日本血吸虫14-3-3蛋白epsilon亚型基因扩增及表达载体的构建

目的　扩增日本血吸虫 1 4 3 3蛋白epsilon亚型编码基因并构建其表达载体 ,以研究其在血吸虫信号转导以及免疫预防和诊断方面的作用。方法　以日本血吸虫成虫总RNA为模板逆转录合成cDNA链 ,设计合成引物 ,用PCR法扩增 1 4 3 3蛋白epsilon亚型基因编码序列 ,将其克隆入pGEM T载体 ,双酶切和以质粒为模板的PCR鉴定后 ,将基因片段亚克隆入表达载体pBK CMV ,转染大肠杆菌BL2 1 ,经双酶切后鉴定。结果　RT PCR扩增出一条约 753bp的特异性条带 ,TA克隆重组质粒的双酶切和以质粒为模板的PCR均获得了一条与RT PCR扩增出大小相同条带 ,pBK Sj1 4 3 3表达载体经双酶切后也同样获得了一条约 753bp的特异性条带。 结论　在体外成功的扩增了日本血吸虫 1 4 3 3蛋白epsilon亚型编码基因并构建了 pBK Sj1 4 3 3表达载体 ,为进一步的免疫预防和免疫诊断研究提供了条件。     

血吸虫14-3-3蛋白的免疫定位和功能

血吸虫病是一种遍及世界70多个国家、累及2亿多人口的地方性流行病，在我国约76万人受累。病原体为具有复杂生活史的血吸虫，其常见有6种，主要流行的是日本血吸虫(Sj)、曼氏血吸虫(Sm)及埃及血虫(Sh)，具有两个宿主，即人和淡水螺类。血吸虫的尾蚴穿透人的皮肤脱     

血吸虫14-3-3蛋白疫苗的研究现状

血吸虫病是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,主要流行于亚洲、非洲和拉丁美洲的76个国家和地区.采用疫苗防治该病是当前研究的热点领域,本文综述了血吸虫14-3-3的蛋白质疫苗、DNA疫苗、rBCG疫苗、重组酵母疫苗和Bm-sj14疫苗等方面的研究现状.     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3的免疫诊断价值评估

目的探讨重组日本血吸虫信号蛋白14-3-3（rSj14-3-3）间接ELISA用于血吸虫病免疫诊断的价值。方法表达并利用纯化的rSj14-3-3建立间接ELISA法，比较其与可溶性虫卵抗原（SEA）ELISA和间接血凝试验（IHA）检测急慢性日本血吸虫病患者的阳性率及其它寄生虫患者和正常人血清的交叉反应。结果rSj14-3-3-ELISA、SEA-ELISA和IHA3种方法的敏感性分别为90．8％、94．2％和90．0％，特异性分别为87．0％，84．8％和84．8％，差异无显著性（P〉0．05）。结论rSj14-3-3抗原间接ELISA法具有可用于日本血吸虫病免疫诊断的价值。     

重组日本血吸虫14-3-3蛋白的纯化和免疫特性分析

目的：纯化日本血吸虫信号蛋白质14-3-3编码基因的原核表达产物。分析纯化产物的免疫学特性。方法：SDS-PAGE鉴定重组日本血吸虫14-3-3（rSj14-3-3)蛋白包涵体，超声破碎细胞收集包涵体。尿素溶解包涵体，NiSO4平衡层析柱，亲和层析纯化rSj14-3-3,Western-blot鉴定纯化产物的免疫学特性。结果：rSj14-3-3是以包涵体形式在大肠埃希菌中表达。通过亲和层析在32.5kDa附近得到单一蛋白条带，Western-blot证实纯化产物为rSj14-3-3，且具有与天然Sj14-3-3相同的抗原表位。结论：成功纯化了rSj14-3-3蛋白，为研究14-3-3在血吸虫信号转导中的作用奠定了基础。     

日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建并研究日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法从日本血吸虫成虫组织提取总RNA;RT-PCR扩增Sj14-3-3编码基因;将此基因克隆至载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Sj14-3-3;转化入DE3中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达;表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果 RT-PCR扩增出399bp的Sj14-3-3编码基因;并成功将其插入pGEX-1λT构建了重组质粒pGEX-Sj14-3-3;SDS-PAGE显示相对分子质量约为40 000的重组蛋白,与预期结果相符,薄层扫描分析显示表达蛋白约占菌体总蛋白的21%;Western blot显示重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清识别。结论日本血吸虫重组质粒pGEX-Sj14-3-3构建成功,重组质粒在大肠埃希菌BL21中可较高效表达,且表达蛋白具有特异的抗原性。     

多房棘球绦虫Em14-3-3抗原编码基因在BCG中的表达

目的：研究多房棘球绦虫Em14-3-3抗原编码基因在BCG中的表达.方法：将重组质粒pBCG-Em14-3-3用电穿孔法导人BCG构建rBCG,将含有重组子的细菌培养至对数生长期,在收菌前3天每天45℃热诱导30min,然后对表达产物作SDS-PAGE及免疫印迹分析.结果：多房棘球绦虫pBCG-Em14-3-3在BCG中成功表达了Em14-3-3重组蛋白,在相对分子量为27KDa处可见明显的表达蛋白带,其表达量占菌体总蛋白量的11%.结论：多房棘球绦虫pBCG-Emi4-3-3能在BCG中高效表达,且能与鼠血清抗体发生特异结合,提示rBCG-Em14-3-3疫苗表达的Em14-3-3重组蛋白具有特异的抗原性.     

日本血吸虫thioredoxin基因的克隆和表达

目的 结合分子生物学和生物信息学方法筛选鉴定日本血吸虫新基因。方法 从日本血吸虫(Schistosoma japonicum，大陆株)成虫cDNA库中获取表达序列标签(expressed sequence tag，EST)，用电子拼接的方法延伸序列，用NCBI提供的BLAETx程序和Genbank数据库进行同源性分析以筛选基因；设计特异性引物从日本血吸虫成虫mRNA中扩增筛选基因并预测和分析；扩增产物克隆到原核表达载体并表达。结果 筛选出日本血吸虫Thioredoxin全长基因并对其进行了序列分析，克隆全长cDNA至PET原核载体并表达成功。结论 结合EST、电子延伸和传统的分子生物学方法是高效筛选S.jiaponicum功能基因的有效策略。     

14-3-3σ在鼻咽癌中的表达研究

目的研究14—3—3σ在鼻咽癌中的表达情况。方法选择65例手术切除的鼻咽癌及14例淋巴结转移鼻咽癌标本,并以20例慢性鼻炎组织作为对照,采用免疫组化S—P方法检测14—3—3σ蛋白表达,分析其表达与鼻咽癌发生及转移的关系。结果14—3—3σ蛋白表达在转移性鼻咽癌中低于原发性鼻咽癌患者,在鼻咽癌中低于正常鼻咽黏膜上皮,差异均有显著统计学意义（P〈0．01）。结论鼻咽癌组织中14—3—3σ蛋白表达与鼻咽癌的发生和转移有关。     

14-3-3σ基因在乳腺癌中的甲基化及其转录表达

目的 通过研究14-3-3σ基因在散发性乳腺癌中的甲基化和mRNA转录情况,探讨14-3-3σ基因与乳腺癌发生的相关性。方法 采用甲基化特异性聚合酶链反应法对散发性乳腺癌患者癌组织标本进行14-3-3σ甲基化检测,SYBR green Ⅰ实时定量PCR法检测14-3-3σmRNA转录水平。结果 采用相对量分析法,△△CT为0.77,根据样本平均相对含量%=2-△△CT,得出14-3-3σ基因在癌症组平均转录表达量是非癌组的58%。14-3-3σ基因启动子在42例散发性乳腺癌标本中甲基化率为66.7%;在24例乳腺非癌组织中甲基化率为25%,经统计学分析,二者差异有显著性（Χ2=10.616,P<0.05）。结论 14-3-3σ基因在乳腺癌组织中有较高的甲基化率,且mRNA表达水平降低,可能甲基化的异常影响了14-3-3σ基因的表达,从而促进乳腺癌的发生。     

盐藻14-3-3蛋白基因原核表达条件的优化

目的探讨盐藻14-3-3蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达的条件。方法通过改变诱导剂浓度和诱导时间,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析不同条件下14-3-3蛋白的表达情况。结果在诱导剂(IPTG)浓度为0.5 mmol.L-1的条件下诱导培养3 h其表达效率最高。结论盐藻14-3-3蛋白在pET原核表达系统中,0.5 mmol.L-1IPTG诱导3 h为其最适表达条件。     

日本血吸虫Mf2基因的亚克隆表达与免疫保护效果研究

目的 在大肠杆菌中高效表达日本血吸虫(Schistosoma japonicum，Sj）Mf2蛋白，并对表达产物进行免疫保护效果测定。方法 将SjMf2基因亚克隆至pCEX—5X—3原核表达载体，以GST融合蛋白的形式在ER2688中表达，表达产物免疫小鼠，免疫用抗原剂量为50μg/次.鼠，对照组分别注射FCA或PBS，在0、2、6周共免疫3次。第3次免疫后2周进行攻击感染，42d后杀鼠，观察减虫和减卵效果。结果 在IPTG诱导下，表达载体中的SjGST基因与重组的SjMf2基因在大肠杆菌中得以高效表达，形成了SjGST—Mf2融合蛋白，用这种融合蛋白免疫小鼠，诱导产生了27．75％的减虫率和45．7％的每雌肝组织虫卵减少率(LEPF)。结论 SjMf2基因亚克隆至pGEX—5X—3载体后可在大肠杆菌中高效表达，表达产物能诱导小鼠产生一定程度的抗日本血吸虫保护性免疫力。     

日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因的体外扩增及克隆

为了构建日本血吸虫（中国大陆株)Sj16基因原核表达重组质粒pGEX-4T-1-Sj16。根据曼氏血吸虫Sm16基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA库中扩增Sj16基因;将Sj16基因定向克隆入pGEX-4T-1;转化感受态BL21/DE3菌;用酶切,PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆。结果表明,从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA库中获取Sj16基因,重组质粒中含有Sj16基因。结果提示,成功构建日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因原核表达重组质粒pGEX-4T-1-Sj16,为进一步研究Sj16基因功能打下基础。     

日本血吸虫新基因-Ⅲ8kDa钙结合蛋白基因的发现与克隆

目的 将用EST策略及同源性搜索发现的日本血吸虫新基因－Ⅲ8kDa钙结合蛋白（Calcium-binding protein,CBP)cDNA克隆到表达质粒pET32a( )上，为下一步对该基因的功能进行研究做准备。方法 将插入于pTripIEx2质粒上的cDNA进行测序，测序结果经BLASTn程序搜索，发现该插入cDNA序列与曼氏血吸虫钙结合蛋白cDNA高度同源。根据表达质粒pET32a( )上的克隆位点及该cDNA序列设计PCR引物，将PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体上，将重组T载体经EcoRI/XhoI双酶切后切下的SjCBP基因亚克隆入原核可溶性表达质粒pET32a( )中。结果 所发现的新基因与曼氏血吸虫8kDa CBP基因的同源性达82％，PCR产物的片段长度与预期大小一致，重组T载体及表达质粒经EcoRI及XhoI双酶切后证明具有与目标片段长度相符的插入片段。结论 所发现的cDNA与曼氏血吸虫8kDa CBP cDNA高度同源，并且已成功地构建出重组表达质粒pET32a( )－SjCBP。     

日本血吸虫P14钙结合蛋白样蛋白基因真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的 从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出钙结合蛋白样蛋白SjP14编码基因,并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),制备重组分子疫苗.方法 提取日本血吸虫成虫总RNA,逆转录cDNA,设计引物常规PCR法扩增出SjP14编码基因,通过线性T克隆载体pGEM-T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),经转染...     

日本血吸虫谷胱甘肽转移酶基因在真核表达载体中的亚克隆

目的 将日本血吸虫谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）基因片段克隆到真核表达载体ＰＢＫＣＭＶＫ ,以便以进行酸疫苗的研究。方法 特定核苷酸引物的设计和合成,ＴＲＩＺＯＬ试剂以日本血吸虫成虫ＲＮＡ〈ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＧＳＴ基因编码序列,将扩增产物连接ＰＧＥＭ－Ｔ克降体,再亚克隆到真核表达载体ＰＢＫＣＭＶ中。结果 ＲＴ－ＰＣＲ法特异性扩增出ＳｊＧＳＴ编码基因片段。其大小约为６７０ｂｐ,经双酶切、ＰＣＲ鉴定表明所构     

日本血吸虫Nanos样蛋白基因的获得、表达及初步鉴定

目的 获得日本血吸虫Nanos样蛋白基因的cDNA 序列,克隆、表达和纯化原核蛋白并初步鉴定.方法 应用PCR法扩增获得日本血吸虫Nanos样基因的完整开放阅读框(ORF),将该基因亚克隆到原核表达载体pET28a(+),诱导表达并纯化融合蛋白.用纯化后的蛋白免疫家兔,制备该蛋白的多克隆抗体,分别用 ELISA 和 W...