江西省高安市两株汉城病毒分离鉴定及全基因组序列分析

目的 对2021年江西省高安市采集的鼠肺样本进行肾综合征出血热汉坦病毒分离鉴定及全基因组序列进行分析.方法 采用Vero-E6细胞分离肾综合征出血热汉坦病毒,采用实时荧光RT-PCR法和直接免疫荧光法对分离株进行鉴定,采用高通量测序技术对分离株进行全基因组测序,采用CLC、MEGA7.0等软件对基因组序列进行分析.结果...     

Flanders病毒TaqMan RT-PCR检测方法的建立

目的 应用TaqMan PCR技术建立针对Flanders病毒(Flanders virus, FLAV)的实时荧光定量PCR检测方法。方法 下载GenBank中FLAV基因序列资料并进行多序列比对分析,选择其L基因中的高保守序列片段进行FLAV特异引物与探针的设计,使用来自于不同科属的15株病毒验证方法特异性,通过重复/平行实验验证方法稳定性,并利用体外转录的L基因RNA标准品建立基因拷贝数绝对定量分析模型。结果 引物与探针工作特异性良好,同一样品重复检测Ct值的变异系数均小于1.7%,定量分析模型灵敏度达到100 copies/PCR。结论 建立完成针对FLAV的TaqMan PCR检测方法。实验结果显示,本方法具有高特异性、高敏感性、高稳定性、简便、易操作的特点,为今后对FLAV的检测、监测及相关研究提供技术手段。     

两株犬源狂犬病病毒街毒株全基因组序列测定与分析

目的对2株犬源狂犬病病毒街毒株全基因组测序,了解国内狂犬病病毒的流行和变异情况。方法采用乳鼠脑内接种方法分离2株天津地区狂犬病病毒街毒株,RT-PCR扩增病毒DNA覆盖全基因组12个相互重叠的基因片段,PCR产物平端克隆后进行全基因组核苷酸序列测定,然后对其分子变异和进化特点进行分析。进行两分离株的序列相似性、氨基酸同源性、主要功能位点的变异比较和种系发生分析。结果 TJD04和TJD05两株狂犬病病毒全基因组长均为11 924 nts,全基因组序列的组成和结构均符合弹状病毒科狂犬病病毒属的特征。病毒基因组由5个编码区组成,基因起始位点和终止位点高度保守,氨基酸编码长度未发生变异,5个编码蛋白序列较少发生变化,仅有个别主要功能位点发生变异,且大部分变异均属于无意义沉默突变。多序列相似性比较和种系发生分析显示,两株病毒均属于基因1型,N基因与全基因进化树保持一致,与中国犬源狂犬病病毒BD06同源性最高(99.6%),进化关系近,并具有较为独特的中国地域特点。结论两天津株狂犬病毒可能是自然界中固有的狂犬病病毒街毒株。     

一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光定量 RT-PCR检测方法的建立

目的 建立一种汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)和汉城病毒(Seoul virus,SEOV)双重实时定量荧光RT-PCR检测方法.方法 根据HTNV和SEOV S基因设计引物和探针、优化反应条件,建立2种汉坦病毒的双重实时荧光定量RT-PCR方法.以甲型流感病毒、登革热病毒、新布尼亚病毒、寨卡病毒、新冠...     

基因组序列揭示禽流感病毒高致死率原因

据医学空间网1月31日报道，美国科学家对各种流感病毒基因组序列的分析比较表明，有一种蛋白质可能是导致H5NI型禽流感病毒高致死率的关键。这一发现不仅揭示了禽流感病毒感染人类的机制，也为未来研制抗流感药物提供了线索。     

Real-time RT-PCR检测西尼罗病毒一步法的建立

目的建立针对西尼罗病毒E基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于西尼罗病毒感染样本的快速准确检测和定量。方法针对西尼罗病毒的保守基因E设计引物和探针,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性。结果本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出西尼罗病毒,不与日本脑炎病毒及其他病毒产生交叉反应。该方法的最低检出浓度为3.6×102copies/μl,标准曲线的线性范围为3.6×102～3.6×107copies/μl。结论本研究建立的一步法real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于西尼罗病毒感染样本的检测。     

西尼罗病毒RT-PCR检测方法的建立及其初步应用

目的　建立西尼罗病毒 (WestNilevirus ,WNV)RT PCR检测方法 ,为WNV感染的诊断和流行病学调查奠定基础。方法　选择Vero E6细胞进行WNV培养 ,通过乳鼠脑内接种病毒培养液获得WNV感染脑组织。在病毒基因组E区和C区设计 3对引物 ,以WNV培养液 ,建立并优化病毒核酸RT PCR分析方法。然后 ,以此对感染蚊虫模拟标本和乳鼠脑组织进行检测。PCR产物测序后 ,用Blast进行同源性分析。结果　用RT PCR在WNV培养液中扩增出与预期大小一致的核苷酸片段 ,并通过改变循环数 ,模板稀释倍数等参数对该方法进行了优化 ;将建立的方法用于检测感染蚊虫模拟标本和感染乳鼠脑组织 ,均检测出WNV目的基因片段 ,且扩增效果与病毒培养液无明显差异 ;套式PCR能显著提高检测的敏感性 ( 10 8-10 9倍 )。结论　本研究建立的WNVRT PCR检测方法具有较高的敏感性 ,可用于WNV感染的流行病学调查研究     

马达里亚加病毒TaqMan RT-PCR检测方法的建立

目的 建立马达里亚加病毒(Madariaga virus, MADV)早期且快速的TaqMan反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法。方法 从GenBank中下载MADV基因序列,根据多序列比对结果选择MADV的NSP1基因中的高保守序列片段设计引物与探针,利用体外转录的RNA 标准品建立了MADV的绝对定量分析模型,并进行灵敏度和特异性评价以及重复性验证。结果 该检测方法的灵敏度为1.0×10²拷贝/反应,与其它虫媒病毒无交叉反应,重复性检测变异系数均小于1.5%。通过本研究建立的快速检测方法对源自宁夏回族自治区、浙江省和云南省的共计81份不明原因脑炎病例血清标本及161批库蚊标本进行了测定,检测结果均为阴性。结论 成功建立了MADV TaqMan RT-PCR的快速检测方法,可应用于实验室的早期检测。     

Detection of the nucleophosmin gene mutations in acute myelogenous leukemia through RT-PCR and polyacrylamide gel electrophoresis

Objectives: Mutations in the C‐terminal region of the nucleophosmin (NPM1) gene occur in approximately 60% of acute myeloid leukemia (AML) cases with normal karyotype and represent the most common genetic lesion presently known in this disease. Because of their frequency and favorable impact on prognostic outcome, screening for this aberration is currently recommended in routine diagnostic characterization of AML. Several techniques enabling to detect NPM1 mutation have been reported, but all require sophisticated equipment, which represent an obstacle particularly in countries with limited resources. Methods: We designed an RT‐PCR strategy to amplify NPM1 exon 12 followed by electrophoresis and fragment visualization on polyacrylamide gels to discriminate a 4–5 bp size difference resulting from mutations in this gene. A hemi‐nested method was designed to increase sensitivity for the study of minimal residual disease (MRD). Results: The assay enabled specific detection of NPM1 mutations in 12/36 patients. A 10^?2 sensitivity level was obtained using one amplification round, while the hemi‐nested PCR approach yielded a 10^?5 sensitivity level, therefore proving useful to assess MRD in patients carrying the mutation. The results were independently validated in 24 AML cases by sequencing analysis. Conclusions: This simple and low‐cost assay may integrate diagnostic work‐up of AML and could be used for assessment of response to therapy in patients with NPM1 mutations.     

黄病毒属病毒CODEHOP RT—PCR检测方法的建立

目的建立一种能快速检测黄病毒属病毒的CODEHOPRT—PCR方法。方法根据GenBank发丧的不同黄病毒多聚蛋白氯基酸序列,利用CODEHOP方法设计合成一对引物,建立能快速检测黄病毒属所有病毒的CODE～HOPRT—PCR方法,并用3种不同病毒株对该方法进行特异性和灵敏度评价。结果建立的CODEHOPRTPCR能埘黄病毒RNA进行特导性扩增,目的片段的大小（400-500bp）和序列与预期结果相符。该方法对黄病毒恢酸的最小检出量为8Pg。结论建立的CODEHOPRT—PCR方法特异强、灵敏高,可用于黄病毒的榆测。     

hTERT mRNA levels by real-time RT-PCR in acute myelogenous leukemia

The purpose of this study was to investigate whether levels of hTERT mRNA, as determined by real-time RT-PCR, are associated with prognosis and clinical course in AML patients. Fifty-four bone marrow specimens from 21 patients diagnosed with de-novo AML were included. The level of hTERT mRNA was measured with the Telo TAGGG hTERT Quantification Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), using a LightCycler Instrument (Roche Diagnostics). The level of hTERT mRNA was determined as the relative ratio (RR), which was calculated by dividing the level of hTERT mRNA by the level of the porphobilinogen deaminase (PBGD) housekeeping gene in the same samples [1,000x(hTERT/PBGD)]. The expression rates of hTERT mRNA were significantly higher at diagnosis (73%) and during relapse (80%) than during remission (27%) (P<0.05). The median RR for diagnosis or relapse was significantly higher than that for patients in remission (P<0.05). hTERT mRNA expression was not correlated with CD34 expression, blast counts, white blood cell counts, or chromosomal abnormality (P>0.05). Two patients who showed hTERT mRNA expression during remission (RR 3.14 and 7.15, respectively) relapsed after 1 month. Among seven patients with high hTERT mRNA levels (RR>9.51), 4 failed to achieve complete remission (CR), whereas 4 of 5 patients without hTERT mRNA expression at diagnosis or during relapse achieved CR (P>0.05). Patients showing a trend of increasing hTERT mRNA levels failed to reach a second CR after relapse, while those with a trend toward decreasing hTERT mRNA did achieve CR. Among eight samples showing hTERT mRNA expression in remission (RR>0), 5 were obtained from patients who had received GCSF within 14 days. The expression rate and level of hTERT mRNA during remission were significantly higher in patients who had previously received GSCF (56%, RR=0.15) than in other patients (15%, RR=0) (P<0.05). Serial and quantitative analysis of hTERT mRNA may be a useful marker for prediction of prognosis and monitoring in AML patients.     

原位RT-PCR法检测柯萨奇B病毒RNA的实验研究

目的建立定位检测细胞或组织中柯萨奇Ｂ病毒ＲＮＡ的原位ＲＴ－ＰＣＲ方法（直接法）。方法对柯萨奇Ｂ病毒（１～６型）感染ＨｅＬａ细胞,经核酸酶（ＤＮａｓｅ和ＲＮａｓｅ）处理后的病毒感染ＨｅＬａ细胞以及非感染的ＨｅＬａ细胞进行原位ＲＴ－ＰＣＲ检测。结果经扩增后,病毒感染的ＨｅＬａ细胞呈蓝黑阳性信号;并且这种阳性信号经ＲＮａｓｅＡ作用而消失,却不受ＤＮａｓｅ作用的影响;而非感染的ＨｅＬａ细胞则不着色。结论原位ＲＴ－ＰＣＲ法可特异地检测柯萨奇Ｂ病毒感染ＨｅＬａ细胞中的病毒ＲＮＡ,是一种特异和敏感的定位检测方法,可应用于研究该病毒的持续性感染及其与克山病等相关疾病的关系     

聚合酶链反应技术在隐孢子虫检测中的应用研究

根据Laxer等克隆的微小隐孢子虫（C．parvum）核酸序列片断（pHCl）设计并合成一对长度为20hp的寡核苷酸引物。应用聚合酶链反应，对隐孢子虫核酸进行扩增，结果扩增出452hP的特异性条带，阴性对照无扩增。结果表明所合成引物有高度特异性。用PCR检测隐抱子虫感染动物模型，36份镜检卵囊阳性小鼠粪便均为阳性，18份镜检阴性小鼠粪便17份阴性，一份阳性。     

A comparative analysis of two tissue procurement approaches for the genomic profiling of clinical colorectal cancer samples

Background  The basis for personalized medicine is the creation of a repository of knowledge about the genetic alterations involved in disease processes. Integral to achieving this goal is the querying of well-preserved, high-quality human tissue samples. Making these findings relevant involves the interrogation of large numbers of samples. The pace with which changes have occurred versus the potential pace with which changes can occur may be indicative of problems associated with traditional approaches on collecting biospecimens. Therefore, transforming personalized medicine from concept to reality may require an alternative approach in the field of tissue specimen procurement. Materials and methods  “Exfoliation and Enrichment” (EE), a recently described rapid and cost-effective approach for procuring cells, was utilized and assessed relative to a more traditional but temporally and economically comparable approach. Material from the same tumor sample, one collected by EE but the other frozen, were procured, the DNA extracted, and the samples analyzed at the global and gene-specific level by array comparative genomic hybridization and quantitative polymerase chain reaction, respectively. Results  Both approaches resulted in the rapid procurement and retrieval of well-preserved cells and nucleic acids. The presence of “contaminating” normal cells in the more traditional approach masked the significance of genetic gains and losses, findings that were more readily apparent from the material derived by the EE method. Conclusion  The EE approach represents a cost-effective alternative to traditional cell-procurement methods that results in the generation of superior genomic data.     

应用广谱引物PCR法检测立克次体的研究

本文选用普氏立克次体柠檬酸合成酶基因做为靶序列合成一对引物（ＲＰＣＳ８７７ｐ和ＲＰＣＳ１２５８ｎ）。用该对引物对不同种类立克次体（包括：加拿大；普氏；莫氏；Ｑ热；恙虫病Ｇｉｌｌｉａｍ株、Ｋａｔｏ株、Ｋａｒｐ株；澳大利亚；立氏；康氏；小蛛；西伯利亚２４６、西伯利亚２３２；精河；内０１；内Ｗ８８；黑８４；黑０５４）及大肠杆菌ＨＢ１０１，ＤＮＡ进行扩增。同时，选用三种不同方法处理模板进行扩增结果的比较。结果表明：该引物可扩增除恙虫病以外的所有立克次体，而大肠杆菌、λＤＮＡ不能被扩增。采用简单煮沸法处理模板，对含立克次体的材料进行扩增是可行的。     

PCR技术鉴定布氏菌

目的用PCR技术检测鉴定羊种布氏菌和牛种布氏菌1、2、4型。方法根据文献发表的3对引物(简称B、M、A),用PCR技术对细菌DNA进行扩增,在属和种的水平上鉴定布氏菌。结果用B引物进行PCR扩增可以在属的水平上鉴别布氏菌,M引物可以鉴别羊种布氏菌,A引物可以鉴别牛种布氏菌1、2、4型和沙林鼠种。B、M、A 3对引物PCR鉴别结果与常规方法鉴定结果相符率分别为100%、92.0%和87.5%。结论PCR技术对细菌DNA进行扩增,可以在属和种的水平上鉴别布氏菌。布氏菌牛种9型的PCR扩增产物与布氏菌其他生物型有差异,说明牛种9型布氏菌在基因上不同于其他布氏菌。目前所用的表型分型技术存在着与本试验所用基因分型方法的不一致性。     

人类免疫缺陷病毒感染的静脉吸毒者TT病毒的检测和部分基因序列分析

目的 研究人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的静脉吸毒者TT病毒（TTV）感染情况和基因序列变化。方法 用聚合酶链反应（PCR）对35例HIV感染的静脉吸毒者（IVDUs),64例HIV未感染的IVDUs及45例正常献血员进行TTV DNA检测。对其中2例HIV感染的IVDUs和1例HIV未感染的IVDUs的TTV DNA部分基因核苷酸序列进行测定。结果 TTV DNA在HIV感染的IVDUs中检出率为25．71％（9／35）,HIV未感染的IVDUs中检出率为17．18％（11／64）,两者差异无显著性（P＞0．05）,正常献血员中的检出率为2．2％（1／45）。对2例HIV感染的IVDUs TTV DNA部分基因核苷酸序列与日本株比较,其同源性分别为96．44％和95．79％,对1例HIV未感染的IVDUs的TTV DAN部分基因核苷酸序列与日本株比较其同源性为98．25％;HIV感染和HIV未感染的IVDUs TTV DNA核苷酸序列比较,HVI感染者在被测定序列的第299－309位碱基有较大的变 异。结论 静脉吸毒是TTV感染的高危因素,TTV在IVDUs中感染率与HIV感染无明显相关性;HVI感染和HIV未感染者TTV DNA序列可能存在一定差异。     

实时荧光RT-PCR检测凝血块中乙脑病毒RNA

目的探索建立灵敏便捷的乙脑病毒核酸检测方法,为临床疑似乙脑病例提供可靠辅助诊断依据。方法采用基于SYBR Green I染料的实时荧光RT-PCR方法,对一系列乙脑病毒检测引物进行综合评价,并应用于部分临床确诊或疑似乙脑病例血清和凝血块中病毒核酸检测。结果根据9对引物检测连续稀释病毒RNA的扩增曲线和融解曲线,筛选出1对灵敏度和特异性较好的引物。该体系分别检测15份乙脑病毒IgM阳性和15份IgM阴性患者的血清和凝血块中提取的核酸,血清样品全部为阴性,而凝血块样品发现7份核酸阳性。结论从患者凝血块中提取核酸样品,可以用于JEV感染的实验室诊断。在我们建立的乙脑病毒核酸实时荧光PCR检测体系中,首次发现凝血块样品比血清样品灵敏度更高,说明凝血块用于病毒性脑炎实验室诊断具有重要价值。