靶向survivin的siRNA对肝癌HepG2细胞增殖和转移能力的影响

目的探讨针对人survivin基因的siRNA对肝癌细胞HepG2的体内外抑制作用。方法合成survivin基因的RNA干涉（RNA interferance,RNAi）特异性片段,构建survivin特异性的RNA干涉载体pSiS,转染HepG2细胞,G418筛选稳定转染的细胞系。细胞计数检测细胞生长情况;Western blotting检测细胞中survivin蛋白表达的变化;通过AnnexinV法染色和流式细胞术检测细胞凋亡;观察裸鼠皮下HepG2移植瘤的形成。结果成功构建了survivin基因siRNA真核表达载体pSiS,获得了稳定转染的细胞HepG2／pSiS。与HepG2、HepG2／pSi（空质粒对照细胞）相比,HepG2／pSiS细胞生长曲线十分平缓,差异有统计学意义（P〈0．01）;Westernblotting显示,HepG2／pSiS细胞中survivin蛋白表达减少,细胞凋亡率增加（P〈0．01）。HepG2／pSiS移植瘤形成明显受到抑制。结论Survivin特异性siRNA可明显促进肝癌细胞HepG2的凋亡,抑制该肿瘤细胞体外生长和体内移植成瘤。     

RNA干扰对乳腺癌细胞骨桥蛋白基因表达抑制的研究

目的应用RNA干扰术靶向降低乳腺癌MCF-7细胞中骨桥蛋白基因（OPN）的表达水平,研究OPN基因对乳腺癌细胞增殖和侵袭性等生物学行为的影响。方法将设计合成的骨桥蛋白OPN序列特异性小分子干扰RNA（siRNA）,转染乳腺癌细胞株MCF-7,用逆转录PCR和蛋白印记杂交测OPN mRNA及蛋白水平的表达,通过生长曲线、克隆形成实验来检测细胞增殖及侵袭性情况的变化。结果OPN特异性siRNA转染后,骨桥蛋白mRNA及蛋白水平均明显下降,比色法显示转染组72h吸光度值为（0．21±0．06）与空白对照组（1．18土0．05）相比较明显受到抑制。转染组细胞克隆形成数为3．8个,较空白对照组（7．3个）及阴性对照组（7．1个）明显下降（P〈0．05）。结论乳腺癌MCF-7细胞中,针对OPN合成的siRNA能够有效地抑制骨桥蛋白的表达,从而显著抑制细胞的增殖和侵袭能力。     

siRNA沉默胃癌SGC-7901细胞COX-2基因对VEGF-C表达与细胞迁移的影响

目的：探讨RNA干扰技术（RNAi）沉默环氧化酶-2（COX-2）基因对血管内皮生长因子-C（VEGF-C）的表达及细胞迁移能力的影响。方法：利用siRNA干扰胃癌SGC-7901细胞COX-2基因,RT-PCR和免疫荧光检测干扰前后COX-2基因和VEGF-C基因在mRNA和蛋白水平表达差异;细胞划痕实验比较COX-2基因对细胞迁移能力变化的影响。结果：COX-2基因干扰后,胃癌SGC-7901细胞中COX-2基因和VEGF-C基因的mRNA和蛋白水平明显下调,组间差异具有统计学意义（P〈0.05）,且COX-2与VEGF-C的表达呈显著正相关性（P〈0.05）;同时胃癌细胞的迁移能力也明显降低。结论：siRNA能特异性地抑制胃癌SGC-7901细胞COX-2基因的表达,进而抑制VEGF-C的表达,降低胃癌细胞的迁移能力,减少胃癌细胞转移。     

小干扰RNA对人卵巢癌细胞株CXCR4基因表达和侵袭力的影响

目的探究小干扰RNA对人卵巢癌细胞株CXCR4基因表达和侵袭力的影响。方法利用单细胞克隆技术从人卵巢癌细胞系SW626中分离培养细胞株CXCR4,并设计合成针对CXCR4基因的小干扰RNA,在脂质体介导下,重组表达质粒转染人卵巢癌细胞株,利用RT-PCR方法对CXCR4基因表达进行检查,观察转染后细胞株的侵袭能力。实验细胞分为不做处理的空白对照组、转染空病毒载体的阴性对照组、siRNA组。结果 siRNA组的CXCR4 CXCR4 mRNA水平、蛋白表达率、穿膜细胞数均明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05),而空白对照组与阴性对照组之间无明显差异(P>0.05)。结论小干扰RNA可有效抑制人卵巢癌细胞株CXCR4基因表达和侵袭力。     

FAK反义寡核苷酸对卵巢癌细胞凋亡、黏附和侵袭性的影响

目的观察黏着斑激酶的反义寡核苷酸对卵巢腺癌细胞株OVCAR-3凋亡、黏附和侵袭性的影响。方法实验分4组,反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组、脂质体组、空白对照组。用脂质体介导的方法,将黏着斑激酶的反义寡核苷酸转入OVCAR-3卵巢癌细胞株,应用流式细胞仪AnnexinV/PI双染色法检测细胞的凋亡率,应用基质胶细胞黏附实验和Boyden小室法检测卵巢癌细胞的体外黏附和侵袭能力。结果 ASODN组卵巢癌细胞的凋亡率与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）;ASODN组癌细胞与基质胶的粘附率与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）;ASODN组癌细胞穿透Matrigel胶的细胞数目与对照组比较差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论抑制黏着斑激酶的表达能增加卵巢癌细胞株OVCAR-3的凋亡,并降低其黏附和侵袭转移能力。     

lncRNA HOST2通过PI3K/Akt途径调控卵巢癌SKOV3 细胞对顺铂的敏感性

摘要：目的 探讨下调长链非编码RNA（lncRNA）上皮性卵巢癌转录因子2（HOST2）表达对人卵巢癌SKOV3细 胞顺铂敏感性的影响及其作用机制。方法 体外培养人卵巢癌SKOV3细胞,取对数生长期细胞分为空白对照组、阴 性对照组和siRNA干扰组,其中阴性对照组和siRNA干扰组SKOV3细胞应用Lipofectamine 2000分别转染阴性对照 siRNA 和 lncRNA HOST2-siRNA,空白对照组未进行转染。采用 qPCR 法检测各组细胞 lncRNA HOST2 的表达; Western blot检测磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（Akt）信号通路相关蛋白Akt、p-Akt （S473）、pAkt（S380）及Bcl-2的表达;CCK-8法检测经不同浓度（0、20、40、60、80、100 μmol/L）顺铂作用后细胞的存活情况,并计算半抑制浓度（IC50）;流式细胞术检测经20 μmol/L顺铂作用后的细胞凋亡率。结果 与空白对照组和阴性对照组 比较,siRNA 干扰组细胞 lncRNA HOST2 表达及 p-Akt（S473）、p-Akt（S380）和 Bcl-2 蛋白表达水平均降低（均 P＜ 0.05）;3组Akt蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。空白对照组、阴性对照组和siRNA干扰组细胞存活率均 随顺铂药物浓度的增加而降低,IC50分别为（59.58±5.97）、（51.42±5.22）和（39.75±5.31）μmol/L。siRNA干扰组细胞凋 亡率（12.42%±1.46%）明显高于空白对照组（7.53%±1.25%）和阴性对照组（8.16%±1.31%）。结论 下调 lncRNA HOST2表达可增强人卵巢癌SKOV3细胞对顺铂的敏感性,其机制与抑制PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达有关     

RNA干扰对SKOV3卵巢癌细胞株Skp2表达的抑制作用

目的:探讨RNA干扰(RNAi)技术对SKOV3卵巢癌细胞株Skp2表达的抑制作用.方法:设计合成针对Skp2的小干涉RNA(siRNA)并进行转染.实验分为空白对照组、转染组1、转染组2、转染对照组及阴性对照组.采用Real time PCR和Western blotting技术检测各组Skp2 mRNA和蛋白水平的变化,通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测各组卵巢癌细胞增殖情况.结果:应用Skp2-siRNA干扰SKOV3卵巢癌细胞株后,转染组1、转染组2的Skp2mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖明显受限,与空白对照组相比较,差异有统计学意义(P＜0.05),转染组1与转染组2之间差异无统计学意义(P＞0.05).转染组1与转染组2基因沉默效率分别为75.31%和76.86%,蛋白抑制率分别为62.10%和63.11%,细胞增殖抑制率分别为52.75%和53.06%.结论:RNAi技术能够抑制SKOV3卵巢癌细胞株Skp2的表达,从而抑制卵巢癌细胞的增殖.     

STAT3-siRNA对人甲状腺癌SW579细胞株增殖侵袭的影响

目的研究小干扰RNA-siRNA对人甲状腺癌SW579细胞STAT3表达及细胞增殖和侵袭的抑制作用。方法将STAT3-siRNA转染给人甲状腺癌SW579细胞来沉默STAT3的表达。用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和Western blotting测定STAT3mRNA和蛋白的表达。用甲基噻唑基四唑（MTT）来分析STAT3STAT3-siRNA对癌细胞的生长抑制作用。通过RT-PCR检测MMP2和MMP9mR-NA的表达,Transwell侵袭小室实验研究癌细胞的体外侵袭能力。结果STAT3-siRNA能有效而稳定地抑制甲状腺癌SW579中STAT3的表达,下调STAT3可以在体外显著抑制肿瘤细胞的生长,在转染后24、48、72h,转染STAT3特异性的siRNA组生长抑制率显著高于对照组。siRNA沉默STAT3基因后,肿瘤细胞的体外侵袭能力明显下降。结论下调STAT3可以在体外显著抑制肿瘤细胞的生长和侵袭能力,STAT3特异性siRNA作为一种治疗肿瘤的新途径值得进一步研究。     

酪氨酸激酶受体表达水平对上皮性卵巢癌细胞侵袭性的影响及其机制

目的探讨AXL表达水平与上皮性卵巢癌细胞侵袭性的关系及其机制。方法使用OVCAR3细胞为研究载体,通过siRNA干扰细胞中AXL的表达,通过RT-PCR检测两组细胞中AXL以及MMP-9基因表达水平,Transwell法比较干扰组细胞与对照组细胞侵袭能力,并比较siRNA干扰组细胞与对照组细胞在裸鼠体内的成瘤能力。结果干扰组OVCAR3细胞中AXL以及基质金属蛋白酶-9表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);实施siRNA转染组细胞侵袭细胞数量为73±10.5个,明显低于对照组261.5±21.7个,差异有统计学意义(P<0.05);干扰组细胞裸鼠成瘤的质量以及肿瘤细胞的数量均明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 AXL表达抑制时可能通过减少细胞内基质金属蛋白酶-9的mRNA的表达降低上皮性卵巢细胞的侵袭能力。     

靶向MMP-9的siRNA抑制人类SGC7901胃腺癌细胞侵袭和迁移的研究

目的:探讨基质金属蛋白酶(MMP-9)siRNA对胃腺痛细胞系SGC7901中MMP-9表达的影响以及siRNA干扰后对SGC7901细胞侵袭和迁移的抑制作用.方法:设计合成针对MMP-9的siRNA,采用oligofectamine转染SGC7901胃腺癌细胞,分别采用实时定量聚合酶链反应(realtime PCR)和蛋白印迹法分别检测转染细胞后MMP-9mRNA及蛋白的表达.Matrgel 3D生长实验和Transwell实验检测细胞侵袭情况,Matrgel 2D生长实验和划痕实验检测细胞迁移情况.结果:realtime PCR和蛋白印迹法显示转染MMP-9 siRNA后细胞中MMP-9 mRNA和蛋白的表达较空白组和对照组明显降低.RNA干扰MMP-9基因后SGC7901细胞的侵袭和迁移能力也有明显下降.结论:靶向MMP-9的siRNA不仅能特异性的降低MMP-9 mRNA及蛋白的表达,且能抑制人SGC7901胃腺癌细胞的侵袭和迁移.     

整合素配体RGD修饰的阳离子脂质体作为siRNA输送载体的体外研究

本研究构建了能够靶向肿瘤新生血管的RGD修饰阳离子脂质体（RGD-Lipo），作为靶向耐药相关基因MDR1的siRNA输送载体并评价其相关的药剂学性质。该脂质体与siRNA形成的复合物粒径控制在200nm以内，并且对其中所包载的siRNA具有一定的保护作用。体外实验结果表明，经RGD修饰的脂质体（RGD-Lipo）细胞粘附能力显著增强，并可增加细胞内siRNA的转染效果。与利用前插法进行靶向修饰相比，利用后插法进行RGD修饰可有效地改善siRNA的溶酶体释放效率。细胞毒试验结果表明，后插法制备的pRGD-Lipo-siRNA能够有效逆转人卵巢癌SKV03／A细胞的耐药性，并增加阿霉素药物在细胞内的蓄积。体外研究结果证实，使用pRGD-Lipo-siRNA有利于提高耐药细胞对化疗药阿霉素的敏感度，并将有可能应用于临床耐药肿瘤的治疗。     

Survivin-siRNA在体外诱导Panc-1细胞凋亡的实验研究

目的:探讨RNA干扰技术抑制Survivin对人胰癌细胞株Panc-1细胞凋亡的影响。方法:体外设计、合成针对sur-vivin基因的小分子干扰RNA(survivin-siRNA),应用脂质体介导survivin-siRNA转染Panc-1细胞后,MTT试验测定转染细胞的增殖抑制率,RT-PCR检测细胞survivin mRNA表达,琼脂糖凝胶电泳分析其对Panc-1细胞凋亡诱导作用。结果:转染survivin-siR-NA的Panc-1细胞增殖明显受抑制,与对照进行比较,具有显著性差异(P<0.01);经琼脂糖凝胶电泳,转染survivin-siRNA的Panc-1细胞可见到DNA梯形条带,而对照细胞未见到。结论:survivin-siRNA能够显著诱导Panc-1细胞凋亡。     

Survivin基因沉默对裸鼠人卵巢癌细胞移植瘤凋亡的影响

目的探讨survivin基因沉默对人卵巢癌细胞株SKOV3裸鼠移植瘤凋亡的影响。方法将重组survivin shRNA plasmid转染人卵巢癌细胞株SKOV3细胞,通过裸鼠移植瘤实验比较survivin基因沉默对裸鼠移植瘤的生长抑制作用,荧光定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白印迹法检测与凋亡密切相关的cytochrome-c、caspase-9和caspase-3基因的表达。结果裸鼠移植瘤实验显示,与对照组(空载体组和未转染组)相比,survivin shRNA plasmid转染组人卵巢癌细胞株SKOV3细胞生长速度减慢,肿瘤体积缩小(P<0.05);荧光定量PCR和蛋白印迹法结果都显示,与对照组相比,survivin shRNA plasmid转染组cytochrome-c、caspase-9和caspase-3的表达明显升高(P<0.05)。结论 survivin基因沉默可通过促进肿瘤细胞的凋亡而抑制裸鼠移植瘤生长。     

siRNA沉默survivin基因表达对恶性胶质瘤细胞放射敏感性的影响

目的探讨针对人survivin基因的siRNA（small interfering RNA）对恶性胶质瘤细胞放疗敏感性的影响。方法设计并合成针对survivin基因的siRNA片断,构建干涉质粒载体pSil4.1-shsurvivin1和pSil4.1-shsurvivin2（pSil4.1-shcontrol作为阴性对照）。利用脂质体辅助转染恶性胶质瘤细胞（U251）,以G418筛选稳定表达干涉载体的细胞系,RT-PCR和W estern blot试验检测survivin的m RNA和蛋白表达,并筛选survivin基因显著抑制的稳定转染细胞系（U251-s2）。通过克隆形成试验和皮下移植瘤试验分别在体外和体内检测恶性胶质瘤细胞放射敏感性的变化。结果相对于未转染和阴性对照组细胞,U251-s2细胞中survivin mRNA和蛋白表达分别显著下调了40.5%和51.8%;同时,survivin基因表达下调能够显著增强恶性胶质瘤细胞的体内外放射敏感性。结论Survivin基因过表达和恶性胶质瘤的放疗抗性密切相关,抑制其表达可以显著增强恶性胶质瘤细胞的放疗敏感性,具有潜在的临床应用前景。     

靶向沉默SSBP1基因对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭转移的影响

目的 观察靶向沉默线粒体单链DNA结合蛋白(SSBP1)基因对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭转移的影响.方法 设计并构建靶向SSBP1 基因的特异性siRNA,采用脂质体介导瞬时转染肝癌HepG2细胞,细胞分3组:对照组、空白转染组、转染组.Real time-PCR和Western-blot检测靶向干扰后SSBP1 mRNA和蛋白表达变化.CCK-8法检测细胞增殖.流式细胞仪检测细胞周期、凋亡率及线粒体膜电位.划痕实验及Transwell 侵袭实验检测细胞侵袭转移能力.Western-blot检测增殖、侵袭转移相关基因蛋白表达状况.结果 SSBP1 siRNA能够显著抑制SSBP1 mRNA和蛋白表达.与对照组和空白转染组比较,转染SSBP1 siRNA后HepG2细胞增殖能力、G2期和S期细胞比例、线粒体膜电位明显降低,G1期细胞比例、细胞凋亡率明显升高(P<0.05);同时细胞增殖相关基因PCNA、凋亡抑制基因Bcl-2、转移相关基因MMP-9蛋白表达显著下调,凋亡诱导基因Bax蛋白表达显著上调(P<0.05).结论 靶向沉默SSBP1基因能够通过线粒体途径抑制肝癌HepG2细胞增殖、侵袭转移,并诱导其凋亡.     

低浓度Celecoxib对卵巢癌细胞SKOV3侵袭的抑制作用的研究

目的探讨低浓度环氧化酶-2(COX-2)选择性抑制剂Celecoxib对人卵巢癌细胞系SKOV3侵袭的影响及其相关机制。方法10μmol/L Celecoxib作用SKOV3细胞24h后,细胞外基质黏附试验检测细胞黏附能力,Transwell侵袭小室测定细胞的侵袭力,划痕试验检测细胞的迁移能力,明胶酶谱法(Zymography)检测细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9活性,Western blot检测MMP-2、MMP-9和E-cadherin的表达;同时利用RNAi技术特异性沉默SKOV3细胞中COX-2的表达,观察上述指标的变化情况。结果10μmol/L Celecoxib作用SKOV3细胞24h后,细胞外基质黏附试验结果表明:SKOV3细胞黏附于matrigel的细胞数明显增加(P<0.05);Transwell侵袭小室实验结果表明:SKOV3细胞穿膜数明显减少(P<0.05),划痕试验结果表明:SKOV3细胞迁移到损伤区的细胞数明显减少(P<0.05)。进一步探讨机制,Zymography结果显示Celecoxib作用SKOV3细胞后,MMP-2、MMP-9的活性降低,Western blot结果显示MMP-2、MMP-9的表达量降低,而E-cadherin的表达量增强。而经特异性沉默COX-2表达的SKOV3/COX-2i细胞未出现上述分子的变化。结论10μmol/L Celecoxib能够增强SKOV3的黏附力,抑制其侵袭和转移能力,其机制可能与增加E-cadherin的表达,抑制MMP-2、MMP-9的活性和表达有关,而这一过程可能是COX-2非依赖的。     

靶向Akt1小干扰RNA对人喉癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：研究Akt1基因沉默对人喉癌细胞系（Hep-2）增殖和凋亡的影响。方法：设计并合成针对Akt1的特异性小干扰RNA（siRNA）序列,利用转染试剂转入体外培养人Hep-2细胞,48h后收集细胞,RT-PCR和Westernblot验证siRNA的沉默效应,MTT法检测细胞增殖活性、台盼蓝细胞染色法计数细胞存活率、AnnexinV/PI检测细胞凋亡和坏死。结果：设计的Akt1siRNA能够有效抑制体外培养Hep-2细胞内Akt1表达实现其基因沉默效应;Akt1siRNA干扰组Akt1mRNA转录和蛋白表达水平均低于空白和阴性对照组;Akt1siRNA干扰组细胞增殖活性下降,细胞存活率下降,Akt1siRNA干扰后细胞凋亡率和坏死率增加。结论：RNA干扰Akt1基因沉默具有抑制喉癌细胞增殖,促进细胞凋亡的作用,Akt1可作为喉癌基因治疗的后选新靶点。     

shRNA对A549细胞survivin基因表达及紫杉醇敏感性的影响

目的观察靶向survivin基因的短发夹RNA(shorthairpin RNA,shRNA)对人肺腺癌细胞A549生物学行为及紫杉醇敏感性的影响。方法将靶向survivin的基因片段插入载体后构建重组质粒,用转染试剂FuGENE(HD将其导入A549细胞,RT-PCR及Western blot分析转染前后survivin基因的表达情况,TUNEL法检测细胞凋亡情况,MTT法检测转染后A549细胞对紫杉醇的敏感性变化。结果成功构建重组质粒。与对照组相比,转染重组质粒后,survivin基因的表达明显降低,细胞凋亡率增加。转染前紫杉醇抑制A549细胞的IC50为转染后的11.9倍,两者比较,差异有显著性(P<0.05)。结论靶向survivin的shRNA能下调survivin基因表达,诱导细胞凋亡,增强A549细胞对紫杉醇的敏感性。     

STK15基因RNA干扰真核表达载体的构建及对人结肠癌细胞侵袭的影响

目的 构建STK15基因特异的RNA干扰（RNAi）真核表达质粒,将其转染人结肠癌细胞SW480后,观察对STK15基因表达的抑制作用及对肿瘤细胞侵袭能力的影响.方法 设计并合成能表达小发夹结构RNA （shRNA）的DNA序列,退火后与载体pGPU6/GFP/Neo连接,构建重组表达载体pGPU6/GFP/NeoSTK15 shRNA,转化DH5α菌株后挑选阳性克隆,提取质粒进行序列测定.脂质体介导重组质粒转染人结肠癌SW480细胞,于转染后24h和48 h通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白印迹法分别在mRNA和蛋白水平检测STK15基因的表达,并通过细胞体外侵袭实验检测肿瘤细胞的侵袭能力.结果 测序证实插入pGPU6/GFP/Neo载体的DNA序列、方向和位点均正确.与阴性质粒转染组比较,pGPU6/GFP/Neo-STK15 shRNA质粒转染细胞24h和48 h后,STK15基因的mRNA和蛋白表达水平均明显降低,且呈现时间依赖性,STK15 mRNA水平分别下调80％和98％,蛋白水平分别下调40％和80％.与阴性质粒转染组比较,pGPU6/GFP/Neo-STK15shRNA质粒转染细胞的侵袭能力分别下降约67％和89％.结论 成功构建了针对STK15基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制STK15基因的表达和细胞的侵袭能力,为进一步研究STK15基因功能以及探讨结肠癌治疗的新途径奠定了基础.     

存活素蛋白表达下调对卵巢癌细胞侵袭能力影响的实验研究

目的通过存活素(Survivin)反义寡核苷酸(ASODN)转染下调人卵巢癌细胞株SKOV3中Survivin蛋白表达,观察细胞侵袭能力的改变,探讨Survivin蛋白表达可能在调节卵巢癌细胞侵袭能力中的作用。方法用脂质体(LipofectamineTM2000)介导ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,流式细胞学技术检测细胞转染率及其Survivin蛋白表达,Transwell小室检测细胞侵袭能力的改变。结果LipofectamineTM2000介导ASODN人卵巢癌细胞株SKOV3转染,FCM检测转染率>95%。用600 nm/L ASODN转染48 h后,细胞中Survivin蛋白表达明显下调(t=7.8146,P<0.01),侵袭细胞数也明显下降(t=27.416,P<0.01)。结论卵巢癌细胞中Survivin蛋白表达下调,可降低卵巢癌细胞侵袭能力,提示Survivin蛋白可能是影响卵巢癌侵袭能力的重要分子,在卵巢癌转移机制中起关键性作用。