDNA3.1-HRE-JAB1真核表达质粒的肺癌A549细胞,在低氧环境下对健择(Gemzar)的化疗敏感性,以期找到一种提高肺癌化疗敏感性的方法。方法首先构建缺氧反应元件启动的pcDNA3.1-HRE-JAB1真核表达质粒,鉴定后将该质粒导入肺癌A549细胞。在低氧环境培养过程中加入化疗药物Gemzar,观察空白组(A549)、空载体组(A549+pcD-NA3.1-HRE)和质粒组(A549+pcDNA3.1-HRE-JAB1)肺癌A549细胞对Gemzar的敏感性。采用Real-time PCR和Westernblot分别检测各组肺癌A549细胞中JAB1的mRNA和蛋白表达水平;流式细胞术检测各组肺癌A549细胞周期分布和凋亡情况。结果通过双酶切鉴定,确定构建获得了pcDNA3.1-HRE-JAB1质粒。在有化疗药物Gemzar的情况下,质粒组分别与空白组或空载体组比较,质粒组肺癌A549细胞中JAB1mRNA和蛋白表达水平明显增加(P<0.01),细胞凋亡率明显增加(P<0.01),而细胞周期被明显阻滞于G1期(P<0.01)。结论 JAB1在低氧环境下高表达提高了药物Gemzar化疗的敏感性,这将可能成为一种理想的提高肺癌或其他实体恶性肿瘤化疗敏感性的手段。     

人端粒酶逆转录酶基因启动子区的克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因启动子区的真核表达载体。方法：用核酸内切酶NotⅠ和KpnⅠ酶切报告基因GFP,插入pcDNA3．1( )载体,得到pcDNA3．1( )-GFP(PG)载体;用PCR方法扩增hTERT基因ATG上游的启动子序列,测序后用核酸内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切插入PG载体,得到pcDNA3．1( )-GFP—hTERT(PGT)载体。将PGT载体转染人食管癌EC9706细胞系,经G418筛选,荧光显微镜下观察。结果：克隆得到的启动子序列与文献相符,重组载体经酶切鉴定方向正确,含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。经转染人食管癌EC9706细胞系,在荧光显微镜下观察到绿色的阳性克隆。结论：克隆的人端粒酶逆转录酶基因启动子序列在真核细胞中具有启动子活性。