转染血管内皮细胞生长因子基因骨髓间充质干细胞移植对大鼠心肌梗死区血管新生的影响

背景:骨髓间充质干细胞作为基因载体,有利于外源基因保持良好的遗传稳定性,如能将血管内皮细胞生长因子基因转入间充质干细胞内移植到心肌梗死区,可望获得基因和细胞治疗相互协同促进的作用.目的:观察转染血管内皮细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞移植大鼠心肌梗死区血管新生及血管内皮细胞生长因子基因的体内表达.设计、时间及地点:实验于2004/2007年在湖南省儿童医院儿科研究所,中南大学湘雅二医院中心实验室完成的随机对照实验.材料:实验动物为雄性清洁级Wistar近交系大鼠.以冠脉结扎法制备人鼠心肌梗死模型.方法:以密度梯度离心与贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞.当问充质干细胞生长汇合率为80%～90%时以脂转法转染pcDNA3.1-hVEGF165质粒.心肌梗死模型大鼠随机分4组进行干预:联合组于心肌梗死区移植转染血管内皮细胞生长因子基因的间充质干细胞,细胞组移植间充质干细胞、基因组注射脂质体-pcDNA3.1-VEGF165DNA复合物,对照组注射等容积培养液.主要观察指标:移植4周后,各组大鼠心肌梗死区毛细血管密度,血管内皮细胞生长因子基因表达.结果:火鼠心肌梗死区毛细血管密度以联合组和基因组最高,高于细胞组(P=0.001,0.029),细胞组高于对照组(P=0.028).RT-PCR显示血管内皮细胞生长因子基因体内的表达从高到低依次为联合组、基因组、细胞组和对照组.结论:①作为血管内皮细胞生长因子基因的载体,骨髓间充质干细胞有利于其的稳定表达.②转染血管内皮细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞移植有利于大鼠心肌梗死区的血管新生,其疗效优于单独应用基因或细胞治疗.     

同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植:急性心肌梗死后血管新生及相关细胞因子的变化

背景:骨髓间充质干细胞移植途径主要包括外周静脉注射移植、冠状动脉移植以及心肌内注射移植,但存在迁移缺少靶向性,价格高昂等局限性.目的:观察同种异体骨髓间充质干细胞穴位移植兔急性心肌梗死后梗死区血管新生及相关细胞因子的变化.方法:提取兔骨髓进行骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化、扩增、鉴定,并标记.将55只兔随机分为正常组与手术组.手术组急性心肌梗死后1周,再随机分为3组:穴位注射干细胞组、模型对照组、穴位注射生理盐水组.5周后,取心肌组织进行免疫组织化学BrdU染色、心肌特异性肌钙蛋白T免疫组织化学染色检测;免疫组织化学法检测梗死心肌组织血小板内皮细胞黏附因子1水平;免疫组织化学法,夹心酶联免疫法、RT-PCR法、Western-Blot法检测血管内皮细胞生长因子及免疫组织化学法榆测碱性成纤维细胞生长因子.结果与结论:穴位注射的骨髓间充质干细胞可迁移至梗死区,并可以在梗死区分化为心肌样细胞.与模型对照组及穴位注射生理盐水组比较,穴位注射骨髓间充质干细胞可使梗死区及周围组织血小板内皮细胞黏附因子1表达上调,诱导梗死区及周围组织血管新生,其机制是刺激心肌组织中碱性成纤维细胞生长因子表达上调.穴位注射骨髓间充质干细胞组梗死心肌组织中和血清中血管内皮细胞生长因子表达均无上调趋势,因此推测,血管新生由碱性成纤维细胞生长因子及未知因素诱导.     

诊断超声联合微泡增强骨髓间充质干细胞归巢兔缺血心肌的研究

目的 探讨诊断超声联合微泡对经静脉移植兔骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)归巢缺血心肌的靶向能力.方法 采用密度梯度离心与贴壁法培养兔BM-MSCs,用DAPI标记细胞.完全结扎冠状动脉左前降支(LAD)法建立兔心肌梗死模型.将分离培养的BM-MSCs经静脉途径移植人心肌梗死兔体内.根据移植时是否介入超声与微泡分成单纯静脉移植MSCs组与超声辐照+微泡+MSCs组,移植后48 h荧光显微镜下观察缺血梗死区域及其周围的荧光标记阳性细胞数目,并对两组进行计数和统计学分析.HE染色观察局部缺血心肌的病理学改变.透射电镜观察心肌血管及内皮细胞情况.结果 荧光显微镜下显示超声辐照+微泡+细胞组较单纯静脉细胞移植组阳性细胞分布更为密集.单纯静脉细胞移植组与超声辐照+微泡+细胞组阳性细胞个数分别为(146.8±18.78)个和(213.2±26.5)个,差异有统计学意义(P<0.01).HE染色结果显示超声+微泡+细胞组缺血心肌及周围区心肌组织间隙可见红细胞成分漏出,而单纯细胞组无此发现.透射电镜显示在超声联合微泡的介导下,心肌血管内皮细胞间隔增大,血浆成分渗出.结论 超声联合微泡经静脉移植MSCs后能增加MSCs在缺血及周围区心肌的聚集与归巢,增强其靶向性.     

腺病毒介导的肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死

背景：骨髓间充质干细胞可以分化为心肌细胞,促进血管再生,但在移植早期其自身分泌的细胞因子不足以维持良好的分化和再生。目的：验证腺病毒介导的肝细胞生长因子和血管内皮生长因子双基因转染新西兰兔骨髓间充质干细胞移植对新西兰兔梗死心肌组织的修复重建和血管再生的影响。方法：腺病毒介导肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染BrdU标记的新西兰兔骨髓间充质干细胞。取新西兰兔50只建立急性心肌梗死模型,4周后随机分为5组,分别于梗死心肌内注射：①骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子。②骨髓间充质干细胞/Ad.肝细胞生长因子。③骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子。④骨髓间充质干细胞。⑤对照组注射等量无血清IMDM培养液。移植4周后观察移植细胞的分化和新生血管的形成,并通过超声多普勒检测心功能变化。结果与结论：除对照组外,其余4组兔心功能都较移植前有明显改善（P〈0.05）,其中移植双基因转染骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子组兔的心功能改善程度要明显高于其他3组。部分BrdU染色阳性的细胞可以分化成为内皮细胞,参与构成了梗死区域的新生毛细血管。与对照组比较,其余4组都有明显的血管新生（P〈0.05）,而以骨髓间充质干细胞/Ad.血管内皮生长因子＋肝细胞生长因子组最显著。提示肝细胞生长因子/血管内皮生长因子双基因转染新西兰兔骨髓间充质干细胞移植于梗死心肌可以促进心肌再生和新生血管的形成,明显改善心功能。     

腺病毒介导血管内皮生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞移植梗死心肌的血管再生

背景：骨髓间充质干细胞的存活率与良好的血液供应关系密切，在移植早期其自身所分泌产生的促血管生长因子不足以刺激血管新生而容易导致移植的细胞死亡。目的：观察骨髓间充质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染对大鼠梗死心肌组织修复重建、血管再生的影响。设计、时间及地点：随机分组设计的细胞基因工程实验，于2006-01／2007-12在中山大学第二附属医院医学研究中心完成。材料：选取具有相同遗传背景的雄性SD大鼠40只建立急性心肌梗死模型，6~8周龄．体质量250～300g。方法：体外分离、培养、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞，以BrdU标记骨髓间充质干细胞。腺病毒介导血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞。将造模后大鼠随机分为4组．每组10只：基因转染骨髓间充质干细胞组，梗死心肌内注射体外转染腺病毒介导血管内皮生长因子的骨髓间充质干细胞；骨髓间充质干细胞组，梗死心肌内注射骨髓间充质干细胞；基因转染组，注射腺病毒介导的血管内皮生长因子；对照组，注射无血清IMDN培养液。主要观察指标：移植4周后观察移植细胞分化和新生血管的形成，并通过超声多普勒检测心功能变化。结果：细胞移植4周后，基因转染骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组移植区移植细胞表现为心肌肌钙蛋白T染色阳性，细胞呈肌样细胞形态，并且两组心功能都较移植前有明显改善，基因转染骨髓间充质干细胞组改善程度优于骨髓间充质干细胞组。部分BrdU染色阳性的细胞可以分化成为内皮细胞，参与构成了梗死区域新生毛细血管，相对于单纯细胞移植与细胞因子移植，细胞移植结合血管内皮生长因子基因转染促进毛细血管新生更明显。结论：骨髓间充质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染可以通过促进心肌再生和新生血管的形成来重建缺血心肌，明显改善心功能。     

静脉移植骨髓间充质干细胞联合重组人生长激素对充血性心肌病大鼠心肌和血管组织的修复

背景:骨髓间充质干细胞静脉移植后,能否归巢至心脏受损部位和分化为心肌样细胞尚无统一定论.目的:探讨重组人生长激素联合骨髓间充质干细胞静脉移植对充血性心肌病大鼠心肌和血管新生的影响.方法:密度梯度离心和贴壁筛选法获得大鼠骨髓间充质干细胞.模型组、细胞移植组、生长激素组、联合组大鼠均在阿霉素诱导下建立心脏衰竭模型.造模后,细胞移植组经静脉注入BrdU标记的骨髓间充质干细胞8×10~(13) L~(-1);生长激素组皮下注射重组人生长激素2 U/(kg·d),连续14 d;联合组行骨髓间充质干细胞移植与重组人生长激素注射.4周后取材,BrdU+MHC及BrdU+Actin免疫组化染色确定骨髓间充质干细胞的归巢情况,评价移植细胞向心肌样细胞和血管内皮细胞的分化,苏木精-伊红染色检测血管密度.结果与结论:与细胞移植组比较,联合组BrdU免疫组化阳性率显著升高(P < 0.001);BrdU+MHC双染和BrdU+Actin双染后心肌样细胞、血管内皮细胞均显著增多(P < 0.001).与模型组比较,生长激素组、细胞移植组、联合组的总血管密度、微血管密度、毛细血管密度均显著升高(P < 0.001),后3组间比较无明显差异(P > 0.05).结果证实骨髓间充质干细胞静脉移植后可归巢到心脏,对充血性心肌病大鼠心肌和血管有明显修复作用,能在损伤处区存活、生长,并向心肌样细胞、血管内皮细胞方向分化,增加损伤处血管密度;生长激素可以改善微环境,加强骨髓间充质干细胞向心肌样细胞、血管内皮细胞的转化率.     

磁共振活体示踪经冠状动脉骨髓间充质干细胞移植:验证其与病理组织学结果的一致性

背景:目前动物实验及临床研究证明经冠状动脉移植骨髓间充质干细胞可改善心肌梗死后的心脏功能,但骨髓间充质干细胞经冠状动脉移植后能否到达心肌梗死部位仍存在争议.目的:磁共振活体示踪经冠状动脉注射的骨髓间充质干细胞能否到达心肌梗死部位.方法:全骨髓法分离培养猪骨髓间充质干细胞,超顺磁性氧化铁标记后胰酶消化,调整细胞浓度为10~(10)L~(-1).10只猪均建立心肌梗死模型,造模后1周通过OTW球囊导管经冠状动脉将标记好的骨髓间充质干细胞悬液定向移植至梗死区.普鲁士蓝染色评价细胞标记效率,采用快速梯度回波序列完成长轴位四腔心和二腔心扫描,在以长轴位四腔心和二腔心为定位相,垂直于室间隔获得左心室短轴位图像.结果与结论:超顺磁性氧化铁可安全有效标记骨髓间充质干细胞,经冠状动脉注射的骨髓间充质干细胞能到达心肌梗死区及交界区,磁共振能示踪到超顺磁性氧化铁标记的骨髓间充质干细胞,示踪结果与病理组织学检查一致,且磁共振示踪时间可长达5周.     

自体骨髓间充质干细胞移植急性心肌梗死犬血管内皮生长因子及血管新生的变化

背景:研究表明骨髓间充质干细胞在体内外可诱导分化为心肌样细胞,局部移植骨髓间充质干细胞可以促进血管新生,阻止心室重构,改善心功能,但具体机制尚未阐明.目的:探讨骨髓间充质干细胞心肌移植后犬体内血管内皮生长因子的表达变化以及对心肌梗死区血管新生的影响.方法:健康杂种犬随机分成实验组和对照组,均建立急性心肌梗死模型.建模后一二小时,实验组犬将BrdU标记的骨髓间充质干细胞悬液注入心肌梗死区四五个不同部位,对照组注入等量的DMEM.骨髓间充质干细胞移植4周后,酶联免疫吸附测定法检测血清中的血管内皮生长因子浓度,并采用免疫组化染色法进行毛细血管密度测定.结果与结论:移植后第1天及1,2,3,4周血管内皮生长因子的浓度实验组与对照组相比均增加(P < 0.01),且两组血管内皮生长因子的浓度均随时间呈下降趋势(P < 0.01);心肌梗死区单位面积毛细血管数实验组较对照组明显增加(P < 0.01).结果表明心肌梗死区移植骨髓间充质干细胞后使得体内血管内皮生长因子的浓度增加,并可促进心肌梗死后毛细血管新生.     

不同时间点移植自体骨髓间充质干细胞对心肌梗死后心功能改善的MRI研究

目的:观察心肌梗死后在不同时间点经冠状动脉自体移植骨髓间充质干细胞后对心功能的影响,并初步探讨其机制.方法:30只健康太湖梅山猪(分为6组)建立心肌梗死模型,并分离培养自体骨髓间充质干细胞.3组(每组5只)分别在心肌梗死后3 h、2周及4周(分别简称为G1、G2、G4)经冠状动脉移植骨髓间充质干细胞.每组设立对照组(5只)在各对应时间点经冠状动脉注射DMEM培养基.在心肌梗死前,移植前及实验终点(心肌梗死8周)时对每只猪行MRI及心超检查以观察心功能的改变.在细胞移植前后不同时间点检测血清血管内皮生长因子值.实验终点时获取猪心,通过免疫组织化学检测移植细胞在心肌内定植及分化情况,并检测心肌血管密度.结果:G1组心功能与各对照组相比无显著性差异.G2、G4组与相应对照组相比,心功能指标有改善,且G4优于G2(P<0.05).G1及各对照组心肌梗死面积减小百分比绝对值差异无显著性意义,G4组较 G2组心肌梗死面积减小百分比绝对值大,差异有显著性意义(P<0.05).G2、G4组血清血管内皮生长因子水平上升明显,而G1及各对照组血清血管内皮生长因子水平无明显变化,G4组上升幅度较G2组高(P<0.05).G1及各对照组心肌切片免疫组织化学未见移植细胞定植及分化,G2、G4组心肌切片免疫组织化学显示有移植细胞定植及分化,且G4.较G2优(P<0.05).G1及各对照组心肌血管密度差异无显著性意义,心肌血管密度各实验组比较有显著性差异,G4组高于G1及G2组(P<0.05).结论:心肌梗死后不同时间点移植骨髓间充质干细胞对心功能影响效果有差异;急性期移植对心功能无明显影响,非急性期移植能改善心功能.心肌梗死后4周移植治疗效果较优.MRI可以显示梗死心肌的部位及范围,并可以反映心功能的变化.     

旁分泌效应联合超声生物学效应在MSCs归巢与修复缺血心肌的作用

目的 探讨超声联合微泡经静脉移植兔骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)中旁分泌效应及超声生物学效应在MSCs归巢和修复缺血心肌中的价值与作用.方法 密度梯度离心法及贴壁细胞培养法培养兔BM-MSCs.培养细胞进行成脂及成骨诱导分化.细胞移植后行免疫组织化学检测心肌缺血区SDF-1表达,Western blotting检测VEGF蛋白的表达并行定量分析.透射电镜观察各组心肌缺血区血管内皮细胞及通透性.结果 培养的细胞可分化成脂肪与骨骼样细胞.免疫组织化学示SDF-1在3组中均有表达,以2个细胞移植组的阳性表达更强.Western blotting VEGF/GAPDH定量分析超声辐照+微泡+细胞组(236.59±47.13)与静脉移植细胞组(151.48±25.07)和对照组(89.43±20.43)比较,P<0.05.透射电镜示超声+微泡+细胞组缺血区血管内皮细胞间隔增大,红细胞漏出,血管通透性增加.结论 移植MSCs通过旁分泌机制促进SDF-1、VEGF等因子分泌,超声生物学效应通过增加心肌血管通透性、上调VEGF的表达,二者协同促进MSCs归巢和修复缺血心肌.