HIV-1 Vpr对细胞周期的影响和致凋亡作用的研究

目的 研究人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的vpr基因和不同变异株对宿主细胞周期和凋亡的影响,以及其致细胞周期变化和致细胞凋亡机制的两者间的可能关系.方法 将14个带有不同变异位点的中国感染者HIV-1 upr片段分别连入pcDNA3.1(+)真核表达载体,构建重组质粒.将这些重组质粒电转染Jurkat细胞,并设立保守株vpr基因转染细胞、突变株vpr-Fs基因转染细胞、空载体转染细胞和未转染细胞作为对照.经G418选择培养及RT-PCR检测目的基因转染成功后,PI染色,流式细胞仪检测被转染细胞的细胞周期分布和细胞凋亡.结果 流式细胞仪检测上述14个带有不同变异位点的HIV-1 vpr基因片段的Jurkat细胞,发现转染保守片段HIV-1 vpr的Jurkat细胞,其细胞周期出现G_2期阻滞和细胞凋亡率明显升高,但转染vpr C端截断的vpr-Fs片段的细胞、空载体peDNA3.1(+)转染细胞和未转染的Jurkat细胞无此现象.转染了,HIV-1 vpr基因序列相对应的Vpr蛋白中含有70V、85P、86G、94G突变的片段,较vpr保守片段其致感染细胞G_2期阻滞和凋亡的能力明显下降,且Vpr蛋白的AE亚型致细胞周期阻滞和致凋亡能力较其他亚型普遍为低.初步发现vpr诱导G2期阻滞百分比越高其所致凋亡率越高.结论 HIV-I vpr基因有明显的致感染细胞G_2周期阻滞和致细胞凋亡的作用,但vpr C端截断的vpr-Fs片段无此功能.首次发现中国感染者HIV-1 vpr基因表达蛋白的70V、85P、86G、94G位点突变能使其致感染细胞G_2期阻滞和凋亡的能力下降,Vpr的AE亚型致细胞周期阻滞和凋亡能力较其他亚型普遍为低.对14个变异片段的分析显示vpr诱导G_2期阻滞的程度与其致凋亡水平可能相关,提示两者的发生机制可能有一定的关联.本研究为进一步探讨HIV-1致病机制和探索可能的基因干预措施打下基础.     

过表达HSPC238对Bel7402细胞周期的影响

目的:构建pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达载体,研究过表达HSPC238基因对人肝癌细胞株Bel7402细胞周期的影响。方法:采用PCR法从pET28b/HSPC238重组质粒中克隆得到HSPC238 cDNA全长序列,并将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达质粒。经酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染Bel7402细胞,随后经G418筛选4周,得到阳性克隆细胞株。用RT-PCR和Western blot技术分别检测HSPC238基因在Bel7402中的mRNA和蛋白水平的表达。随后用饥饿法使各组细胞周期同步化,再用流式细胞仪分析HSPC238过表达对细胞周期的影响。结果:pcDNA3.1(-)/HSPC238经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因HSPC238的序列完全正确;RT-PCR和Western blot检测显示,与转染pcDNA3.1(-)组和未转染组相比较,转染pcDNA3.1(-)/HSPC238组的mRNA和蛋白表达水平均明显增高,但前两者间没有差异。用饥饿法同步化后,流式细胞仪检测显示过表达HSPC238可延缓Bel7402细胞株从G1期进入S期。结论:成功构建了pcDNA3.1(-)/HSPC238真核表达载体,并在Bel7402中表达。初步发现过表达HSPC238可延缓肝癌细胞的细胞周期,为更进一步研究HSPC238蛋白的功能奠定了基础。     

hPOT1基因过表达对HeLa细胞细胞周期和凋亡的影响

目的观察人POT1(protection of telomeres1)基因过表达对HeLa细胞细胞周期和细胞凋亡的影响。方法利用本课题组构建的hPOTl基因真核表达重组质粒pcDNA3-hPOT1,经脂质体介导瞬时转染HeLa细胞;通过RT-PCR和EMSA法(电泳迁移率改变分析)检测外源基因的表达效果,流式细胞术分析细胞周期,Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡。结果pcDNA3-hPOT1重组质粒转染HeLa细胞48h后,mRNA和蛋白质分析表明,外源性hPOT1基因能在HeLa细胞中有效表达,HeLa细胞阻滞于细胞周期s期,而对凋亡无明显影响。结论hPOT1基因可能参与了高等真核细胞细胞周期调控过程,但与细胞凋亡无密切关系。     

PAK2真核表达载体的构建及在胃癌细胞内的表达与定位

目的 构建PAK2真核表达载体及证实在胃癌细胞内的表达与定位.方法 提取HeLa细胞的mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增PAK2全长编码基因,克隆至pcDNA3.1A表达载体中.将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞SGC-7901中,Western blot检测蛋白表达,免疫荧光检测PAK2在胃癌细胞内的定位.结果...     

人类基因XAPC7真核表达载体的构建及其在SMMC-7721细胞中的表达

目的:构建pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达载体并检测其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达.方法:采用PCR法从pET28b/XAPC7重组质粒中克隆得到XAPC7 cDNA全长序列,将之与pMD18-T载体连接、测序后将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中.构建好的pcDNA3.1(-)/XAPC7真核表达质粒经酶切鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞系SMMC-7721,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再应用半定量RT-PCR技术检测转染前后该细胞株XAPC7基因的mRNA表达水平.结果:pcDNA3.1(-)/XAPC7经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因XAPC7的序列完全正确,真核表达载体构建成功;经RT-PCR检测,重组质粒转染株的XAPC7基因mRNA表达水平高于对照组,证实XAPC7基因已经稳定转染到SMMC-7721细胞中并得到表达.结论:成功地建立了人基因XAPC7的稳定转染细胞株,为进一步研究XAPC7的功能奠定了实验基础.     

Effect of human p27 over-expression on Hela cell proliferation

目的 构建抑癌基因p27高表达细胞株,研究其对子宫颈癌HeLa细胞增殖的影响.方法 运用RT-PCR技术从HeLa RNA中扩增p27 cDNA,连接酶连接至真核表达载体pcDNA3.1(+),所得的重组质粒pcDNA3.1(+)-p27用脂质体法转染子宫颈癌HeLa细胞,使用RT-PCR以及Western blot法筛选p27基因高表达的细胞株.MTT法和流式细胞术检测p27基因高表达对细胞增殖的影响.结果 成功获得p27高表达的HeLa细胞株.细胞增殖分析和流式细胞术结果显示,p27基因高表达对细胞增殖有抑制作用,并明显增加G1期的细胞数(由44.4%增加到59%,P＜0.05).结论 p27基因在HeLa细胞中高表达能通过抑制细胞G1/S转换从而抑制细胞增殖,提示p27基因可能成为子宫颈癌基因治疗的靶基因.     

人TSARG4真核表达载体的构建及稳定转染HeLa细胞系的建立

目的: 构建人TSARG4基因真核表达载体,转染HeLa细胞,建立稳定转染TSARG4的HeLa细胞系.方法: 应用 RT-PCR从人睾丸中扩增TSARG4的开放阅读框(ORF),并将 PCR产物插入到pUCm-T载体中测序验证.随后,将TSARG4进一步克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中.用脂质体将经过测序、验证的pcDNA3.1(+)/TSARG4质粒转染HeLa细胞,通过G418筛选建立TSARG4稳定转染的HeLa细胞系.RT-PCR和组织原位杂交技术检测TSARG4在稳定转染的HeLa细胞系中的表达.结果: 成功构建了pcDNA3.1(+)/TSARG4表达质粒,建立了稳定转染的HeLa细胞系.RT-PCR和组织原位杂交检测结果表明,TSARG4基因在该细胞系中成功表达.结论: TSARG4真核表达载体成功构建和稳定转染HeLa细胞系的建立为进一步体外研究TSARG4的功能奠定了基础.     

人RASSF1A基因的真核表达载体的构建及其表达

目的 通过构建人RASSF1A基因的真核表达载体,为研究其在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞、细胞增殖抑制等方面奠定基础.方法 采用RT-PCR从人外周血的单个核细胞RNA中扩增出人RASSF1A基因的全长cDNA,利用DNA重组技术将其插入到真核表达栽体pcDNA3.1(+)中获得重组质粒.利用脂质体将重组质粒转染入人鼻咽癌细胞株CNE-2中,采用RT-PCR.westem-blot检测RASSF1A的瞬时表达.结果 酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF1A基因已被完整、正确地插入到pcDNA3.1(+)质粒载体中,RT-PCR及Western-blot结果显示转染细胞的RASSF1A表达水平上调.结论 成功构建了RASSF1A基因的真核表达栽体pcDNA3.1(+)/RASSF1A.     

雌激素受体2对前列腺癌细胞系PC-3M增殖的影响

目的： 构建带有人雌激素受体2（ESR2）全长cDNA的重组质粒pcDNA3.1-hERβ,转染人前列腺癌PC-3M细胞株,观察ESR2对细胞增殖能力的影响。 方法：RT-PCR方法从人正常卵巢组织中获取ESR2全长cDNA,利用基因重组技术与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建重组质粒pcDNA3.1-hERβ;瞬时转染前列腺癌PC-3M细胞株,应用细胞计数、MTT法及流式细胞术检测细胞增殖能力的改变;半定量RT-PCR法及Western blotting法分别检测增殖相关基因cyclinD1和 P21Cip1 mRNA及蛋白表达。 结果：DNA测序结果显示扩增的ESR2序列与GenBank（NM_001437）所公布的序列完全一致。重组质粒pcDNA3.1-hERβ瞬时转染人PC-3M细胞48 h后,与质粒对照组相比：RT-PCR法及Western blotting法显示,ESR2基因在mRNA水平和蛋白水平的表达均明显增加;细胞计数及MTT结果发现,细胞数目减少,细胞增殖活性下降（P<0.01）;流式细胞实验显示,G0/G1期细胞比例增加（P<0.05）,S期及G2/M期细胞比例减少（P<0.05）;RT-PCR及Western blotting结果还发现cyclinD1的表达减弱,而P21Cip1的表达增强。 结论：成功构建pcDNA3.1-hERβ重组质粒;带有ESR2全长基因的重组质粒转染PC-3M细胞后,细胞的增殖活性受到抑制;RSR2可能通过影响细胞增殖相关基因cyclinD1和 P21Cip1的表达抑制细胞的增殖。     

重组腺病毒HIV-1 vpr基因的构建和表达

目的 构建携带HIV-1 vpr基因的重组腺病毒,使CD4 T淋巴细胞C8166内源性的高表达Vpr蛋白.方法 利用AdEasy-1系统, 通过将含有目的 基因片段的穿梭载体pAdTrack-CMV-vpr和骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组的方法构建重组腺病毒质粒Ad-vpr, 用脂质体法将重组质粒转染至HEK293A细胞包装, 获得重组腺病毒Ad-vpr, 荧光显微镜观察Ad-vpr感染C8166细胞GFP的表达 , Western blotting鉴定Vpr在C8166细胞内的特异性表达,流式细胞术检测Ad-vpr感染 C8166细胞的效率.结果 成功构建携带HIV-1 vpr基因的重组腺病毒 ,Western blotting结果表明重组腺病毒Ad-vpr感染的C8166细胞内源性的高表达Vpr 蛋白,流式细胞术检测结果表明Ad-vpr感染C8166细胞效率高(44.07±3.62)%.结论 成功构建出携带HIV-1 vpr基因的重组腺病毒,使C8166细胞内源性的高表达Vpr蛋白.     

HIV-1 Vpr促进Vif和APOBEC3G蛋白表达的研究

目的 观察人获得性免疫缺陷病毒蛋白Vpr对Vif蛋白和APOBEC3G蛋白表达水平的影响.方法 使用电转化法将携带Vif基因的酵母表达载体转化到裂殖酵母中,使用脂质体转染法将表达Vif蛋白、APOBEC3G蛋白的哺乳动物表达载体转染到可诱导稳定表达Vpr蛋白的哺乳动物HEK293细胞中;使用Western Blot方法检测目标蛋白表达水平的变化.结果 在裂殖酵母和哺乳动物细胞中,Vpr蛋白的表达能够提高细胞内的Vif蛋白的表达水平,在哺乳动物细胞中,Vpr蛋白对APOBEC3G蛋白的表达亦有促进作用,Vpr蛋白引起的Vif蛋白量的提高并没有导致APOBEC3G蛋白的减少.结论 Vpr蛋白具有调节细胞内蛋白表达的功能.     

Focal glomerulosclerosis in proviral and c-fms transgenic mice links Vpr expression to HIV-associated nephropathy

Clinical and morphologic features of human immunodeficiency virus (HIV)-associated nephropathy (HIVAN), such as proteinuria, sclerosing glomerulopathy, tubular degeneration, and interstitial disease, have been modeled in mice bearing an HIV proviral transgene rendered noninfectious through a deletion in gag/pol. Exploring the genetic basis of HIVAN, HIV transgenic mice bearing mutations in either or both of the accessory genes nef and vpr were created. Proteinuria and focal glomerulosclerosis (FGS) only developed in mice with an intact vpr gene. Transgenic mice bearing a simplified proviral DNA (encoding only Tat and Vpr) developed renal disease characterized by FGS in which Vpr protein was localized to glomerular and tubular epithelia by immunohistochemistry. The dual transgenic progeny of HIV[Tat/Vpr] mice bred to HIV[DeltaVpr] proviral transgenic mice displayed a more severe nephropathy with no apparent increase in Vpr expression, implying that multiple viral genes contribute to HIVAN. However, the unique contribution of macrophage-specific Vpr expression in the development of glomerular disease was underscored by the induction of FGS in multiple murine lines bearing a c-fms/vpr transgene.     

ING4基因的克隆及其诱导HeLa细胞凋亡的实验研究

 目的：分离小鼠ING4基因并构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4, 观察ING4基因转染人宫颈癌HeLa细胞后对细胞凋亡的影响。方法:应用RT-PCR技术从小鼠肝组织中扩增得到ING4cDNA。利用DNA重组技术构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4并用双酶切、PCR、基因测序进行鉴定,然后利用阳离子脂质体lipofectamine将其转染HeLa细胞，用RT-PCR检测ING4基因的表达情况，应用荧光显微镜（Hoechst33258染色）、激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪观察细胞凋亡情况。结果:RT-PCR产物为约 750 bp 的条带,构建的真核表达载体pcDNA3.0-ING4经双酶切、PCR鉴定均出现 750 bp 大小的条带，基因测序正确, Hoechst33258染色发现pcDNA3.0-ING4转染HeLa细胞的凋亡率（21.25%）明显高于对照组pcDNA3.0转染HeLa细胞的凋亡率（8.91%,P<0.01）。共聚焦显微镜也观察到了典型的细胞凋亡。细胞周期检测显示S期细胞所占百分数pcDNA3.0-ING4转染组高于pcDNA3.0转染组。结论:分离得到了小鼠ING4基因并成功构建真核表达载体pcDNA3.0-ING4, 初步研究发现该基因转染HeLa细胞后可促使细胞凋亡。     

HIV-1 Vpr蛋白对C8166细胞毒性研究

目的 利用腺病毒系统研究HIV-1 Vpr蛋白在T细胞来源的C8166细胞内的高表达以及细胞内该蛋白对T细胞毒性.方法 将表达目的 蛋白Vpr的重组腺病毒rAd-vpr和空白载体病毒rAd-vector分别感染对数生长期的C8166细胞,流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布、凋亡和坏死.用Hoechst-PI荧光染色观察细胞的凋亡和坏死,JC-1荧光染色测定线粒体膜电势.结果 Annexin V-PI染色及Hoechst-PI染色一致显示HIV-1 Vpr能显著诱导C8166细胞凋亡和坏死;PI细胞周期结果表明HIV-1 Vpr能阻滞C8166细胞于G2期;JC-1荧光染色法测定HIV-1 Vpr致C8166线粒体膜电势下降.结论 细胞内HIV-1 Vpr介导的T细胞毒性包括线粒体功能障碍、细胞周期的G2期阻滞和细胞的死亡.     

乙型肝炎病毒X和p53对肝癌细胞生长的影响

目的　探讨乙型肝炎病毒X(HBx)基因与p5 3在损伤情况下的相互作用及对肝癌细胞生长的影响及作用机制。方法　通过构建正义及反义野生型 (wt)p5 3 ,与HBx分别单转染或共转染含wtp5 3 ( + )、HBV( - )的人肝癌细胞株SMMU 772 1细胞 ,在吡柔比星的诱导下 ,用流式细胞仪检测对细胞凋亡的影响 ,及HBx对细胞周期的影响 ,并通过检测含p5 3结合位点p2 1Waf1启动子荧光素酶活性来观察HBx是否通过p5 3影响p2 1Waf1的表达 ,以及绘制细胞生长曲线观察HBx对SMMU 772 1细胞生长的影响。结果　在吡柔比星的诱导下 ,HBx能够促进细胞凋亡 ,转染空载体组及pcDNA3HBx组细胞凋亡率分别为 5 3 2 %和 12 66%。但HBx对外源性p5 3诱导的细胞的凋亡具有抑制作用 ,转染空载体、正义pcDNA3wtp5 3及正义pcDNA3wtp5 3 +pcDNA3HBx组细胞凋亡率分别为 5 3 2 %、11 72 %、4 67%。同时处在G0 ～G1期瞬时表达及稳定转染HBx细胞数较对照组分别减少 4 79% ,10 2 5 %。而且HBx可抑制p2 1Waf1启动子荧光素酶的活性 (P <0 0 5 )及促进细胞生长。结论　细胞在DNA损伤因素的作用下 ,HBx可能通过抑制p5 3导致p2 1Waf1的表达降低 ,引起停滞在G0 ～G1期的细胞减少 ,导致肿瘤细胞仍能继续分裂增殖形成恶性生长     

KLF4对结直肠癌细胞生长抑制及化疗敏感性的影响

目的:探讨Krüppel样因子4(KLF4)对结直肠癌细胞活力、凋亡及顺铂化疗敏感性的影响。方法:Western blot法检测KLF4在结直肠癌Caco2、SW480和HCT116细胞中的表达。将SW480细胞分为pc DNA3. 1组(转染pc DNA3. 1空质粒)、pc DNA3. 1-KLF4组(转染构建的pc DNA3. 1-KLF4过表达质粒)和pc DNA3. 1-KLF4+顺铂组(转染pc DNA3. 1-KLF4 48 h后用1 mg/L顺铂处理细胞48 h),Western blot检测KLF4、p-IκBα、细胞周期素D1(cyclin D1)和生存素(survivin)的蛋白水平; CCK-8法检测各组细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率; DCFH-DA探针检测活性氧簇(ROS)含量。结果:KLF4在结直肠癌细胞中的表达均显著低于在人结肠黏膜上皮NCM460细胞的表达(P 0. 05)。与pc DNA3. 1组相比,pc DNA3. 1-KLF4组的KLF4蛋白表达显著增高(P 0. 05),细胞活力及cyclin D1和survivin的蛋白表达均显著降低,细胞凋亡率、ROS含量及p-IκBα的蛋白表达均显著增高;而pc DNA3. 1-KLF4+顺铂组细胞活力及cyclin D1和survivin的蛋白表达均显著低于pc DNA3. 1-KLF4组,细胞凋亡率、ROS含量及p-IκBα的蛋白表达均显著高于pc DNA3. 1-KLF4组(P 0. 05)。结论:上调结直肠癌细胞KLF4基因表达可降低肿瘤细胞活力,诱导细胞凋亡,增强顺铂化疗敏感性,其机制可能与提高细胞内ROS含量及下调NF-κB信号关键分子IκBα的磷酸化水平有关。