菌丝霉素的高效表达、纯化及活性

将来自腐生子囊菌中的菌丝霉素成熟肽基因经大肠杆菌密码子优化后,克隆到pET32a(+)载体中,构建了含His-tag标签和TEV酶识别位点的菌丝霉素表达质粒pYG330,使含菌丝霉素的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式高效表达.建立了菌丝霉素的纯化路线,将融合蛋白进行TEV酶切后脱盐再进行亲和色谱分离,收集目的蛋白冻干浓缩,通过高效液相色谱进一步纯化获得纯度72％的目的多肽.纯化所得菌丝霉素对临床耐药金黄色葡萄球菌M-2和枯草芽孢杆菌有明显的抑菌活性.     

人C1q/TNFα相关蛋白-6的表达、纯化及生物活性分析

目的利用大肠杆菌表达可溶性h CTRP6蛋白并分析其活性。方法重组载体转化大肠杆菌表达菌株、IPTG诱导表达、纯化后测定活性。结果 Trx-h CTRP6蛋白在大肠杆菌中高效表达,经镍亲合纯化和分子筛纯化,Trx-h CTRP6在细胞和动物水平上都有生物活性。结论利用大肠杆菌表达系统高效制备了具有生物活性的Trx-h CTRP6蛋白。     

融合MBP标签的重组人CD137L蛋白可溶性表达与纯化

本课题组前期构建了偶联有肿瘤抑素T7肽和人CD137L胞外域的重组融合蛋白(rhTCD),兼具抑制血管生成和刺激T细胞激活活性,但其在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在。本研究将rhTCD与麦芽糖结合蛋白(Maltose-binding protein, MBP)的基因融合共表达,以提高其可溶性表达并进行纯化。构建N端带有组氨酸(6×His)和MBP双标签的rhTCD重组表达载体,将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)后在18℃0.5 mmol/L IPTG条件下诱导表达18 h,经Ni-NTA亲和层析法初步纯化后烟草蚀纹病毒蛋白酶(Tobacco etch virus, TEV)切割标签,再应用MBP亲和层析法纯化目的蛋白,通过银染和非变性凝胶电泳检测蛋白纯度、存在形式以及产量。SDS-PAGE电泳结果显示,融合His-MBP标签后目的蛋白rhTCD的可溶性表达量显著提高,以92.64%±4.24%的可溶性水平表达于上清中。Ni-NTA亲和层析纯化后,TEV蛋白酶高效切除了His-MBP标签。经MBP亲和层析纯化后,SDS-PAGE银染显示目的蛋白rhTCD纯度约为82.60%±0.63...     

蜂毒肽融合蛋白在裂殖酵母中的表达研究

将抗菌肽之一的蜂毒溶血肽(Melittin)基因序列定向克隆到表达载体pESP-2中,构建GST-Melittin融合蛋白。利用载体上严格受硫胺素浓度调控的启动子Pnmtl,采用先扩大培养后诱导表达的两步培养法,实现了融合蛋白在裂殖酵母Schizosaccharomyces Pombe中的异源表达。然后通过GST亲和层析法一步纯化得到融合肽。研究中1L培养液收集到约5g鲜活酵母菌,纯化得到400μg融合蛋白,融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot验证,表明蜂毒肽融合蛋白已在裂殖酵母中高效的表达,并可以通过GST亲和层析法得到有效纯化。初步的活性实验证明所获得Melittin蛋白对Escherichia Coli DH5α菌种有良好的抑菌效果。     

心肌肌钙蛋白Ⅰ的融合表达和分离纯化

目的研究人心肌肌钙蛋白(cTnⅠ)在大肠杆菌中稳定高效的融合表达和分离纯化,以满足临床诊断的需要。方法人cTnⅠDNA序列由pdf 5-cTnⅠ质粒经PCR亚克隆而得,然后将其插入pET32a(+)载体,构建成pET32a(+)-cTnⅠ表达质粒,以大肠杆菌BL21(DE3)为表达菌,在IPTG诱导下进行表达。结果硫氧还蛋白(TrxA)-cTnⅠ融合蛋白得到高效表达,并经金属螯合亲和色谱一步纯化得到目的蛋白质。试剂盒检测结果表明该重组蛋白质具有cTnⅠ免疫原活性。结论构建了pET32a(+)-cTnⅠ重组质粒,并在大肠杆菌中获得高效表达,为建立急性心肌梗死早期诊断试剂奠定了基础。     

蝎镇痛抗菌活性肽BmK AS的融合表达及蛋白切割

目的构建镇痛抗菌活性肽BmK AS原核融合表达载体,实现可溶性表达,获得重组活性肽BmK AS。方法利用本实验室已构建成功的pET 28a-AS质粒,设计引物经过聚合酶链式反应,将目的基因克隆至pET 32a载体中,构建融合表达载体pET 32a-AS,优化诱导表达条件,实现BmK AS在大肠杆菌BL21(DE 3)中的融合可溶性表达,通过金属离子螯合亲和薄层色谱法对重组蛋白进行初步分离纯化,获得重组融合蛋白后采用凝血酶进行切割去除纯化标签,经SDS-PAGE检测切割效果。结果成功构建重组表达质粒,优化得到低温诱导促进蛋白可溶性表达的方法;采用金属离子螯合亲和薄层色谱法获得重组蛋白;电泳结果表明凝血酶可以切割融合蛋白。结论实现活性肽BmK AS在大肠杆菌中的融合可溶性表达,经凝血酶切割后获得重组镇痛抗菌活性肽BmK AS,为后续药理活性研究奠定基础。     

人甲状旁腺素活性片段前体物Pro-Pro-hPTH(1-34)的制备及活性研究

目的制备出具有生物活性的人甲状旁腺素活性片段类似物,并对其活性进行考察。方法采用基因工程方法:大肠杆菌BL 21为宿主菌,pET 28a为表达载体,天门冬酰胺酶Ⅱ切除信号肽的C末端片段为融合伙伴,在融合伙伴和目的肽结合处引入Asp Pro酸敏感位点及二肽酶Ⅳ识别的N端Pro Pro位点,之后经诱导表达,酸水解使融合伙伴和目的肽分离。结果成功构建了hPTH(1 34)的融合表达体系,它能高效表达含hPTH(1 34)的融合蛋白,经纯化,得到多肽纯品,经鉴定,该多肽的分子量、氨基酸组成均与设计的分子相符,工程菌中用于编码该多肽的DNA片段其测序结果也与原设计相符,是表达该多肽的正确模板。该多肽在Parsons雏鸡分析及卵巢摘除大鼠模型试验中均显示显著活性。结论用基因工程方法成功地制备出人甲状旁腺素活性片段类似物,该产物具有显著生物活性及潜在的药用价值。     

重组TNF-α衍生物RMPT的制备及其抗肿瘤作用初步研究

利用基因重组技术制备具有抗肿瘤作用的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)衍生多肽RMPT,并研究其体外生物学效应。PCR方法合成RMPT基因序列,定向插入高效表达载体pTXB1-MCS,在大肠杆菌ER2566中诱导表达重组融合蛋白并建立RMPT融合蛋白诱导表达的优化体系。N端自动切割、纯化、HPLC制备获得RMPT,电泳和质谱鉴定其分子质量。CCK-8检测RMPT对肿瘤细胞的抑制作用。实验结果表明:重组工程菌可溶性RMPT融合蛋白最佳诱导表达条件为37℃、8 h、IPTG浓度0.75 mmol/L;DTT诱导蛋白内含肽自剪切固相纯化和HPLC制备重组肽RMPT,纯度大于95%,电泳和质谱鉴定其分子质量为3.7 ku,结果与理论值相符合,其产率为10.8 mg/L发酵液;体外研究表明,RMPT能够高效抑制多数肿瘤细胞增殖。     

人心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的:研究人cTnI基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化.方法:以pCOMb3-cTnI为模板,用PCR方法得到了编码该蛋白的基因,进一步将该基因克隆到中间载体pUCm-T,再酶切得到cTnI基因插入到pKL载体中,构建成表达质粒pKL-cTnI.在BL21细胞中经IPTG诱导表达,利用载体携带6×His纯化标签,以HisTrap Kit纯化重组蛋白,并进行免疫活性测定.结果:融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并用HisTrapKit成功纯化目的蛋白.ELISA分析证实该重组蛋白具有与天然心肌肌钙蛋白相似的免疫活性.结论:本研究为建立急性心肌梗死早期诊断试剂奠定了基础.     

重组鼠源角质细胞生长因子的发酵表达优化及纯化

通过正交实验优化了融合型小鼠角质细胞生长因子(rm-KGF)重组大肠杆菌的发酵和诱导表达条件。优化后的发酵培养基为:葡萄糖6g/L,酵母提取物10g/L,NH4Cl1.3g/L,磷酸盐1mol/L,MgSO4·7H2O0.6g/L。诱导表达条件为:以1mmol/LIPTG于菌体密度(A600)为1时诱导5h。在此条件下,分别经CM-SephadexG-50和HeparinSepharoseCL-6B两步纯化,所得融合rm-KGF经HPLC检测纯度约96%,每升发酵液可得约82mg纯化产品。     

杂合抗菌肽HMCM的原核表达及其活性鉴定

将哺乳动物抗菌肽(Hexapeptide)、两栖类抗菌肽(Magainin)、昆虫抗菌肽(Cecropin A和Melittin)的有效作用部分拼接在一起,以获得一种新型的杂合抗菌肽HMCM。根据HMCM氨基酸序列和大肠杆菌B细胞的密码子偏好性设计了HMCM的基因序列;将目的基因克隆到原核表达载体pET-32a-c(+),构建了重组表达载体pET-32a-HMCM;再转化原核表达菌株E.coli BL21(DE3)实现融合表达,通过摸索诱导时间、IPTG浓度、OD600和温度等条件确定了表达最佳条件,并确定了融合蛋白以可溶形式存在;通过亲和层析纯化了融合蛋白,并进行了Western-blotting鉴定;最后用EK酶酶切融合蛋白释放出HMCM,对HMCM的抗菌性进行了初步研究。结果表明HMCM对枯草芽孢杆菌有良好的抑菌作用。     

核心蛋白聚糖原核表达体系的构建

目的通过克隆核心蛋白聚糖(decorin,DCN)基因,构建原核表达体系并表达DCN蛋白。方法利用特异引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增编码DCN分子的外显子序列,与表达载体pET-21a(+)重组,构建原核表达体系pET-21a(+)-DCN的重组质粒。经双酶切、测序鉴定基因序列,将重组质粒转入E.coliBL21(DE3)中,用IPTG37℃诱导获得DCN融合蛋白。结果克隆了hDCN基因,成功构建了pET-21a(+)-DCN重组质粒,获得了稳定的pET-21a(+)-DCN原核表达体系,并得到了纯化的融合蛋白。结论建立了pET-21a(+)-DCN稳定的原核表达体系,表达并纯化了DCN。     

重组TGF β1在大肠杆菌中的表达、纯化

目的通过pET 43.1原核表达载体,表达重组人转化生长因子β1(human transform growth fac-tor,rhTGFβ1)。方法将人工整合了肠激酶作用位点的TGFβ1,插入到含有NusA蛋白的融合表达载体pET 43.1中。重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21(+)并用IPTG诱导表达。通过镍柱纯化重组蛋白,用Western blot杂交检测重组蛋白的免疫原性,用肠激酶酶切得到TGFβ1单体。结果 SDS-PAGE结果显示,相对分子质量约为70 000的融合蛋白大部分在上清中表达,目的融合蛋白量约占菌体总蛋白量的80%。取超声上清,通过His亲和色谱系统纯化目的融合蛋白,纯度质量分数为95%。肠激酶切割得到TGFβ1单体,经Western blot检测重组蛋白的免疫原性。结论人转化生长因子β1在大肠杆菌中实现了高效表达,获得了具有免疫原性的重组TGFβ1。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位表位融合肽在大肠杆菌中的表达与纯化

构建霍乱毒素B亚单位(CTB)与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位(Ure B)表位的融合肽表达载体pET-CtUBE,在E.coliBL21(DE3)中表达融合肽CtUBE。以霍乱弧菌基因组DNA为模板,PCR扩增CTB编码序列,克隆到表达载体pET-28a,获得新质粒pET-CTB;化学合成Ure B表位编码序列,克隆到pET-CTB获得CtUBE表达载体pET-CtUBE,并转化E.coliBL21(DE3),1 mmol/L IPTG诱导融合肽表达,阴离子交换色谱柱纯化融合肽CtUBE,ELISA分析CtUBE复性结果。结果获得了表达融合肽CtUBE的工程菌,诱导后融合肽表达量占菌体总蛋白34.7%,CtUBE纯化后纯度为95.6%,复性后融合肽可与GM1神经节苷脂和抗Ure B血清结合。实验成功构建了表达Ure B表位融合肽的工程菌,融合肽CtUBE保持了CTB生物活性和反应原性,纯度符合疫苗抗原要求,可以用于抗HP感染的疫苗研制。     

儿茶酚胺氧位甲基转移酶的克隆表达及纯化

目的将儿茶酚胺氧位甲基转移酶基因(COMT)克隆到原核表达载体进行可溶性表达,制备纯化COMT蛋白,为深入研究COMT的功能提供材料。方法运用分子生物学方法构建融合表达质粒Pet22b+-COMT。将Pet22b+-COMT转入E.coli BL21(DE3)表达菌株,利用IPTG诱导表达,并用亲和色谱纯化COMT。结果经测序分析成功构建了融合表达质粒Pet22b+-COMT。COMT基因在E.coli BL21(DE3)中表达相对分子质量约为28000的蛋白质,纯化后,COMT蛋白的纯度大于90%。结论COMT基因在原核中得到良好的表达,得到了纯度较高的蛋白质,为酶学活性研究奠定了基础。     

抗阿尔茨海默病神经保护肽[Gly14]-Humanin融合基因工程菌发酵工艺研究

目的优化大肠杆菌表达重组[Gly14]-Humanin(HNG)融合基因工程菌的发酵工艺。方法在15L发酵罐内,研究培养基、培养条件和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,并考察工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果工程菌在pH7.4的2×YT培养基中诱导5h,菌体湿重可达80g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的36%,所构建的重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。结论优化了HNG融合基因工程菌的发酵和表达条件,为药物中试研究和规模化生产奠定了基础。     

人甲状腺过氧化物酶抗原决定簇基因在E.coli细胞中的表达

目的：探索在E.coli BL21中表达hTPO抗原决定簇片段（AA568－AA874）。方法：将hTPO抗原决定族基因（1702－2622,编号相对于起始密码子）连接到表达型载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒。然后转化E.coli BL21,IPTG诱导表达。表达产物采用亲和层析方法纯化,SDS－PAGE法测定其分子质量,ELISA法鉴定免疫学活性,考马斯亮蓝染色法定量。结果：成功地表达了hTPO抗原决定簇基因。纯化的GST－hTPO融合蛋白分子质量为61.4ku,hTPO片段分子质量为37.6ku。以此作为抗原按ELISA法分别与TPOAb阳性血清或阴性血清反应,结果表明,GST－hTPO及hTPO片段均与TOPAb特异性结合。纯化的GST－hTPO产量为10mg/L培养基;hTPO片段产量为1.2mg/L培养基。结论：利用基因工程技术可获得高纯度的GST－hTPO融合蛋白及hTPO片段,产物具有良好的免疫学活性。     

人源热休克蛋白HSC70与HPV16型E7融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和活性检测

目的 克隆人热休克蛋白HSC70的N端具有ATPase活性的结构域(简称为A基因)与HPV 16型E7的融合基因,在大肠杆菌中表达,并纯化获得有生物活性的AE7融合蛋白.方法 利用PCR方法扩增获得A基因片段,插入原核表达载体pET29b中,再通过PCR方法扩增HPV 16型E7基因片段,插入A基因的3′端,构建原核表达质粒pET29b-AE7,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达产物经离子交换层析和金属螯合层析纯化后,在一定的剂量下皮下免疫小鼠,检测对HPV-16的E7基因感染的预防及治疗作用.结果 重组质粒pET29b-AE7经DNA序列测定确认.SDS-PAGE检测,表达产物分子量为66kD,大部分为包涵体.纯化后产物经SDS-PAGE电泳分析纯度>90%.纯化产物AE7在一定的剂量下皮下免疫小鼠,对HPV-16的E7基因的感染有预防及治疗作用.结论 AE7融合蛋白的获得为进一步临床研究奠定基础.     

N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的融合表达、纯化和酶活性

将菌株SS-ori的N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶基因(DCase)插入到pMAL-c2X载体中,构建表达产物为麦芽糖结合蛋白(MBP)与DCase融合的重组子。该重组子在E.coliBL21中的表达产物为融合蛋白MBP-DCase(76.4ka),光密度扫描表明,其表达量约占菌体超声后离心上清总蛋白的19%。经Amy-lose亲和纯化和Superose12凝胶排阻层析后达到了电泳纯。根据pMAL-c2X的背景,用FactorXa剪切后,可得约41.7ka的MBP和34.7ka的DCase。酶活性检测表明当用N-氨甲酰-DL-缬氨酸做为底物,A600=10时,每升菌体每小时可产生D-缬氨酸0.78g。     

乳铁素的融合表达及其体外抗菌活性鉴定

为降低乳铁素Lf-cinB表达时对宿主细胞的毒害,提高乳铁素的表达量及纯化效果,合成了牛乳铁蛋白肽基因,克隆至E.coli表达载体pTYB11中,构建了与蛋白质内含子(intein)的C端融合的表达载体pTYB11-cinB。重组质粒转化至E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,融合蛋白intein-cinB主要以可溶形式存在于胞内。利用载体中intein中的chitin结合域,将融合蛋白通过chitin亲和层析一步纯化,经DTT诱导in-tein的自我切割活性,实现Lf-cinB在亲和柱上的切割与分离,透析冻干后得到了纯度94%的重组Lf-cinB。活性检测结果显示,重组Lf-cinB对多种检测菌均有抗菌活性。研究认为,内含肽在抗菌肽的基因工程中具有重要的应用前景。