温热对HPV-6/11型早期基因E6和E7表达的影响

目的 探讨不同温热条件对HPV感染皮损中E6/E7基因表达的影响.方法 采用PCR法确定6例尖锐湿疣标本HPV型别.利用37℃,42℃,45℃不同的温热条件处理置于培养液中的离体尖锐湿疣皮损,采用实时定量PCR法检测HPV-6/11型早期基因E6/E7 mRNA的表达水平.结果 6例标本中.各有1例分别感染HPV-6、HPV-11,4例同时感染HPV-6和HPV-11.E6、E7 mRNA的表达水平均随温度升高而逐渐减少.HPV-6 E6 mRNA的相对表达量分别为37℃(1.00±0.00),42℃(0.61±0.17).45℃(0.27±0.15);HPV-6 E7 mRNA的相对表达量分别为37℃(1.00±0.00),42℃(0.56±0.21),45℃(0.16±0.11);HPV-11 E6 mRNA的相对表达量分别为37℃(1.00±0.00),42℃(0.60±0.22).45℃(0.16±0.08);HPV-11 E7 mRNA相对表达量分别为37℃(1.00±0.00),42℃(0.55±0.15).45℃(0.24±0.06).组间比较差异有统计学意义(P<0.01.结论 温热对HPV-6/11型E6和E7基因表达的抑制作用可能是感染消退的机制之一.     

人乳头瘤病毒11型早期蛋白E6和E7基因的克隆及序列分析

目的：从尖锐湿疣(CA)标本中克隆出人乳头瘤病毒11型(HPV11)早期蛋白E6、E7基因，并进行序列测定及编码氨基酸序列分析，为HPV感染的检测和基因工程疫苗研究奠定基础。方法：用PCR法，从CA标本中扩增出HPV11E6、E7基因，与载体pGEX-6P-1连接成重组质粒pGEX-6P-1／E6、pGEX-6P-1／E7，酶切鉴定及双脱氧法测序观察其变异状况。结果：克隆出HPV 11早期蛋白E6、E7基因，成功构建重组质粒pGEX-6P-1／E6、pGEX-6P-1／E7。本研究克隆出的HPV11 E7基因与GenBank标准株序列完全相同，E6基因有两个位点的变化。结论：本研究克隆出的HPV11 E6、E7基因与标准株基本相同，这将为进一步研究E6、E7基因的表达、免疫活性及流行病学奠定基础。     

人乳头瘤病毒16型E7抗原细胞毒性T细胞预测表位的分子模拟研究

对人乳头瘤病毒（HPV）16型E7抗原的预测表位从理论上分析其与HLA－A2分子结合的情况，推测成为HLA－A2限制性表位的可能性。通过计算机分子模拟，确立各表位及其与HLA－A2分子结合形成复合物的模拟结构。结果发现，各表位的三维结构符合HLA－A2限制性细胞毒性T细胞（CTL）表位的结构要求，能较好地与HLA－A2分子结合。根据分子模拟提供的理论支持，各预测表位符合要求，提示可在后续实验中进行表位合成、筛选、鉴定和多肽疫苗的研制。     

负载人乳头瘤病毒16型E7多肽树突细胞诱导抗原特异性细胞免疫反应

目 的 观 察 负 载 人 乳 头 瘤 病 毒 16 型 (H PV16)E749-57 多 肽 树 突 细 胞 (DC)体 外 诱 导 针 对H PV16 肿 瘤细 胞 的特 异性 细 胞免 疫反 应 。方 法 用粒 细 胞-巨 噬细 胞 集落 刺激 因 子(GM -CSF)及 白 介素 4(IL-4)从 健康 成人 外 周血 单一 核 细胞 诱导 DC 并 负载 H PV 16 E749-57 多肽 ,流 式细 胞 仪检 测 DC 表 面 抗 原;混 合淋 巴 细 胞 反应 观 察 DC 对 同 种 淋 巴 细 胞 增 殖 的 激 发 效 应 ;乳 酸 脱 氢 酶 (LDH )释 放 法 评 价 DC 诱 导 的细胞 毒 性 T 淋 巴 细 胞 (CTL)对 Caski肿 瘤 细 胞体 外 杀 伤 效应 。 结 果 负 载 H PV16 E749-57 多 肽 的 DC 表面表 达 CD 1a(58.4 ±6.7)%、CD 80(70.6 ±3.4)%及 H LA -DR (74.8 ±4.2)%分 子 ;具 有 刺 激 同 种 T 淋 巴 细 胞增 殖的 能 力 ;其 诱 导 的 抗 原 特 异 性 CTL 对 Caski肿 瘤 细 胞 产 生 特 异 性 杀 伤 ,而 对 SiH a、A N3CA 肿 瘤 细 胞无明 显 杀伤 作用 。 结论 负 载 H PV16 E749-57 多 肽的 DC 体 外可 诱导 高 效、特 异 性的 CTL 效应 。     

人乳头状瘤病毒16 E6/E7基因稳定表达的永生化角质形成细胞的建立及鉴定

【摘要】 目的 构建人乳头状瘤病毒（HPV）16 E6/E7基因稳定表达的人永生化角质形成细胞（KC）,为研究HPV16 E6/E7诱导的细胞永生化及恶性转化机制提供细胞模型。方法 两步消化法分离培养原代人包皮角质形成细胞（HFK）,利用慢病毒感染技术对细胞稳定转染HPV16 E6/E7基因,连续培养30代以上,筛选出永生化KC,分为3组：①空白对照组：传代2次的原代HFK;②实验组：传代2次的原代HFK感染LV5-HPV16 E6/E7,感染细胞记录为A0代,感染后以传代次数记录（A1、A2……）;③阳性对照组：HPV16阳性宫颈癌细胞SiHa。应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western印迹实验分别检测空白对照组、实验组、阳性对照组HPV16 E6/E7 mRNA、蛋白及CK14蛋白的表达,CCK-8及Transwell Insert方法检测细胞的增殖及侵袭能力。裸鼠致瘤实验检测实验组A30、阳性对照组SiHa细胞的致瘤能力。结果 成功分离原代HFK。LV5-HPV16 E6/E7重组质粒感染原代HFK后,空白对照组细胞无荧光表达,连续传代后出现衰老表现,实验组A30细胞体积、形态较原代HFK无明显变化,且荧光表达率为100%。与空白对照组相比,实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E6 mRNA表达水平显著升高（t值分别为7.12、8.07、6.53、5.66;P值分别 < 0.001、 < 0.001、 = 0.001、 = 0.005）;与空白对照组相比,实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E7 mRNA表达水平也显著升高（t值分别为3.20、4.29、3.75、4.22;P值分别为0.024、0.008、0.013、0.014）。空白对照组未见HPV16 E6/E7蛋白的表达,而A30及SiHa细胞可见HPV16 E6/E7蛋白的表达。CCK-8实验显示,实验组A10、A20、A30细胞增殖水平显著高于空白对照组（t值分别为6.49、7.55、9.43;P值分别为0.003、0.002、0.001）,而A1的增殖水平与空白对照组比较,差异无统计学意义（t = 2.40,P = 0.074）。Transwell Insert侵袭实验显示,A30不能穿过基底膜,SiHa细胞可穿过基底膜被染成蓝色。裸鼠接种A30细胞2个月后无肉眼可见肿瘤,组织学亦显示无肿瘤形成,裸鼠接种SiHa细胞后可于皮下形成肿瘤。结论 通过采用慢病毒技术转染HPV16 E6/E7基因成功建立人永生化角质形成细胞,可作为HPV相关研究中的理想细胞模型。     

HPV7相关趾间疣合并肛周疣一例

患者男,35岁.因趾间、肛周湿润柔软赘生物1年就诊.趾间疣组织病理检查:角层角化不全、轻度角化过度,乳头瘤样增生,棘层高度肥厚,中上层较多的空泡化细胞,真皮内血管扩张,周围淋巴样细胞浸润.趾间及肛周疣体组织DNA通用引物PCR扩增HPV保守片段,测序法判定两者型别均为HPV7,型特异性引物PCR显示HPV7阳性,HPV6、11、16、18均阴性,与测序法结果 一致.     

HPV7相关趾间疣合并肛周疣一例

患者男,35岁.因趾间、肛周湿润柔软赘生物1年就诊.趾间疣组织病理检查:角层角化不全、轻度角化过度,乳头瘤样增生,棘层高度肥厚,中上层较多的空泡化细胞,真皮内血管扩张,周围淋巴样细胞浸润.趾间及肛周疣体组织DNA通用引物PCR扩增HPV保守片段,测序法判定两者型别均为HPV7,型特异性引物PCR显示HPV7阳性,HPV6、11、16、18均阴性,与测序法结果 一致.     

HPV7相关趾间疣合并肛周疣一例

患者男,35岁.因趾间、肛周湿润柔软赘生物1年就诊.趾间疣组织病理检查:角层角化不全、轻度角化过度,乳头瘤样增生,棘层高度肥厚,中上层较多的空泡化细胞,真皮内血管扩张,周围淋巴样细胞浸润.趾间及肛周疣体组织DNA通用引物PCR扩增HPV保守片段,测序法判定两者型别均为HPV7,型特异性引物PCR显示HPV7阳性,HPV6、11、16、18均阴性,与测序法结果 一致.     

HPV7相关趾间疣合并肛周疣一例

患者男,35岁.因趾间、肛周湿润柔软赘生物1年就诊.趾间疣组织病理检查:角层角化不全、轻度角化过度,乳头瘤样增生,棘层高度肥厚,中上层较多的空泡化细胞,真皮内血管扩张,周围淋巴样细胞浸润.趾间及肛周疣体组织DNA通用引物PCR扩增HPV保守片段,测序法判定两者型别均为HPV7,型特异性引物PCR显示HPV7阳性,HPV6、11、16、18均阴性,与测序法结果 一致.     

HPV7相关趾间疣合并肛周疣一例

患者男,35岁.因趾间、肛周湿润柔软赘生物1年就诊.趾间疣组织病理检查:角层角化不全、轻度角化过度,乳头瘤样增生,棘层高度肥厚,中上层较多的空泡化细胞,真皮内血管扩张,周围淋巴样细胞浸润.趾间及肛周疣体组织DNA通用引物PCR扩增HPV保守片段,测序法判定两者型别均为HPV7,型特异性引物PCR显示HPV7阳性,HPV6、11、16、18均阴性,与测序法结果 一致.     

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患者男,35岁.因趾间、肛周湿润柔软赘生物1年就诊.趾间疣组织病理检查:角层角化不全、轻度角化过度,乳头瘤样增生,棘层高度肥厚,中上层较多的空泡化细胞,真皮内血管扩张,周围淋巴样细胞浸润.趾间及肛周疣体组织DNA通用引物PCR扩增HPV保守片段,测序法判定两者型别均为HPV7,型特异性引物PCR显示HPV7阳性,HPV6、11、16、18均阴性,与测序法结果 一致.     

HPV7相关趾间疣合并肛周疣一例

患者男,35岁.因趾间、肛周湿润柔软赘生物1年就诊.趾间疣组织病理检查:角层角化不全、轻度角化过度,乳头瘤样增生,棘层高度肥厚,中上层较多的空泡化细胞,真皮内血管扩张,周围淋巴样细胞浸润.趾间及肛周疣体组织DNA通用引物PCR扩增HPV保守片段,测序法判定两者型别均为HPV7,型特异性引物PCR显示HPV7阳性,HPV6、11、16、18均阴性,与测序法结果 一致.     

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患者男,35岁.因趾间、肛周湿润柔软赘生物1年就诊.趾间疣组织病理检查:角层角化不全、轻度角化过度,乳头瘤样增生,棘层高度肥厚,中上层较多的空泡化细胞,真皮内血管扩张,周围淋巴样细胞浸润.趾间及肛周疣体组织DNA通用引物PCR扩增HPV保守片段,测序法判定两者型别均为HPV7,型特异性引物PCR显示HPV7阳性,HPV6、11、16、18均阴性,与测序法结果 一致.     

HPV7相关趾间疣合并肛周疣一例

患者男,35岁.因趾间、肛周湿润柔软赘生物1年就诊.趾间疣组织病理检查:角层角化不全、轻度角化过度,乳头瘤样增生,棘层高度肥厚,中上层较多的空泡化细胞,真皮内血管扩张,周围淋巴样细胞浸润.趾间及肛周疣体组织DNA通用引物PCR扩增HPV保守片段,测序法判定两者型别均为HPV7,型特异性引物PCR显示HPV7阳性,HPV6、11、16、18均阴性,与测序法结果 一致.     

HPV16型E7抗原B细胞表位的预测与鉴定

目的分析人乳头瘤病毒16型(HPV16)早期蛋白E7的B细胞优势表位,并对其进行免疫原性鉴定。方法采用亲水性方案、柔韧性方案、抗原指数方案及表面可能性方案综合评估其B细胞优势表位,并运用固相合成法合成多肽,经RP-HPLC纯化及纯度分析,用质谱进行定性鉴定。以合成肽免疫Balb/c小鼠,进行免疫效果评价。结果综合分析考虑HPV16 E714-21(P1),HPV16 E726-37(P2),HPV16 E744-51(P3)可能是B细胞优势表位,免疫小鼠后可明显诱导小鼠血清抗体滴度升高,但只有P1和P2产生的抗体与人宫颈癌组织上清液结合呈阳性反应。结论HPV16 E714-21和HPV16 E726-37具有较强的免疫原性,可能成为HPV感染肽疫苗的候选表位。     

HPV7相关趾间疣合并肛周疣一例

患者男,35岁.因趾间、肛周湿润柔软赘生物1年就诊.趾间疣组织病理检查:角层角化不全、轻度角化过度,乳头瘤样增生,棘层高度肥厚,中上层较多的空泡化细胞,真皮内血管扩张,周围淋巴样细胞浸润.趾间及肛周疣体组织DNA通用引物PCR扩增HPV保守片段,测序法判定两者型别均为HPV7,型特异性引物PCR显示HPV7阳性,HPV6、11、16、18均阴性,与测序法结果 一致.     

HPV16E7多肽体外诱生抗原特异性细胞毒性T细胞表型及功能的研究

目的 探讨高致癌性HPV16E7病毒抗原肽体外诱生HLA-A2阳性正常人外周血抗原特异性CD8＋细胞毒性T细胞（CTL）的表型及功能状态。方法 以HPV16E711－20合成多肽、重组人IL-7、IL-2体外刺激26例HLA-A2阳性正常人外周血T细胞,用HLA-A*0201限制性表位肽/ YMLDLQPETT五聚体技术,结合流式细胞仪对抗原特异性CTL进行频率、表型［CD45RA+CD27-效应性CTL、CD45RA-CD27-效应性记忆CTL（TEM）、CD45RA-CD27＋中枢性记忆CTL（TCM）、CD45+CD27+初始性CTL］及功能（穿孔素、颗粒酶B、FasL）分析,并以无关肽HBVcore18－27作为阴性对照。结果 病毒多肽体外刺激T细胞7 d后,抗原特异性CD8＋ CTL数为（0.73 ± 0.33）%,比未刺激组的（0.02 ± 0.03）%明显增多（P < 0.01）。进一步分析,在抗原特异性CTL中,效应性CTL、TEM、TCM及初始性CTL百分比分别为（26.07 ± 13.46）%、（7.97 ± 7.11）%、（33.25 ± 19.68）%及（32.73 ± 13.89）%,均比未刺激组的（0.02 ± 0.03）%、（0.02 ± 0.03）%、（0.02 ± 0.03）%及（0.02 ± 0.05）% 明显增多,P值均 < 0.01。HPV16E711－20表位特异性CTL分泌穿孔素、颗粒酶B、Fas-L的水平分别为（47.01 ± 18.69）%、（80.53 ± 13.32）%及（26.48 ± 7.81）%,均比未刺激组的（0.38 ± 0.55）%、（0.34 ± 0.22）%及（0.16 ± 0.16）%明显增多,P值均 < 0.01。结论 HPV16E711－20多肽诱导CD8＋ T细胞克隆扩增,产生抗原特异性CD8＋ CTL,分泌毒性细胞因子,通过不同机制特异性杀伤病毒感染的靶细胞,在抗病毒免疫应答中发挥作用。     

HPV16E6蛋白与hDaxx在HeLa细胞的定位及对凋亡的影响

目的 探讨外源人乳头瘤病毒16型E6蛋白(HPV16 E6)与人Daxx蛋白(hDaxx)在HeLa细胞内的亚细胞定位及诱导HeLa细胞凋亡的影响.方法 Western印迹法检测融合蛋白DsRed-HPV 16 E6和EGFP-hDaxx的表达.激光共聚焦显微镜观察HPV16 E6和hDaxx的亚细胞定位.将HeLa细胞分为对照组、TNF-α处理组、转染空载体组、转染HPV16 E6组、共转染HPV16 E6和hDaxx组.后4组均经TNF-α诱导.用流式细胞仪测定细胞凋亡率,分光光度法检测Caspase-8与Caspase-3的相对活性.结果 融合蛋白DsRed-HPV16E6和EGFP-hDaxx在细胞内表达并分布于胞质与胞核,出现共定位现象,且部分hDaxx从胞核转移至胞质.转染E6组凋亡率(21.4％±1.1％)低于转染空载体组(27.0％±0.9％,P＜ 0.01);与转染E6组相比较,共转染组凋亡率(32.5％±2.1％)显著升高(P＜0.01).转染E6组Caspase-8和Caspase-3相对活性分别为0.057±0.003、0.054±0.006,均低于空载体组(0.092±0.012、0.093±0.005,均P＜0.01);与转染E6组相比较,共转染组Caspase-8和Caspase-3相对活性(0.109±0.013、0.110±0.004)均显著升高(P值均＜ 0.01).结论 HPV16 E6使部分hDaxx从胞核转位至胞质,二者发生共定位.HPV16E6蛋白可抑制TNF-α诱导的HeLa细胞凋亡,bDaxx高表达可下调HPV16 E6蛋白这种作用.     

HPV-11 E7重组腺病毒体外转染树突细胞对其功能的影响

目的 研究腺病毒载体介导HPV-11 E7基因转染树突细胞(DC)对其表型和功能的影响。方法 用最佳感染滴度(MOI)重组腺病毒pAD-E7转染成熟DC,流式细胞仪检测转染前后DC表型变化,并用~3H-TdR掺入法检测转染前后DC刺激同种淋巴细胞增殖的能力及ELISA检测DC、T细胞共同培养上清中细胞因子的水平。结果 MOI 100为pAD-E7转染DC最佳滴度,pAD-E7转染成熟DC前后对细胞表面的特征性表型CD1a、CD83及CD40、HLA-DR无影响,转染后的DC仍具有较强的刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,能刺激T细胞分泌大量IFN-γ、IL-12。结论 pAD-E7转染成熟DC对其功能无明显影响,转染后的DC与T细胞共孵育能诱导T细胞向Th1细胞极化。