DNA芯片快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因突变

目的建立快速检测结核分枝杆菌利福平（RFP）耐药rpoB基因突变的DNA芯片。方法从34株临床痰样本中提取结核分枝杆菌的基因组DNA,采用聚合酶链反应（PCR）扩增含有rpoB基因突变位点的特异DNA片段,荧光标记后与芯片上含有特异突变位点的寡核苷酸探针进行杂交,同时与DNA测序法比较。结果用DNA芯片检测出19株耐药株和15株敏感株,且结果与DNA测序相同,准确率可达88．2％,敏感性为78．9％,特异性为100．0％。结论DNA芯片快速检测结核分枝杆菌对RFP的耐药rpoB基因突变是一种操作简便、准确性、敏感性和特异性较高,且易于开展的方法。     

结核分枝杆菌rpoB基因突变检测的进展

利福平(rifampin,RFP)是最主要的抗结核药物之一,它在结核病治疗,特别是短程化疗中起着重要作用,抗结核药物也同其它抗生素一样,面临耐药性问题,2000年全国结核病流行病学抽样调查结果显示:结核分枝杆菌对RFP的耐药率为16.6%[1],耐药问题是结核病化疗中的难题,也是控制结核病面     

武汉地区耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变分析

摘要：目的：探讨武汉地区结核分枝杆菌（MTB）利福平耐药株rpoB基因的突变特征。 方法：对76例MTB临床分离株包括rpoB核心区域81 bp碱基在内的428 bp碱基进行PCR测定,并进行DNA序列分析。 结果：76例临床分离MTB中利福平耐药株56例,敏感株20例。耐药株中92.9%（52/56）存在突变,共涉及10个密码子的18种突变类型。 531、526为常见突变位点,其突变率分别为57.7%(30/52)、19.2%(10/52);联合突变率为13.5%（7/52）;同时发现了509位（AGC→AGA）新的突变类型和国内少见的517位CAG缺失类型。 结论：rpoB基因突变在武汉地区利福平耐药MTB中广泛存在,并存在新的突变位点。     

结核分杆杆菌rpoB基因突变的顺序研究

目的 了解南通地区耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变特征。方法 对36株临床分离菌株rpoB基因502-533位点进行序列测定。结果 耐利福平（RFP）分离株93．3％（28／30）存在rpoB基因突变，531位突变率53．3％（16／30），526位23．3％（7／30），526位23．3％（7／30），516位6．7％（2／30），联合突变3．3％（1／30），敏感菌株均无突变。结论 rpoB基因突变与利福平耐药密切相关，以531位突变为主。     

用PCR—SSCP快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的突变

目的：了解本地区结核分枝杆菌对利福平（RFP）耐药基因的突变情况，探讨利用分子生物学方法直接快速检测结核分枝杆菌耐药基因型的试验方法。方法：针对rpoB基因设计一对引物（扩增产物为189bp)，采用聚合链酶反应－单链构象多态性银染（PCR－SSCP）方法，以标准结核分枝杆菌H38Rv为对照，检测临床分离的35株结核分枝杆菌rpoB基因突变情况并以药敏试验结果做对照分析。结果：以药敏试验结果为对照，35株临床分离株中有9株RFP敏感株的SSCP带与结核分枝杆菌标准株（H37Rv)相同，26株RFP耐药株中有24检测到突变图谱，与药敏试验结果对照阳性率为92．3％，特异性为100％，结论：RpoB基因是一种高度保守序列，结核分枝杆菌耐RFP是由于rpoB基因突变所致。本研究针对其高突变区域设计一对引物，运用PCR－SSCP法具有简便，快速、准确的特点，可以对临床标本中结构分枝杆菌进行检测，以满足临床早期诊治的需要。     

检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的：建立聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法，并评价共临床应用的价值。方法：依据结核分枝杆菌rpoB基因的耐利福平决定区设计引物，用PCR从临床分离株和直接从痰标本中扩增rpoB基因片段；对扩得的rpoB基因片段做DNA SSCP分析，并随机测定rpoB片段的序列。结果：PCR从所有212株结核分枝杆菌中均扩得230bp片段135份抗酸染色阳性的痰标本中，有113份扩得阳性片段（83．7％），在SSCP分析中，140份经L－J药敏试验检测为利福平耐受的结核分枝杆菌，有130份有rpoB基因突变（符合率为92．9％），72份经L－J药敏试验检测为利福平敏感的菌，有67份的rpoB基因无突变（符合率为93．1％），测序分析发现57份经SSCP检测为突变的rpoB片段均有序列改变，10份经SSCP分析为无突变的有8份无序列改变，SSCP与测序结果的符合率为94．0％，在本研究的菌株中，耐多药结核病（MDR－TB）占76．4％（107／140），有92．5％（99／107）耐多药菌株经SSCP检测有rpoB突变。结论：建立的PCR－SSCP分析方法，是一种较准确和稳定的检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法，可用于临床快速分析患者结核分枝杆菌对利福平的耐药性，并可作为MDR－TB判断的一个重要指标。     

结核分枝杆菌rpoB基因突变的测序研究

目的　了解南通地区耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变特征。 方法　对 36株临床分离菌株rpoB基因 5 0 2～ 5 33位点进行序列测定。结果　耐利福平 (RFP)分离株 93 3% (2 8/30 )存在rpoB基因突变 ,5 31位突变率 5 3 3% (16 /30 ) ,5 2 6位2 3 3% (7/30 ) ,5 16位 6 7% (2 /30 ) ,联合突变 3 3% (1/30 ) ,敏感菌株均无突变。结论　rpoB基因突变与利福平耐药密切相关 ,以 5 31位突变为主。     

用DNA芯片快速检测结核分枝杆菌对异烟肼的耐药性

本研究采取的方法是针对耐药性基因突变情况设计相应的探针 ,然后将合成好的寡核苷酸探针点阵 ,并固定于玻璃片表面制作DNA芯片 ,通过杂交的方法对结核分枝杆菌(TB)异烟肼耐药性进行检测。报告如下。一、材料与方法1 TB菌株均由上海市肺科医院提供 ,4 0株耐异烟肼菌株 ,5株异烟肼敏感株 ,1株标准株 (敏感株H3 7RV) ,均已通过常规的耐药性检测。2 DNA制备 :采用本实验室自制的标本前处理试剂盒提取DNA。3 探针及引物设计 :TB基因组中与耐异烟肼有关的基因主要有katG结构基因、inhA调节区域、ahpC调节区域 ,分别根据genebank中每个…     

耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因序列研究

目的 研究杭州地区结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）对利福平（RFP）的耐受与rpoB基因突变的关系。方法 随机挑选了90例结核杆菌感染的病例。选择了利福平作为主要的药物进行药敏实验，PCR扩增39株耐RFP结核分支杆菌的rpoB基因片段（580bp）；测定扩增片段的序列。并与美国国立生物信息中心（www．ncbi．nlm．nih．gov／nucleotide）检索获得结核杆菌野生株（利福平敏感株）序列（登陆号：AJ749948）作对比分析。结果 结果显示PCR结核测序方法得到了39例结核杆菌耐药株。51例敏感株，与药敏实验的方法检测的结果完全一致。测定的11株临床分离的耐药株中，526位或531位有突变，其中526位有突变的有7株，占耐药测定株63．6%，531位突变的有4株。占耐药测定株36．4％。未见两位点同时突变。检测的11株敏感株，未见526位或531位有突变。结论 杭州地区结核分支杆菌耐利福平的发生与rpoB基因的526位或531位突变密切相关，与国外的报告基本相似。但526位突变占耐药测定株高达63．6％。如此高比例目前国内外未见相似报道。PCR扩增和产物测序将是临床检测结核分支杆菌耐利福平和耐多药的一种迅速、准确的方法。     

线性探针分析法检测结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变的研究

目的研制线性探针分析法检测结核分枝杆菌(结核菌)rpoB基因耐药突变试剂盒。方法设计15条结核菌rpoB基因野生型和突变型的线性探针，固定尼龙膜上；在rpoB基因引物上标记生物素，扩增结核菌DNA，获得生物素标记扩增产物，与rpoB基因线性探针杂交，加入标记过氧化物酶的亲合素，再加四甲基联苯胺显色。结果应用线性探针分析法检测87株结核菌，其与rpoB基因直接测序法、传统药敏法符合率分别为98．8％(82／83)和94．3％(82／87)。结论线性探针分析法检测rpoB耐药基因突变是一种操作简便、特异性高、敏感性高，易开展的方法。     

PCR—SSCP直接检测临床标本中的结核杆菌rpoB基因突变—附50例报告

目的：探讨聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）直接检测痰标本中的结核杆菌核糖核酸聚合酶亚单位基因（ropB基因,该基因突变便形成结核杆菌利福平耐药株）突变在评价结核杆菌对利福平的耐药性方面的应用价值。方法：以结构杆菌H37Rv株（标准菌株）为对照,应用PCR－SSCP技术直接检测50例痰标本中结核杆菌及培养分离的结核杆菌的rpoB基因突变,并将PCR－SSCP和细菌培养的结果进行比较分析,结果：以细菌培养作为参考方法,PR－SSCP直接检测50例痰标本中的结核杆菌ropB基因突变的敏感性和特异性分别是92％（23／25）和100％（10／10）,用于检测培养分离得到的35株结核杆菌,PCR－SSCP的敏感性和特异性分别为96％（24／25）和100％（10／10）。结论：PCR－SSCP操作简单,快速,准确,可望用于直接检测临床标本中的结核杆菌ropB基因突变,以评价结核杆菌是否对利福平产生耐药性。     

反相斑点杂交快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的 建立以聚合酶链反应(PCR)为基础的寡核甘酸探针反相斑点杂交方法快速检测对利福平耐药的结核菌相关的rpoB基因突变，并评价其临床应用价值。方法 应用PCR-反相斑点杂交方法对利福平耐药的62株结核菌和对其敏感的40株结核菌进行检测，所得结果与传统药敏试验结果以及102株结核菌的直接测序结果进行比较。结果 62株对利福平耐药的菌株中，54株碱基突变被准确鉴定，灵敏度为87．1％(54／62)，阳性预测值为：100％；40株对利福平敏感的菌株均被准确鉴定，特异性为100％，阴性预测值为83．3％(40／48)；准确度为92．2％(94／102)。与测序法结果符合率为99％。结论 以PCR为基础的反相斑点杂交方法其敏感度和特异性均高，无假阳性结果，因此适用于大批量结核菌对利福平耐药性的初筛。     

结核分枝杆菌临床分离株利福平耐药表型及rpoB基因型分析

目的分析结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株利福平(rifampin,RFP)耐药表型及rpoB基因突变关系,阐明MTB RFP耐药株rpoB基因突变特征。方法采用改良罗氏培养基比例法检测387株MTB临床分离株对RFP敏感性,并进行rpoB基因测序。对经测序rpoB基因511位和533位密码子突变株进行RFP最小抑菌浓度(MIC)检测。结果比例法检测387株MTB临床分离株中1,98株RFP耐药株,189株RFP敏感株。rpoB基因测序结果表明1,98株比例法RFP耐药株中1,92株(96.97%)发生rpoB基因突变,涉及16种单位点和24种双位点密码子联合突变类型,单位点和双位点密码子联合突变率分别为84.34%(167/198)和12.63%(25/198),其中发现1种单位点和21种双位点密码子联合突变新类型。最常见的突变位点为531位(51.01%)、526位(21.21%)和516位(7.07%)密码子。6株(3.03%)耐药株在rpoB测序范围内未见突变。189株比例法RFP敏感株中,174株(92.06%)在rpoB基因测序范围内未见突变1,5株(7.94%)发生突变,其中7株CTG511CCG(Leu→Pro)突变和6株CTG533CCG(Leu→Pro)突变。511位和533位密码子突变株MIC检测结果提示其突变与低度耐RFP相关。结论所得数据及一些新的发现为进一步研究MTB RFP耐药机制、研制快速新型分子药敏试验方法提供理论和实际应用依据。     

DNA芯片检测分枝杆菌的临床应用价值

目的：比较DNA-微阵列芯片法和改良罗氏法检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的一致性,探讨DNA-微阵列芯片法在临床上的应用价值。方法应用DNA-微阵列芯片法检测64例改良罗氏法阳性的分枝杆菌核酸,比较两种方法检测结果的一致率;两种方法检测结果不一致样本进行测序验证,以测序结果作为金标准,分析两种方法检测结果的正确率及不一致的可能原因。结果两种方法检测总一致率为93.8%,结核分枝杆菌检测一致率为87.5%,非结核分枝杆菌检测一致率为95.8%。DNA-微阵列芯片法和改良罗氏法共有4例检测结果不一致,与测序结果比对后,改良罗氏法区分结核和非结核的正确率为96.9%;DNA-微阵列芯片法正确率为93.8%,且能鉴定出7种常见分枝杆菌。结论 DNA-微阵列芯片法与作为传统金标准的改良罗氏法检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的一致性好、正确率高。操作简单、快速、灵敏、并且能鉴定出常见分枝杆菌,DNA-微阵列芯片法可作为临床分枝杆菌感染诊断的重要检测手段。     

银染单链构象多态性技术检测结核杆菌rpoB基因突变

目的探讨分子生物学方法在临床标本结核分枝杆菌利福平（ＲＦＰ）耐药性评估中的应用价值。方法设计针对ｒｐｏＢ基因１８３ｂｐ扩增引物,运用聚合酶链反应单链构象多态性分析（ＰＣＲＳＳＣＰ）银染色方法,检测了４５株结核杆菌临床分离株,并对其中部分菌株进一步做了ＤＮＡ序列分析。结果以药敏试验结果为对照,有１６株ＲＦＰ敏感株及２６株ＲＦＰ耐药株经ＳＣＰ方法得到检测,阳性占９３．３％,特异性１００％。对部分菌株１８３ｂｐ片断测序结果显示,ＲＦＰ敏感株无ｒｐｏＢ基因突变,耐药株均发生碱基突变,分别导致编码５３１及５２６位点的氨基酸改变。结论银染ＰＣＲＳＣＰ方法具有简便,快速,准确的特点,提高敏感性,可以对临床标本结核杆菌利福平耐药突变进行鉴定。序列分析证明结核分枝杆菌利福平耐药菌株有ｒｐｏＢ基因突变。     

结核分支杆菌rpoB基因突变与对利福平耐药的关系

目的:研究结核分支杆菌耐利福平(RFP)分离株rpoB基因突变情况并评价英应用价值.方法:采用多聚合酶链式反应-单链构象多态性分析法(PCR-SSCP法)对60株结核分支杆菌rpoB基因进行检测.结果:以结核分支杆菌标准株H37Rv为对照,60株PCR扩增阳性的结核分支杆菌中,共有32株发生突变,总突变率为53.3%(32/60);24株药物敏感株有4株rpoB基因有突变,突变率为16.7%;36株耐药株中,28株rpoB基因有突变,突变率为77.8%.耐药菌株突变率明显高于敏感菌株的突变率(P<0.05).结论:rpoB基因突变是耐RFP结核分支杆菌耐药性的主要分子机制;应用PCR-SSCP可快速检测结核分支杆菌对RFP的耐药性.     

基因芯片检测技术检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药的实际应用效果评价

目的 评价基因芯片检测技术(基因芯片技术)在结核病防治工作中对结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药性的检测效果.方法 利用传统罗氏培养及药敏试验和基因芯片技术同时对开封市2011年3～11月登记的541例涂阳肺结核患者的痰标本进行异烟肼和利福平耐药检测,以传统罗氏培养及药敏试验为金标准对基因芯片技术的检测效果进行评价.结果 具有完整的异烟肼和利福平耐药检测结果的473例患者纳入分析.基因芯片技术对初治涂阳患者异烟肼耐药的检测效果与金标准有统计学差异(P<0.05),灵敏度为68.97%,Kappa值为0.51,阳性预测值为46.51%;检测复治涂阳患者异烟肼耐药的灵敏度为92.59%,Kappa值为0.76,阳性预测值为78.13%;检测初治涂阳患者利福平耐药的灵敏度为90.48%,Kappa值为0.82,阳性预测值为76.00%;检测复治涂阳患者利福平耐药的灵敏度为91.18%,Kappa值为0.82,阳性预测值为88.57%.所有检测结果的特异度均>87.00%,阴性预测值均>93.00%.结论 基因芯片技术对初治涂阳患者异烟肼耐药的检测效果不理想,可能会导致该技术对初治涂阳患者耐多药检测的阳性预测值偏低,在结核病防治工作中造成过度诊断.