体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化

目的 对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)进行分离培养与鉴定,并使其诱导分化为神经细胞.方法 采用密度梯度离心和贴壁培养相结合的方法分离培养BMSCs,观察细胞形态变化及生长、增殖情况;对细胞进行表面标志物CD14、CD34、CD44、CD29免疫荧光染色及向骨、软骨和脂肪分化能力的鉴定;选用第3代细胞,经全反式维甲酸(retinoic acid,RA)和脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophy factor,BDNF)联合诱导后,免疫荧光染色检测神经前体细胞标记物Nestin及神经细胞标记物NSE的表达情况.结果 体外培养的BMSCs呈成纤维细胞样,CD44和CD29的阳性率在90%以上,具有明显的向骨、软骨和脂肪分化的能力,经诱导后可分化为神经细胞.结论 成功建立了体外分离扩增BMSCs的培养体系,所获得的细胞纯度高、生物学特征稳定,并可在体外诱导分化为神经细胞,从而为下一步细胞移植治疗脑缺血动物模型提供种子细胞.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的实验研究

目的：对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells ,BMSCs）进行分离、培养与鉴定,并探讨全反式维甲酸（retinoic acid,RA）、碱性成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,basic, bFGF）和表皮生长因子（ epidermal growth factor , EGF ）联合诱导BMSCs分化为神经细胞的可行性。方法全骨髓贴壁法分离培养BMSCs ,观察细胞形态及生长增殖情况;流式鉴定细胞表面标志物CD29、CD34、CD90;选用第3代细胞,经RA、bF-GF和EGF联合诱导后,细胞免疫化学染色检测神经细胞标志物神经元特异性烯醇化酶（ neuron specific enolasen , NSE）的表达。结果体外培养的BMSCs呈成纤维细胞样,第3、4、5代BMSCs的生长曲线均呈S形,活性无明显差异。 BMSCs的均一性较好,第3代细胞CD29、CD90阳性率均在90％以上,而CD34阳性率仅为0．58％;BMSCs经诱导后分化为神经细胞,并表达神经细胞标志NSE。结论成功建立BMSCs 的体外培养体系,所得细胞纯度高、生物学特征稳定,并可诱导分化为神经细胞,为移植治疗神经系统损伤提供实验基础。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

目的：探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)向神经细胞体外定向诱导分化的条件。方法：从正常SD大鼠骨髓中分离获取MSC,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,采用丁羟茴醚(BHA)和二甲亚砜(DMSO)对传至3～5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学对诱导后的细胞进行鉴定。结果：诱导1h、2h、3h后有部分细胞表达神经干细胞标志蛋白nestin,且随诱导时间延长呈下降趋势;诱导5h后,大部分细胞具有典型神经元形态,表达神经元标志物,神经元特异性烯醇化酶(NSE),少部分细胞呈星型胶质细胞状,表达胶质细胞标志物—胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结论：骨髓间充质干细胞可以在体外培养扩增并诱导成为神经元样细胞和星型胶质样细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向神经细胞样细胞分化

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)离体分离和培养方法,探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、全反式维甲酸(RA)、骨形态发生蛋白-7(BMP-7)在体外诱导BMSCs向神经干细胞(NSCs)分化的作用.方法 采用出生4周SD大鼠的全骨髓细胞进行培养,传至第3代时,分为3组:A组,bFGF EGF RA进行诱导分化;B组,BMP-7进行诱导分化;C组,不加因子继续培养.在倒置显微镜下每日观察、记录BMSCs的诱导分化情况,并应用免疫组化技术对细胞进行兔抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)单抗鉴定.结果 A组诱导7 d后有部分细胞具备神经元样细胞形态,胞体呈锥形或圆形,有较长单极或多极的突起,有NSE阳性细胞表达.而B组、C组细胞仍为典型的成纤维细胞形态,无NSE阳性细胞.结论 bFGF、EGF和RA可以联合诱导BMSCs向NSCs分化,并可调控神经元分化,而BMP-7在此种诱导条件下未见明显的诱导BMSCs向NSCs分化的作用.     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导向神经细胞分化

目的:探讨成人骨髓间充质干细胞(MSC)向神经细胞体外定向诱导分化的条件. 方法:从正常成人志愿者髂骨中分离获取MSCs,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,采用2-巯基乙醇(BME)和二甲亚砜(DMSO)对传至3～5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学法对诱导后的细胞鉴定. 结果:诱导1 h有部分细胞表达神经干细胞标志巢蛋白nestin,4 h后大部分细胞具有典型神经元形态,表达晚期神经元标志物-中间神经丝蛋白(NF-M),部分具有神经元形态的细胞表达微管相关蛋白-2 (MAP-2). 结论:成人骨髓间充质干细胞可以在体外培养扩增并诱导成为神经元样细胞.     

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的实验研究

目的:体外分离培养骨髓间充质干细胞(MSC),并诱导其向神经元细胞分化.方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,并于体外扩增、培养,并通过诱导培养基进行体外诱导培养,比较对照组及实验组间细胞形态和神经丝蛋白(NFP)表达率的不同.结果:诱导后,实验组中80%的细胞表现出神经元样形态,且NFP阳性表达率明显高于对照组.结论:MSC在体外可以被诱导为神经元样细胞.     

骨髓间充质干细胞培养及向神经细胞诱导分化的实验研究

目的：体外培养骨髓间充质干细胞(BM—MSC)，诱导BM—MSC向神经细胞分化。方法：采用DMEM培养液加胎牛血清(DMEM／FBS)或无血清培养基体外培养人BM—MSC，测定细胞倍增时间；免疫组织化学法分析BM—MSC的表面标记；纤维母细胞集落形成(CFU—F)试验检测BM—MSC增殖能力；应用二甲基亚砜／羟丁苯甲酯(DMS0／BHA)化学因子诱导BM—MSC向神经细胞分化。结果：BM—MSC为单层贴壁生长，呈现规则的集束辐射状排列。在对数生长期，细胞倍增时间约为46h。CFU—F试验表明，体外培养的MSC的集落形成能力为正常骨髓单个核细胞(MNC)的15000倍以上。免疫组化分析表明，BM—MSC为CDl3和CDl05阳性，CD34阴性。DMS0／BHA化学因子能诱导BM—MSC分化为神经细胞，但是分化后即失去增殖能力，并于48h后逐渐死亡。结论：通过体外培养可以获得大量高度均一的BM—MSC。BM—MSC可向神经细胞诱导分化，但尚缺乏实际应用的可能性。     

大鼠骨髓间充质干细胞体内向造血细胞分化的研究

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)及其天麻定向诱导神经细胞后向造血细胞分化的潜能。 方法:建立以亚致死量照射的BALB/C小鼠为受体动物模型,体外扩增的大鼠6～7代MSC为供体细胞,分以 下3组,每组12只进行实验:实验组1(A组),放疗+单纯输注MSC;实验组2(B组),放疗+输注天麻诱导1h MSC,A、B组每只小鼠注射0.3mL含1.5×106cells的无血清培养液。空白对照组,放疗+输注等量无血清培 养液。照射后4h内,分别经尾静脉注射。移植60d后取骨髓(BM)、外周血(PB)、脾(SP)细胞悬液,用流式细 胞仪检测供体大鼠源性CD11a、CD45表达。结果:所有实验小鼠均能存活到2个月,骨髓、外周血、脾细胞悬液 均可检测到低表达的大鼠源性CD11a、CD45。对照组为阴性。A、B两组相互比较,具有显著差别意义(P< 0.05)。结论:MSC及天麻定向诱导神经细胞后具有向造血细胞分化潜能。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养和鉴定

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养方法及其生物学特性。方法采用全骨髓贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞,通过成骨、成脂肪诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记（CD29、CD34、CD45、CD90）等鉴定BMSCs特征。结果全骨髓贴壁培养法获得的BMSCs,原代和传代培养具有活跃的增殖能力;BMSCs经诱导后可分别向成骨、成脂转化;流式分析表面标志分子高表达CD90（96.5%）、CD29（92.3%）,低表达CD34（0.89%）、CD45（1.41%）。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BMSCs,分离培养的BMSCs具有潜在的多向分化能力。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化和鉴定

[目的]探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）体外分离、培养、纯化、扩增的方法和生物学特性，研究其在诱导因子诱导下向心肌样细胞定向分化的能力。[方法]取大鼠骨髓，采用贴壁培养筛选法分离MSC，进行培养扩增，观察其生物学特性；用5-杂氮胞苷（5-AZA）诱导P3代MSC向心肌样细胞定向分化，并通过细胞免疫化学法鉴定分化细胞。[结果]大鼠MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增；流式细胞仪分析所培养的B代细胞为纯度超过95％的MSC；P3代MSC经5-AZA诱导后1周，相差显微镜下见细胞呈长梭形、多核；2周可见肌管样结构；细胞免疫化学染色肌钙蛋白I、结蛋白、α-肌动蛋白为阳性。[结论]MSC易分离和培养，体外培养条件下生长良好，可连续传代，在5-AZA的诱导下可定向分化为心肌样细胞。     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的研究

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外黄芪诱导分化为神经元样细胞.方法 通过密度梯度离心从大鼠骨髓中分离有核细胞进行培养,观察细胞的形态和生长情况,分离纯化,传代扩增.采用含黄芪的无血清L-DMEM诱导分化为神经元样细胞,观察细胞形态变化,以免疫组织化学染色方法检测分化细胞中巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.用RT-PCR方法半定量分析相关基因neurogenin-1(Ngn-1)和Wnt-1基因在诱导过程中的表达.结果 经传代后,骨髓间充质干细胞呈纤维细胞样,有较强的增殖能力.经黄芪诱导后,细胞形态发生改变,nestin、NSE和GFAP表达阳性,分化为神经元或胶质细胞样细胞.Ngn-1和Wnt-1基因在黄芪诱导后明显上调.结论 大鼠骨髓间充质干细胞可以体外分离、培养,并在黄芪诱导下向神经元样细胞分化.Ngn-1和Wnt-1基因在其分化过程中起正调控作用.     

透明质酸水凝胶体外促进骨髓间充质干细胞神经分化的研究

目的观察以透明质酸(hyaluronic acid,HA)水凝胶作细胞支架,骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)在HA水凝胶中的生长、增殖和分化情况,探讨HA水凝胶支持、促进BMSCs分化为神经元细胞的作用。方法采用Percoll法从SD雄鼠的骨髓中分离纯化BMSCs,传代培养,倒置显微镜观察BMSCs的生长情况和形态变化。各组以不同的方法诱导BMSCs分化。采用免疫细胞化学法检测各组BMSCs在相应时间点神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经丝蛋白(NF)及巢蛋白(nestin)的阳性细胞数。RT-PCR检测各组BMSCs相应时间点的NSE mRNA、NF mRNA和nestin mRNA表达。结果传代后BMSCs形似纤维细胞。诱导后,HA水凝胶组(A组)和脑组织提取液组(B组)BMSCs分化为神经元样细胞:A组细胞黏附在HA水凝胶表面,长出较多突起和分支;B组细胞出现突起及少量分支。诱导后A组和B组NSE、NF阳性细胞增多(P<0.05)。诱导2d后及7d后A组和B组nestin阳性细胞均增多:2d后,A组高于B组(P<0.05);7d后,A组低于B组(P<0.05)。诱导7d后A组和B组的NSE mRNA、NF mRNA表达均增加,A组增加明显(P<0.05)。诱导2d后A组和B组的nestin mRNA表达增加,A组更显著(P<0.05);7d后A组和B组的nestin mRNA表达则降低,A组更明显(P<0.05)。结论 HA水凝胶有利于BMSCs的黏附,为BMSCs生长、增殖和分化提供了结构支持和适宜的微环境,促使BMSCs向神经元细胞分化、增殖并表达神经元特异性蛋白。     

兔骨髓间充质干细胞的培养及初步鉴定

目的建立兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)分离、培养和鉴定的方法.方法采用贴壁法培养扩增兔BMSCs,通过形态学观察及流式细胞仪鉴定证实得到的细胞为BMSCs.结果倒置相差显微镜可观察到大量梭形、漩涡状贴壁细胞,流式细胞仪鉴定可见所培养的间充质干细胞高表达其表面标记物CD44,低表达CD14和CD45造血细胞表面标志物,初步证实所培养的细胞为兔BMSCs.结论骨髓贴壁分离法培养间充质干细胞是一种方便快捷、经济有效的培养方式.此种细胞培养方法能够得到较纯化的BMSCs.     

维生素A酸、锌等诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的：探讨维生素A酸、锌及大鼠损伤脊髓提取液联合诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的可能性。方法：从大鼠骨髓中分离培养间质干细胞并传至第4代，诱导前24h加10ng/ml碱性成纤维生长因子(bFGF)入培养液中以促分裂，再以含维生素A酸、锌及大鼠损伤脊髓提取液的有血清培养液作诱导剂，观察细胞形态的变化，并采用免疫组织化学法，对诱导后第12d的细胞进行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的检测。结果：诱导后第12d部分细胞不仅在形态上表现为神经元样，而且呈NSE及NF阳性表达，GFAP阴性。结论：经维生素A酸、锌及大鼠损伤脊髓提取液的联合作用可以在体外诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

人骨髓间充质干细胞的培养及研究

目的　了解间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的培养条件、生物特性及分化能力。方法　抽取健康成人骨髓,利用密度梯度离心分离培养人MSC,并用流式细胞仪检测细胞表面标记,体外诱导MSC向成骨细胞分化。结果　成功地进行了人MSC的原代和传代培养;MSC CD34、CD45、HLA DR、CD62p等为阴性,CD29、CD44、CD166、CD90 等为阳性;MSC能够分化为成骨细胞。结论　人骨髓MSC在体外有较强的扩增能力,并能够向成骨细胞分化。     

体外培养大鼠骨髓间质干细胞的超微结构

[目的]研究体外培养大鼠骨髓间质干细胞的超微结构。[方法]采用常规技术对SD鼠骨髓间质干细胞进行体外培养传代、鉴定、诱导分化和透射电镜分析。[结果]流式细胞仪检测,细胞表达CD29和CD44,不表达CD11b和CD45;经5-氮杂胞苷和两性霉素B诱导分化后结蛋白和肌球蛋白染色阳性。透射电镜观察有巨噬样、内皮样和成纤维样三类基本细胞,巨噬样细胞表面有胞质突起,胞浆含电子密度高的结晶样包涵体;内皮样细胞靠胞膜边有吞饮小泡,胞浆中有电子密度高的内皮特殊小体;成纤维样细胞呈梭形,较幼稚,细胞器简单,有丰富的糖原和核糖体;经诱导分化的肌样细胞胞浆靠胞膜缘可见无细胞器的条状肌丝区带;细胞间存在胞膜局部紧密连接和胞质突起接合。[结论]传代贴壁生长的为骨髓间质干细胞;超微结构分析显示早期幼稚细胞发育的特征,但各有特点;在不同培养条件诱导下,细胞具备向肌肉和脂肪组织分化的潜能。本研究为进一步了解和掌握骨髓间质干细胞的生物学特性和临床应用打下基础。     

去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力研究

目的　探讨去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨分化的特点。方法　选用3月龄健康SD雌性大鼠行双侧卵巢切除术,建立骨质疏松症的动物模型。实验分为正常大鼠髓间充质干细胞组(MSCs controlgroup )、骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞组(MSCs ovx group)、正常骨髓间充质干细胞成骨诱导组(OSI controlgroup)、骨质疏松骨髓间充质干细胞成骨诱导组(OSI ovx group)。使用密度梯度离心法分别获取正常大鼠和骨质疏松大鼠MSCs,体外培养传至3、4代后,流式细胞技术检测MSCs control group和MSCs ovx group细胞周期及增殖指数(PI) ;加入含有地塞米松(10 - 8m ol/L) ,β-甘油磷酸钠(10 - 2 mol/L) ,抗坏血酸(5 0 μg/m l)的成骨诱导液进行成骨诱导,采用磷酸对硝基苯测定方法检测碱性磷酸酶(AL P)表达量,同位素标记方法检测骨钙素(BGP)分泌量。结果　1PI:MSCs control group高于MSCs ovx group(P<0 .0 5 )。2 AL P的表达量:成骨诱导第7d和14 d时,OSI各组均明显高于相应的MSCs组(P<0 .0 5 ) ;OSI control组明显高于OSI ovx组(P<0 .0 5 )。随着时间延长,OSI各组AL P表达量呈升高趋势。3BGP的分泌量:成骨诱导14 d、2 1d、2 8d时,OSI各组均明显高于相应的MSCs组(P<0 .0 5 ) ;OSI control组明显高于OSI ovx组(P<0     

大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的：体外培养大鼠骨髓间质干细胞（BMSCs）,并进行形态学观察、表面分子标记和多向分化能力的检测鉴定。方法采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,显微镜下进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞表面标记物CD29、CD44、CD45,并诱导大鼠BMSCs向成骨和成脂分化。结果分离培养的细胞以梭形细胞为主,呈漩涡状生长。 CD29、CD44均呈阳性表达,而CD45呈阴性。成脂成骨诱导后,油红O和茜素红S染色均呈阳性。结论全骨髓贴壁培养法分离培养的细胞具有间质干细胞的生物学特性,具有多向分化潜能。     

鹿茸多肽对人骨髓间质干细胞体外增殖的影响

为探讨鹿茸多肽 (PAP)对人骨髓间质干细胞 (MSCs)体外增殖的影响 ,采用密度梯度离心法分离扩增骨髓间质干细胞 ,并用流式细胞术检测其表面标志 ;用MTT比色、免疫组化检测增殖细胞核抗原 (PCNA)、流式细胞术检测细胞周期等方法来反映MSCs的增殖。结果CD3 4 、CD45表达阴性 ,CD2 9、CD90 表达阳性 ;1 0 μg/ml时PAP获得最佳促进MSCs增殖效应 ,且PAP能消除MSCs在体外连续培养过程中异倍体的产生。说明PAP对人MSCs的增殖有明显促进作用 ,且能防止MSCs在体外连续培养过程中异行性的产生 ,为种子细胞的优化提供了理论和实验依据。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及成骨成脂诱导

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离、纯化、扩增的方法及诱导BMSCs成骨成脂分化,提供理想的组织工程种子细胞。方法采用贴壁筛选法分离BMSCs,通过不断传代进行纯化和扩增培养,并绘制细胞生长曲线。诱导后检测油红O染色和矿化结节。结果 BMSCs在体外分离培养扩增,细胞形态为长梭形,流式检测分析P3和P5细胞表面标记物CD44、CD90为阳性,CD45为阴性。细胞生长曲线呈S形。经成脂诱导培养,脂肪的特异性油红O染色为阳性;经成骨诱导培养,形成了矿化结节。结论本实验分离培养的细胞具有BMSCs的表面标记特征和诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的潜能,为BMSCs在组织工程中的应用提供基础理论和实验依据。