线粒体融合素基因-2对乳腺癌细胞凋亡的影响

目的研究外源性线粒体融合素基因-2(mfn2)对乳腺癌细胞(MCF-7)凋亡的影响。方法在阳离子聚合物的介导下将含有mfn2 cDNA的质粒在体外转染MCF-7,蛋白印记法(Western blot)检测绿色荧光蛋白(GFP),MTT法检测mfn2对MCi-7细胞增殖的影响。采用Annexin-V/PI双标记法检测转染前后细胞凋亡的变化,JC-1标记细胞线粒体,在流式细胞仪上检测线粒体跨膜电位(△ψm)的变化,电镜观察超微结构的变化。结果转染mfn2基因的MCF-7细胞可以稳定高表达GFP蛋白。MTT实验提示,转染mfn2 cDNA后,MCF-7细胞增殖明显受到抑制,转染mfn2 cDNA后48 h,△ψm下降。与转染pEGFlP组和空白对照组相比,转染pEGFP mfn2组明显促进凋亡,其凋亡率分别为:转染组16.0%,转染空质粒组3.6%,空白对照组4.8%(P<0.05)。电镜观察显示,mfn2使线粒体嵴断裂、消失、基质疏松,肿胀的线粒体围绕在核周呈密集排列。结论mfn2基因在体外转染MCF-7细胞,细胞线粒体膜电位降低,线粒体嵴断裂、消失,细胞凋亡明显增加。     

线粒体融合素基因-2对人乳腺癌MCF-7细胞株增殖与化疗敏感性的影响

背景与目的:线粒体融合素基因-2(mitofusin-2 gene,mfn2)是作用于线粒体外膜的一种增殖抑制基因,mfn2过表达可抑制血管平滑肌细胞的增殖.本研究探讨外源性mfn2对人乳腺癌细胞MCF-7增殖以及化疗敏感性的影响.方法:将含有mfn2 cDNA的质粒在阳离子聚合物的介导下体外转染MCF-7细胞,Western blot法检测绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达,细胞计数及MTT法检测mfn2对MCF-7细胞增殖的影响,流式细胞术检测MCF-7细胞周期分布及喜树碱处理前后细胞凋亡的变化.结果:转染mfn2基因的MCF-7细胞可以稳定高表达GFP.MTT实验提示转染mfn2 cDNA后,MCF-7细胞增殖明显受到抑制,DNA直方图显示细胞停滞于S期,转染mfn2 cDNA组S期细胞比率为(42.7±1.3)%,高于转染空质粒组的(17.2 2.0)%和空白对照组的(19.6±1.7)%(P＜0.05).mfn2基因转染后诱导的细胞凋亡率从(3.6±0.6)%升高到(16.0±0.3)%;加入喜树碱4 h后转染mfn2基因的细胞凋亡率为(69.6 4.3)%,高于转染空质粒组的(31.0±1.8)%和空白对照组的(23.4 2.8)%(P＜0.05).结论:转染mfn2基因可以明显抑制MCF-7细胞的增殖,增强MCF-7细胞对喜树碱的敏感性.     

线粒体融合素基因-2与肿瘤

线粒体融合素基因-2（mitofusin-2 gene, Mfn-2 ）是作用于线粒体外膜的一种增殖抑制基因,在维持线粒体的形态、功能等方面起着重要作用。随着研究的不断深入, Mfn-2 在细胞信号转导、能量代谢、增殖及凋亡等生命过程中的作用日益显现。而肿瘤发生与细胞过度增殖及凋亡不足等密切相关,因此,如何抑制肿瘤细胞的过度增殖和促进细胞凋亡已成为目前的研究热点。 Mfn-2 通过多条通路参与多种肿瘤传代细胞系的增殖和凋亡,其表达异常或功能缺失可能是肿瘤发生、发展的重要原因。 Mfn-2 在许多肿瘤组织中低表达,且表达情况与肿瘤病理类型及生物学行为密切相关,提示其有可能是新的抑癌基因;同时, Mfn-2 过表达与喜树碱、放线菌酮（cycloheximide,CHX）等化疗药物联用具有协同作用,提示具有成为化疗增敏靶点的潜力。本文就 Mfn-2 的功能与肿瘤发生、发展的关系及其治疗学意义的相关研究进展进行综述。     

人乳腺癌细胞RECK基因的表达及检测

目的:研究人乳腺癌细胞株RECK基因的表达,阐明RECK基因表达水平与乳腺癌细胞侵袭力的关系。方法:采用transwell法,测定HBL-100,MCF-7和MDA-MB-435S三株人乳腺(癌)细胞的体外侵袭能力,同时应用免疫细胞化学技术,Westernblotting和RT-PCR技术分别检测三株细胞株MMP-2,MMP-9和RECK基因蛋白表达水平,及RECK基因mRNA转录丰度。结果:三株细胞中,MDA-MB-435S侵袭力最高(425.20±54.09),HBL-100最低(101.00±63.88),MCF-7居中,为(239.00±91.39),三组细胞的侵袭力比较差异均有显著性(P<0.01)。RECK基因在HBL-100细胞株中蛋白表达水平最高(免疫细胞化学值:3188.24±894.86;Westernblotting值:3.32±0.25),在MDA-MB-435S细胞株中不表达,MCF-7为(免疫细胞化学值:1058.92±336.53,P<0.01;Westernblotting值:2.23±0.59,P<0.05)。且在免疫细胞化学中,RECK基因的蛋白表达与MMP-2,MMP-9的表达水平成负相关。RECK基因在HBL-100细胞株中mRNA水平最高(2.32±0.02),在MDA-MB-435S细胞株中不表达(P<0.001)。结论:RECK基因表达水平与乳腺癌细胞体外侵袭力及MMP-2,MMP-9的表达水平成明显负相关。     

线粒体融合蛋白-2基因增强人乳腺癌T47D细胞对小白菊内酯的敏感性

目的:探讨线粒体融合蛋白-2(mitofusin-2,Mfn-2)基因表达对人乳腺癌T47D细胞对小白菊内酯敏感性的影响。方法:Real-time PCR检测不同乳腺癌细胞系(T47D、MDA-MB-231、MCF-7、MDA-MB-435及HCC38)中Mfn-2 mRNA的表达。LipofectamineTM2000体外转染pEGFP和pEGFP-Mfn-2质粒至人乳腺癌T47D细胞,real-time PCR和Western blotting检测T47D细胞中Mfn-2 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测T47D细胞的增殖,流式细胞术检测T47D细胞凋亡率及线粒体膜电位。结果:与正常乳腺细胞相比,Mfn-2 mRNA在乳腺癌HCC38细胞系中高表达,在T47D等其他细胞系中均低表达。pEGFP-Mfn-2转染48 h后,T47D细胞中Mfn-2 mRNA和蛋白的表达均明显上调。与pEGFP转染组相比,pEGFP-Mfn-2转染组T47D细胞在小白菊内酯(0.05 mol/L)作用下的存活率明显降低[(47.93±2.21)%vs(56.93±2.05)%,P<0.05]。流式细胞术检测结果显示:50 mmol/L小白菊内酯作用下,pEGFP-Mfn-2转染组与pEGFP转染组相比,T47D细胞凋亡率升高[(71.2±2.1)%vs(38.8±2.6)%,P<0.05],而线粒体膜电位明显降低[(1.6±0.1)%vs(5.0±0.5)%,P<0.05]。结论:pEGFP-Mfn-2转染可增强T47D细胞对小白菊内酯的敏感性。     

HIF-2α对乳腺癌MCF-7细胞生物学功能的影响

目的 探讨HIF-2α对乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭及成瘤能力的影响。方法 利用HIF-2αORF/shRNA慢病毒颗粒分别感染乳腺癌MCF-7细胞,筛选构建MCF-7 HIF-2α上调或下调的稳定细胞株;利用Real-time PCR和Western blot方法分别检测HIF-2α mRNA和蛋白的表达水平;CCK-8方法检测细胞增殖活力;Transwell小室侵袭实验检测细胞的侵袭能力变化;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。结果 HIF-2α shRNA质粒转染MCF-7细胞后HIF-2α的表达水平均显著下降;HIF-2α ORF质粒转染MCF-7细胞后HIF-2α的表达水平显著升高。CCK-8检测结果显示：HIF-2α上调后MCF-7细胞增殖活力增强;Transwell小室实验结果显示：HIF-2α上调后MCF-7细胞侵袭能力增强;平板克隆形成实验结果显示：HIF-2α上调后MCF-7细胞克隆形成能力增强。而HIF-2α下调MCF-7细胞具有相反趋势。结论 HIF-2α过表达能够增强MCF-7细胞增殖活力、促进肿瘤细胞侵袭和克隆形成。     

基质金属蛋白酶-9基因及RECK基因在肝癌组织中的表达

目的探讨肝癌患者基质金属蛋白酶-9（MMP-9）基因及RECK基因表达的情况。方法33例原发性肝细胞癌患者术中取癌组织及癌旁组织;提取组织总RNA;用逆转录共扩增定量PCR方法测定MMP-9基因及RECK基因表达水平。结果肝癌组织MMP-9基因表达水平明显高于癌旁的肝硬化组织及正常肝组织,肝癌组织RECK基因表达水平明显低于癌旁的肝硬化组织及正常肝组织。肝癌患者MMP-9基因表达水平与血清AFP浓度、肿瘤大小无关。RECK基因及MMP-9基因在肝癌组织中的表达呈负相关（P=0．019）。结论RECK与MMP-9在肝癌组织中的表达呈负相关;MMP-9及RECK基因在肝癌的进展中可能起重要作用。     

REGgamma基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响

目的:探讨蛋白酶体激活因子REGgamma(REGγ)基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的作用.方法:构建真核表达重组体PcDNA3.1-REGγ,通过脂质体转染将REGγ基因导入MCF-7,以G418(800mg/L)连续筛选获得稳定高表达REGγ基因的细胞株,以转染空载体和未转染细胞作为对照.分别利用MTT法及免疫细胞化学方法检测各组细胞PCNA的表达分析REGγ基因对细胞增殖的影响;以Caspase-3分光光度法及AnnexinV-FITC的流式细胞仪(FCM)来检测细胞凋亡的变化;以透射电镜(TEM)观察细胞超微结构的改变.结果:获得稳定转染且高表达REGγ的细胞株.经Western Blot检测转染REGγ基因的细胞(实验组),其REGγ蛋白表达明显高于对照组细胞(P＜0.05);未转染组、空载体组和实验组细胞的倍增时间分别为34.6、35.1、26.7h.提示实验组细胞倍增时间缩短;MTT法绘制生长曲线提示实验组细胞生长明显加速;免疫细胞化学检测PCNA结果显示,未转染组、空载体组和实验组细胞的染色灰度值分别为89.61±14.32、87.95±16.38、133.47±8.14,表明实验组细胞PCNA表达明显增强(P＜0.01);Caspase-3分光光度法检测显示,实验组细胞的OD值普遍低于对照组(P＜0.05);Annexin V-FITC的FCM检测显示,实验组细胞的凋亡率明显低于对照组(P＜0.01);TEM观察实验组细胞表现为核仁肥大,线粒体、高尔基体丰富或扩张,未见凋亡小体形成.结论:REGγ基因具有促进乳腺癌MCF-7细胞增殖并抑制其凋亡的作用.     

过表达ADAM17对乳腺癌细胞侵袭能力影响

目的 通过调高MCF-7人乳腺癌细胞ADAM17的表达,探讨其对乳腺癌细胞侵袭力的影响.方法 MCF-7细胞成功转染慢病毒载体(LV8N-ADAM17)后,实验分为转染组、无义序列组、空白对照组,通过荧光显微镜观察转染效果.采用实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法分别检测各组MCF-7细胞ADAM17、EGFRmRNA和A...     

5-氮杂-2ˊ-脱氧胞苷对乳腺癌细胞RASSF1A甲基化的逆转作用

目的：通过甲基化抑制剂5-氮杂-2ˊ-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）作用于乳腺癌细胞株MCF-7,探索5-Aza-CdR逆转乳腺癌抑癌基因RASSF1A甲基化作用的机理。方法：体外培养乳腺癌细胞株MCF-7细胞,使用不同浓度5-氮杂-2ˊ-脱氧胞苷处理MCF-7细胞,对照组不加药。MSP及Western blot分别检测经5-Aza-CdR处理前、后RASSF1A DNA、蛋白的表达情况。结果：经去甲基化药5-Aza-CdR作用后,实验组恢复了RASSF1A的表达,明显高于对照组（ P〈0.05）。结论：去甲基化药5-Aza-CdR可以逆转乳腺癌细胞RASSF1A的甲基化作用,恢复了RASSF1A蛋白的表达,为临床治疗乳腺癌提供了理论基础。     

非小细胞肺癌组织中RECK蛋白的表达及与预后的关系

目的探讨非小细胞肺癌组织中RECK的表达及其与预后的关系。方法采用免疫组化SP法检测RECK在48例肺癌组织和癌旁正常组织中的表达情况,通过Kaplan-Meier生存曲线法比较阳性组和阴性组患者的预后情况。结果肺癌组织中RECK表达阳性率为29.2%（14/48）,在癌旁正常肺组织中阳性表达率为85.7%（42/48）,两组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。RECK的表达与淋巴结转移和TNM分期有关,而与患者年龄、性别、肿瘤大小、组织学分化程度无关。与无淋巴结转移和Ⅰ、Ⅱ期的肺癌组织相比,在有淋巴结转移和Ⅲ期的肺癌组织中,RECK的阳性表达显著性降低（P〈0.05）。RECK蛋白阴性组的患者的生存期较阳性组短,统计学上有显著性差异（P=0.018）。结论RECK蛋白在肺癌中具有低表达,在肺癌的侵袭和转移中发挥重要作用,并与肺癌患者的预后相关。     

幽门螺旋杆菌感染对胃上皮细胞RECK基因的影响

目的研究幽门螺旋杆菌（helicobacter pylori,Hp）感染对胃上皮细胞（GES-1）RECK基因启动子区域的甲基化以及mRNA表达水平的影响,并探讨其可能的致癌机制。方法用培养的Hp感染GES-1细胞0～144h。采用甲基化特异性聚合酶链式反应法检测RECK基因启动子区域的甲基化情况;逆转录PCR检测RECK基因mRNA水平;Westernblot检测核转录因子（NF-κB）的激活情况,并观察用NF-κB特异性抑制剂PDTC处理后的RECK的mRNA水平。结果 Hp感染GES-1细胞0～72h不能诱导RECK基因甲基化,感染96h后GES-1细胞内出现了明显的RECK基因甲基化,同时能降低RECK基因mRNA水平。Hp感染24h后能激活其NF-κB,24～72hNF-κB活性水平无明显改变。感染96h后NF-κB的活性有所增强,NF-κB特异性抑制剂PDTC能上调RECK基因的表达。结论 Hp感染通过诱导RECK基因启动子区域的甲基化,促进NF-κB激活,降低RECK基因的表达,这可能是Hp致胃癌的可能机制之一。     

HER2基因转染MCF-7细胞及生物学特性观察

目的:建立共表达HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)基因和ER(Estrogen Receptor)基因的细胞模型,并观察转染细胞的生物学活性.方法:构建真核表达载体pcDNA3.1-HER2,利用脂质体介导将其转染ER阳性的乳腺癌MCF-7细胞,经G418筛选阳性克隆.用RT-PCR、Western blot及免疫细胞化学等方法检测HER2基因在MCF-7细胞中的稳定表达情况,并通过MTT法和肿瘤细胞侵袭实验,观察转染细胞的生物学活性.结果:在mRNA和蛋白水平证实,转染细胞内有HER2基因的高表达,转染后细胞的增殖能力和侵袭能力明显增强.结论:构建含HER2基因的重组载体,导入乳腺癌MCF-7细胞后,获得生物学活性稳定的HER2基因和ER基因高表达的细胞模型,为进一步研究奠定了基础.     

RECK和MMP-9在子宫内膜癌组织中的表达及其临床意义

目的:检测子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)组织中RECK(reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs)mRNA和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)mRNA的表达情况,探讨两者在子宫内膜癌中的临床意义。方法:选取2009年3月至2010年11月在滨州医学院附属医院妇科接受手术的子宫内膜癌患者组织标本42例,应用定量PCR法检测RECK mRNA及MMP-9 mRNA在子宫内膜癌中的表达情况,分析其相关性和临床意义。结果:在正常增生期子宫内膜、子宫内膜不典型增生、子宫内膜癌组织中RECK mRNA表达水平依次降低[(6.30±0.34)、(4.29±0.36)、(0.24±0.18),F=427.35,P<0.05],MMP-9 mRNA依次升高[(0.08±0.82)、(5.04±0.30)、(6.22±0.32),F=1117.52,P<0.05],RECK和MMP-9 mRNA的表达与子宫内膜癌临床分期、分化程度、淋巴转移关系密切(P<0.05),在子宫内膜癌中,MMP-9mRNA和RECK mRNA之间存在负相关(r=-0.478,P<0.01)。结论:定量PCR检测RECK mRNA和MMP-9 mRNA对子宫内膜癌早期诊断及预测癌前病变风险有一定参考价值。     

Apogossypolone对乳腺癌MCF-7细胞株放射增敏的体外实验研究

[目的]探讨Apogossypolone(ApoG2)对乳腺癌MCF-7细胞株的放射增敏作用及其作用机制。[方法]①MTT法检测ApoG2单药对MCF-7细胞的抑制率,确立细胞半数抑制浓度(IC50)。②根据MTT结果选取低浓度(相似文献   

siRNA沉默DNMT1对人乳腺癌细胞MCF-7生长的影响

目的 靶向人DNMT1（DNA methyltransferase 1, DNMT1）构建RNA干扰载体,研究其对乳腺癌细胞周期、增殖及凋亡的影响。方法 靶向DNMT1基因设计三条短发夹状RNA(short hairpin RNA, shRNA) 的寡核苷酸片段,构建重组体pGCsi-DNMT1,转染至乳腺癌细胞株MCF-7,定量PCR 法检测DNMT1 mRNA表达水平;流式细胞技术分析细胞周期的变化;MTT 法检测细胞生长情况;Annexin V/PI双染法观察细胞凋亡情况;定量PCR 法分析沉默DNMT1基因后对RASSF1A、p16、p21、p27及ERβ基因表达的影响。结果 在构建的靶向DNMT1的shRNA重组质粒pGCsi-DNMT1中,成功筛选到pGCsi-T3能显著下调DNMT1的表达。实时定量PCR检测结果证实重组质粒pGCsi-DNMT1对乳腺癌MCF-7细胞中DNMT1基因的转录有明显的抑制作用。MCF-7细胞转染后,pGCsi-DNMT1可明显抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖;大量细胞发生凋亡;细胞周期分析可见S期明显减少,而G₁/G₀期细胞显著增加;定量PCR检测到乳腺癌细胞中RASSF1A、p16、p21及ERβ基因mRNA表达水平明显升高,而p27基因表达水平未见明显变化。结论 重组质粒pGCsi DNMT1能特异有效地抑制MCF-7细胞内DNMT1的表达、 抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,并可通过抑制DNMT1的活性来解除相关基因启动子区的高度甲基化状态,从而促进肿瘤相关基因的表达,提示DNMT1可作为乳腺癌基因治疗的新靶标。     

别直参抑制人乳腺癌细胞MCF-7体外增殖

[目的]评价别直参对MCF-7细胞体外增殖的影响,并检测其对凋亡相关蛋白bax/bcl-2表达的影响.[方法]采用MTT比色法检测对MCF-7细胞增殖的作用;流式细胞术检测对MCF-7细胞凋亡的影响;免疫组化法检测bax/bcl-2的表达.[结果]别直参高剂量组作用MCF-7细胞24h后,MTT检测增殖率为89.83％,提示有抑制MCF-7细胞体外增殖的作用(P＜0.05);流式细胞术检测高剂量组细胞凋亡率明显升高(P＜0.05);免疫组化法检测高剂量组能上调MCF-7细胞bax的表达,并下调bcl-2的表达.[结论]别直参高剂量组具有一定的诱导MCF-7细胞凋亡效应作用,其机制可能通过上调bax的表达和下调bcl-2的表达.     

乳腺癌MCF-7细胞的分子生物学特征

目的研究乳腺癌MCF-7细胞的分子生物学特征。方法采用甲基化特异性PCR(MSP),对MCF-7细胞进行Stratifin和CyclinD2基因甲基化检测;采用RT-PCR法,检测Stratifin、CyclinD2和Dnmt3b基因的mRNA表达。结果乳腺癌MCF-7细胞系中,Stratifin基因是非甲基化的,mRNA表达水平较高;CyclinD2基因完全甲基化,mRNA表达缺失;Dnmt3b基因呈明显表达。结论 Stratifin和CyclinD2基因的甲基化发生,可能下调其mRNA的转录表达,MCF-7细胞的这些分子生物学特性可为乳腺癌的表观遗传学研究提供一定的参考价值。     

FasL基因转染对人乳腺癌MCF-7细胞药物敏感性的上调效应

目的:探讨FasL基因转染对肿瘤细胞化疗敏感性的调节效应,方法:LjpofectAMINE介导建立FasL基因修饰的乳腺癌细胞系MCF-7(?)FL,MTT法检测化疗药物对转染细胞的杀伤效应,半定量RT-PCR分析化疗药物作用前后转染细胞Fas mRNA表达水平变化,结果:经C418筛选,RT-PCR和免疫组化鉴定,建立FasL稳定表达MCF-7/FL,ADM在0.625～2.5μg′ml之间.MTX在3～6μg′ml.CDDP在1.25～10μg ml间对MCF-7FL的杀伤效应均明显高于MCF-7和转染空载体的MCF-7Vt而F(ab’)_2-APO-LMcAb可部分抑制这—增强效应,半定量RT-PCR显示上述化疗药物作用后MCF-7/FL Fas mRN水平表达显著增强,结论:外源FasL基因导入可上调肿瘤细胞对多种化疗药物的敏感性,其机制可能与化疗药物上调Fas表达从而增强瘤细胞FasL-Fas凋亡通路效应有关