树鼩脑缺血时神经元线粒体渗透性转导孔开放对线粒体呼吸的影响

目的：揭示光化学诱导树鼩脑缺血后不同时间内，缺血神经元线粒体呼吸功能的变化，观察血小板活化因子（PAF）受体拮抗剂银杏内酯B（GB）和免疫抑制剂环孢菌素A （CsA）对线粒体呼吸及神经元线粒体渗透性转导孔（MPT）开放的影响，探讨二者可能的神经保护机制及缺血时MPT开放与线粒体呼吸的相互关系。方法：建立光化学诱导树鼩脑缺血模型，分离缺血后4、24、72 h大脑皮层线粒体，用氧电极极谱法测定线粒体呼吸。于缺血6 h分别注射GB和CsA，24 h时观察相关指标。另取分离的线粒体，用CaCl₂诱导MPT开放，再分别加入CsA或GB，观察其对线粒体肿胀的影响。结果：缺血脑皮层神经元线粒体Ⅲ态呼吸速度、呼吸控制率（RCR）及磷氧比（P/O）逐渐下降，以缺血24 h的变化为著，与假手术组相比均有显著差异（P<0.01）。给予GB或CsA，Ⅲ态呼吸速度显著大于对照组（P<0.01），P/O比上升（P<0.05）。CaCl₂可诱导MPT开放，线粒体肿胀而透光率迅速下降，CsA有效阻滞了MPT开放，GB则不然。结论：光化学诱导树鼩局灶脑缺血后，缺血皮层线粒体呼吸明显障碍，GB或CsA可不同程度地改善缺血神经元线粒体代谢，可能与GB拮抗神经细胞膜上PAF受体活化，间接调节线粒体呼吸有关；而CsA主要通过抑制MPT开放而改善线粒体呼吸而具有神经保护作用。     

树鼩血栓性脑缺血时单胺氧化酶活性的变化及银杏内酯B作用机制探讨

目的:揭示血栓性脑缺血时缺血区和血清单胺氧化酶(MAO)活性变化及对血小板活化因子(PAF)受体拮抗剂银杏内酯B(GB)作用机理的探讨。方法:建立光化学诱导树鼠句血栓性脑缺血模型,用酶比色法测量缺血后4、24及72h中心区、半暗区、对侧区及血清的MAO活性,并用双缩脲法测定上述各区的蛋白含量。结果:脑缺血后不同时间缺血中心区MAO活性显著低于假手术组或对侧区,以72h最为明显;此时缺血半暗区和血清MAO活性明显高于假手术组(P＜0.01)。光化学反应后6h舌下静脉一次注射PAF受体拮抗剂GB(5mg·kg^-1)后24h时,半暗区MAO活性明显低于缺血组,而中心区则高于缺血组(P＜0.01)。MAO活性变化与相应区域蛋白含量改变一致(r=0.81,P＜0.05)。结论:脑缺血后中心区、半暗区MAO活性改变是相应区域单胺类递质消长变化的主要原因,MAO活性变化与神经元蛋白质合成能力的改变有关;GB的脑保护作用与其拮抗PAF受体和调节MAO活性而促进递质平衡有关。     

树鼩脑缺血半暗区PAF受体介导的微环境改变及GB保护机制的探讨

目的研究树鼩血栓性脑缺血时,血小板活化因子(PAF)受体活化介导的缺血半暗区微环境改变,并探讨PAF受体拮抗剂—银杏内酯B(ginkgolide,GB)的神经保护机制。方法采用光化学诱导树鼩血栓性局部性脑缺血模型,用3H?PAF放射免疫标记法检测缺血区微环境脑细胞PAF受体亲合性(Kd值)和结合特性(Bm ax值)的变化;用密度梯度法及原子吸收分光法分别测定缺血微环境水含量及Na+、Ca2+含量,并于光化学反应后6 h静注GB(5 mg/Kg),观察其对脑血栓形成后24 h时缺血微环境的改善效应。结果树鼩脑血栓形成后缺血半暗区微环境的改变以24 h为著,脑细胞膜高亲和性、低亲和性PAF受体的Kd值及Bm ax值明显降低,其中Kd1及Bm ax1分别为(0.611±0.9)nM和(419.4±72.6)fmol.mg-1蛋白,Kd2及Bm ax2分别为(4.08±0.5)nM和(676.8±98.66)fmol.mg-1蛋白(与对照组相比P<0.01);GB可促使缺血微环境脑细胞PAF受体Kd及Bm ax的恢复,并具有改善局部脑水肿和缓解Ca2+超载(P均<0.01)。结论PAF受体活化在介导缺血半暗区微环境改变中具有重要作用,GB可改善缺血半暗区微环境和逆转PAF受体活化介导的神经元泵功能障碍。     

缺血后适应对树鼩脑缺血信号转导及转录激活因子3过磷酸化的调控作用

目的观察信号转导及转录激活因子3(STAT3)磷酸化在树鼩脑缺血后适应(PC)神经保护中的作用,并探讨其可能机制。方法将50只健康成年树鼩随机分为对照组、脑缺血4 h组、脑缺血24 h组、后适应4 h组和后适应24 h组(每组n=5),其中10只动物做HE染色(n=5)及电子显微镜观察(n=5)。本实验通过光化学反应建立树鼩血栓性脑缺血模型;于缺血后4 h夹闭患侧颈总动脉3次(每次5 min)实施缺血PC。采用TTC染色观察树鼩脑梗死面积的变化,通过HE和电子显微镜观察脑皮质和海马组织学改变及其超微结构变化,应用Western blotting检测皮层总STAT3(t-STAT3)及磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白表达变化。结果脑缺血后皮层血管内皮细胞肿胀,皮层及海马神经元损伤,线粒体肿胀、嵴溶解,以缺血24 h损伤最为明显,脑梗死面积达到(24.78±2.06)%。而皮层p-STAT3蛋白表达随缺血时间延长呈增高趋势,缺血4 h p-STAT3蛋白表达明显增高(0.24±0.1,P<0.01),缺血24 h p-STAT3蛋白表达则持续增高(0.32±0.1,P<0.01)。缺血PC处理后皮层血管内皮细胞水肿好转,皮层及海马神经元损伤减轻,脑梗死面积减小为(17.67±1.90)%(P<0.01)。与缺血组相比,缺血PC 4 h p-STAT3蛋白表达进一步升高(0.41±0.09,P<0.01),缺血PC 24 h p-STAT3蛋白表达增高更加显著(0.70±0.11,P<0.01)。结论树鼩脑缺血可导致STAT3磷酸化代偿性增强,缺血PC的脑保护作用可能与其促进STAT3过磷酸化有关。     

JAK2-STAT3信号通路在树鼩脑缺血后适应中的作用机制

 目的：观察JAK2-STAT3信号转导通路在树鼩缺血后适应（ischemic postconditioning,IPoC）神经保护中的调控作用,探讨阻断JAK2-STAT3通路后脑损伤加重的机制。方法：通过光化学反应建立树鼩血栓性脑缺血模型;于缺血后4 h夹闭患侧颈总动脉3次（每次5 min）实施IPoC。于IPoC前10 min侧脑室注射AG490（JAK2抑制剂）后,采用TTC染色观察树鼩脑梗死面积的变化,通过HE染色和电镜观察脑皮层神经元形态改变及超微结构变化,应用Western blot检测IPoC及AG490处理后皮层t-STAT3和p-STAT3蛋白水平的变化。结果：缺血24 h,皮层神经元固缩,线粒体肿胀,嵴溶解;脑梗死面积占半脑面积的（24.78±3.30）%;此时皮层神经元STAT3磷酸化水平明显增高（P<0.01）。IPoC后皮层神经元损伤减轻,线粒体肿胀改善,脑梗死面积占半脑面积的百分比减小为（17.67±1.83）%（P<0.01）,STAT3磷酸化水平进一步增高（P<0.01）。然而,给予AG490处理后,皮层神经元损伤加重,脑梗死面积再次增大为（23.85±2.77）%（P<0.05）,STAT3磷酸化水平则明显降低（P<0.05）。结论：IPoC可能通过调控STAT3的磷酸化而减轻树鼩缺血性脑损伤,抑制JAK2-STAT3信号通路可抵消IPoC的保护效应而加重脑损伤。     

树鼩血栓性脑缺血中心区及半暗区神经元PAF受体结合特性的研究

目的：观察血栓性局部脑缺血过程中缺血中心区及半暗区血小板活化因子（PAF）受体的消长变化,探讨PAF在脑缺血中心区及半暗区神经元继发性脑损伤中的分子机制。方法：建立光化学诱导树鼩血栓性局部脑缺血模型并提取树鼩脑细胞膜蛋白,用[³H]-PAF放射配体结合试验检测中枢神经细胞膜不同特性的PAF结合位点（受体）。结果：树鼩脑细胞膜上存在两种亲和性不同的PAF受体,即高亲和性和低亲和性受体,其亲和力（kD）分别为(3.61±0.72) nmol/L（kD₁）和17.04±2.41) nmol/L（kD₂）相应的最大结合容量（B_max）分别为(1 457.94±168.01) pmol/g蛋白和(5 017.40±742.16) pmol/g蛋白。脑缺血4、24及72 h中心区、半暗区及对侧区高、低亲和性受体的kD值、B_max值均显著低于假手术组（P<0.01）,中心区及半暗区尤为明显,其中以缺血后24 h的变化最为显著。结论：PAF受体在介导缺血性脑损伤过程中起着重要作用,缺血中心区及半暗区机能代谢的不同与PAF受体亲和特性及最大结合容量改变不同有关,亦是PAF介导继发性脑损伤的重要分子基础。     

缺血后适应调控树鼩脑缺血海马CA1区Akt（pS473）和Akt（pT308）过磷酸化的抗凋亡机制

观察树鼩脑缺血海马神经元Akt（pS473）和Akt（pT308）磷酸化改变对CA1区细胞凋亡的影响,探讨缺血后适应（PC）抑制细胞凋亡的可能机制。方法 用光化学诱导法诱导树鼩脑缺血并建立缺血PC模型;用免疫组织化学TACS原位凋亡检测试剂盒检测皮层及海马CA1区神经元凋亡数量,用免疫组织化学法检测Akt（pS473）和Akt（pT308）表达的空间分布,用ELISA法检测海马CA1区神经元Akt（pS473）和Akt（pT308）磷酸化水平;用电子显微镜观察其神经元超微结构改变。 结果 脑缺血后神经元皱缩,核消失以缺血24h为著。脑缺血后4 h、24 h及72 h皮层及海马CA1区神经元TUNEL阳性细胞数明显增加（P<0.01）,海马CA1区神经元Akt (pS473) 和Akt (pT308)的表达及磷酸化水平明显升高,以脑缺血4 h的改变最明显,分别为(152.3±3.5) units/mg、(130.8±2.6) units/mg和(149.5±4.7)units/mg和 (42.35±2.49) units/mg、(19.23±1.41) units/mg和(23.38±1.32) units/mg (P<0.01）。缺血PC组神经元损伤明显减轻,皮层及海马CA1区TUNEL阳性细胞明显减少（P<0.01）,且与海马神经元Akt (pT308)活化水平呈平行改变(P<0.05）。结论 树鼩脑缺血海马CA1区细胞凋亡与Akt(pS473) 和Akt (pT308)过磷酸化的信号机制有关,缺血PC抑制海马神经元Akt(pS473) 和Akt(pT308)双磷酸化可能具有抗凋亡作用。     

树鼩血栓性脑缺血时单胺氧化酶活性的变化及银杏内酯B作用机制探讨

目的 :揭示血栓性脑缺血时缺血区和血清单胺氧化酶 (MAO)活性变化及对血小板活化因子 (PAF)受体拮抗剂银杏内酯B(GB)作用机理的探讨。方法 :建立光化学诱导树鼠句血栓性脑缺血模型 ,用酶比色法测量缺血后4、2 4及 72h中心区、半暗区、对侧区及血清的MAO活性 ,并用双缩脲法测定上述各区的蛋白含量。结果 :脑缺血后不同时间缺血中心区MAO活性显著低于假手术组 [(15 4 1± 1 6 3)× 10 3 U/g蛋白 ]或对侧区 [(15 4 7± 1 6 8)× 10 3 U/g蛋白 ],以 72h最为明显 [(2 19± 1 96 )× 10 3 U/g蛋白 ,P <0 0 1];此时缺血半暗区和血清MAO活性 [分别为 (2 5 30± 2 0 1)× 10 3 U/g蛋白和 (2 10 0 4± 2 6 6 7)× 10 3 U/L]明显高于假手术组 (P <0 0 1)。光化学反应后 6h舌下静脉一次注射PAF受体拮抗剂GB(5mg·kg-1)后 2 4h时 ,半暗区MAO活性明显低于缺血组 ,而中心区则高于缺血组 (P <0 0 1)。MAO活性变化与相应区域蛋白含量改变一致 (r=0 81,P <0 0 5 )。结论 :脑缺血后中心区、半暗区MAO活性改变是相应区域单胺类递质消长变化的主要原因 ,MAO活性变化与神经元蛋白质合成能力的改变有关 ;GB的脑保护作用与其拮抗PAF受体和调节MAO活性而促进递质平衡有关。     

高血糖和脑缺血对树鼩皮层不同区域VEGF表达的影响

目的：研究高血糖及局灶性脑缺血条件下,树鼩皮层不同区域VEGF表达的变化,探讨脑缺血、高血糖与VEGF之间的相互关系。方法：用链脲佐菌素复制树鼩高血糖模型,并建立光化学诱导皮层局灶性脑缺血,观察缺血4 h、24 h及72 h的病理形态学改变并计数海马神经元密度,用免疫组化法测定上述时间树鼩缺血中心区、半暗带、对侧皮层VEGF表达的动态变化。结果：形态学观察显示,光化学反应后4 h照射区皮层可见梗塞灶;24 h病损达高峰;72 h伴随胶质细胞增生等修复性反应。相应时点高血糖加缺血组的损伤大于缺血组,以缺血后24 h(P<0.01)和72 h(P<0.05)尤为显著。免疫组化染色表明,缺血后4 h皮层缺血半暗区可见VEGF表达增加, 24 h达高峰,72 h减弱;单纯高血糖也使VEGF表达上调;高血糖加缺血组VEGF表达强于单纯高血糖组(P<0.05),但高血糖加缺血组与缺血组的同期值比较,无显著差异。结论：(1)在低等灵长类动物树鼩体内注射链脲佐菌素,并结合血栓性局部脑缺血方法学的应用能成功复制出实验性高血糖及脑缺血模型;(2)实验证明高血糖对局灶性脑缺血有恶化加重作用;(3)脑缺血及高血糖均可分别作为独立因素诱导VEGF的表达;但缺血与高血糖相加对VEGF表达未显示出叠加效应。     

缺血后适应促进树鼩血栓性脑缺血时紧密连接occludin/ZO-1蛋白表达及抑制脑水肿的机制

 目的: 研究脑缺血及缺血后适应(postconditioning,PC)条件下,树鼩脑缺血时局部脑血流(regional cerebral blood flow,rCBF)、脑水肿及紧密连接(tight junction,TJ)的occludin和zonula occludins(ZO)-1蛋白表达的改变;探讨TJ表达对脑水肿及脑梗死的影响及其可能机制。方法: 将72只健康成年树鼩随机分为对照组、脑缺血组和脑缺血+PC组,其余3只动物用于磁共振成像(MRI)观察。通过光化学反应诱导树鼩局部血栓形成;缺血PC组于缺血后4 h夹闭患侧颈总动脉3次(每次5 min)实施PC处理。用电镜观察神经超微结构,用TUNEL法检测海马神经元的凋亡数量,用激光多普勒血流监测仪检测缺血区的rCBF,用免疫组化及Western blot法观察缺血海马occludin/ZO-1蛋白的表达,MRI技术监测脑梗死体积,组织干湿法检测脑含水量的改变。结果: 树鼩脑缺血后海马CA1区的正常神经元明显减少以及神经元超微结构明显异常。脑缺血组TUNEL阳性细胞数明显增加(P<0.01),rCBF明显降低,occludin/ZO-1表达减弱(P<0.01),脑含水量和脑梗死体积明显增加(P<0.01)。经PC处理的动物,缺血区rCBF增加,TJ表达增强,脑含水量降低,且TUNEL阳性细胞数和脑梗死体积明显减小(P<0.01)。结论: 缺血PC可增加树鼩缺血区rCBF但不增加局部含水量;提示缺血PC缩小脑梗死体积可能与occludin/ZO-1表达增强而抑制脑水肿有关。     

光化学诱导树鼠句血栓性局部脑缺血及其对脑-心卒中的影响

近年来,虽然心脑血管疾病的防治已取得长足的进步,但其仍是全球死亡率最高的疾病之一。脑血栓形成时继发性脑缺血的机制以及脑缺血时心脏功能抑制等诸多复杂的病理生理过程给实验性脑缺血研究时动物种类、模型建立以及观察指标的选择提出了新的要求。本文采用了低等灵长类动物—树鼠句,建立与临床脑缺血发病条件相近的光化学诱导脑缺血模型,在观察不同种类单胺类递质消长变化的同时,通过密度梯度法动态而快速地监测皮层脑水含量的改变,类似的研究迄今未见报道。同时通过此研究为前期工作所观察到“心肌挫抑”（ｓｔｕｎｎｉｎｇ）及线…     

脑缺血时皮层扩布性抑制与心功能障碍

目的 :研究树 鼠句脑缺血时单胺氧化酶 (MAO)活化在脑缺血时心功能障碍以及扩布性抑制中的可能作用。方法 :采用光化学法诱导树 鼠句血栓性脑缺血 ,测定缺血区及血清MAO活性、多巴胺及去甲肾上腺素 (NA)水平 ,经电镜观察脑及肾上腺的超微结构。记录仪检测心率(HR)、左室收缩压峰值 (LVSP) ,左室瞬间收缩与舒张最大速率 (±dp/dtmax) ,左室舒张末期压力 (LVEDP) ,平均动脉压 (MAP)。结果 :树鼠句脑缺血过程中血清NA先升高 (由 11.60± 0 .73ng/ml升高至18.46± 0 .3 9ng/ml,P <0 .0 1) ,72h后降至 8.3 2± 1.86ng/ml;血清MAO活性逐渐升高 ,达 2 10 .1± 2 6.67U/ml(P <0 .0 1) ,72h降低至对照水平 ;心功能指标 (±dp/dtmax,LVSP ) ,尤其是HR明显降低 ,由3 17.0± 98.0 1beat/min降至 2 3 7.4± 3 1.90beat/min(P <0 .0 1) ,于2 4h恢复至对照水平。结论 :血栓性脑缺血时血清NA水平明显取决于MAO活性的变化 ,后者对脑缺血时心脏舒缩功能可能具有调节作用。     

星形胶质细胞活化在局部脑缺血扩布性抑制中的作用

目的研究树鼩局部脑血栓形成过程中,缺血对侧皮层白细胞介素（interluekin,IL）-8水平及星形胶质细胞（astrocyte,AS）胶质纤维酸蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）表达的改变,并探讨扩布性抑制（spreading depression,SD）的可能机制。方法采用光化学反应诱导树鼩血栓性局部脑缺血,经免疫组化法和酶联免疫吸附分析法分别检测缺血对侧星形胶质细胞GFAP表达的灰度值及脑组织IL-8水平,并观察不同浓度IL-8对体外培养条件下星形胶质细胞增殖的影响。结果脑血栓形成后72h缺血对侧皮层IL-8水平及GFAP表达明显增加（P〈0.01）,于培养的星形胶质细胞内加入不同浓度（0.1-1.0μg/ml）IL-8,GFAP阳性细胞数呈时间与剂量依赖方式增加（P〈0.01）。结论脑血栓形成后缺血对侧皮层GFAP表达的改变与IL-8水平升高所致AS活化有关,可能是引起SD的重要因素。     

单胺类递质在光化学诱导树鼩血栓性脑缺血中心区及半暗区形成中的作用

目的和方法：光化学诱导树鼠句血栓性脑缺血,用荧光分光光度法检测实验后４ 、２４ 及７２ ｈ 中心区及半暗区单胺类递质的变化,并用密度梯度法测定以上各区脑水份含量,以探讨单胺类递质代谢紊乱在缺血性脑损伤中的作用。结果：光化学反应后中心区与半暗区的多巴胺（ＤＡ） 、去甲肾上腺素（ＮＥ） 和５ － 羟色胺（５ － ＨＴ） 含量分别在４ 、２４ 及７２ ｈ 降至最低点（ 与假手术组相比Ｐ 均＜ ０－０１） ,然而５ － ＨＴ 的代谢产物—５ － 羟吲哚乙酸（５ － ＨＩＡＡ） 逐渐升高。中心区及半暗区脑水含量于实验后２４ ｈ 均达峰值（ Ｐ 均＜ ０－０１） 。结论：单胺类递质在光化学诱导树鼠句血栓性脑缺血,尤其是半暗区形成中具重要作用;其病理生理改变,既是血栓性脑缺血的结果,又是继发性脑损伤、脑水肿以及迟发性神经元坏死（ ＤＮＤ） 的原因     

缺血后适应对脑缺血树鼩海马TLR4表达的影响

目的: 观察血栓性脑缺血树鼩海马Toll 样受体4(TLR4)表达的改变,进一步探讨缺血后适应对海马TLR4表达的影响。方法: 用光化学法建立血栓性脑缺血模型;并于缺血4 h夹闭缺血侧颈总动脉5 min,再通5 min,重复3个循环,实施后适应处理。用HE染色观察海马组织学改变,Western blotting测定海马TLR4蛋白表达,RT-PCR测定海马TLR4 mRNA。结果: 脑缺血4、24、72 h海马神经元损伤进行性加重,24 h达高峰,后适应后损伤减轻。脑缺血海马TLR4蛋白表达明显增强(P＜0.05)。与脑缺血组比较,后适应4 h及24 h TLR4蛋白表达减少 (P＜0.05),后适应72 h TLR4蛋白表达增加(P＜0.05)。海马TLR4 mRNA的表达趋势与蛋白表达基本一致。结论: 脑缺血时海马TLR4表达明显增强,缺血后适应的脑保护机制可能与调控TLR4表达有关。     

银杏内酯B对树鼩血栓性脑缺血后GFAP表达的影响及机制探讨

目的:观察树鼠句血栓性脑缺血形成后不同部位星形胶质细胞表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的时间消长改变,以及血小板活化因子(PAF)受体拮抗剂银杏内酯B(GB)对GFAP表达的影响,并探讨其可能机制。方法:建立光化学诱导树鼠句血栓性脑缺血模型,用免疫组化法检测缺血后4、2 4、72hGFAP表达,最后用图像分析系统测定其平均灰度。结果:脑缺血后半暗区GFAP表达增多,以2 4h最为显著,其平均灰度值为6 0 .33±3 .0 9(P <0 . 0 1) ,72h表达仍高,其平均灰度值为6 0. 88±2 . 6 2 (P <0 . 0 1) ,此时对侧及远隔区GFAP表达增强。光化学反应后6h于舌下静脉注射GB(5mg/kg) ,发现缺血后2. 4h半暗区星形胶质细胞GFAP表达明显下调,与对照组相比有显著差异(P <0 . 0 5 )。结论:缺血性脑损伤后星形胶质细胞表达GFAP增多与神经元受损有关;GB通过拮抗血小板活化因子(PAF)对神经元的损伤作用使星形胶质细胞表达GFAP减少。     

血小板活化因子在颈髓损伤后线粒体功能损伤中的作用

目的和方法;采用Ａｌｌｅｎ打击法造成Ｃ６．７损伤,鞘内注射血小板活化因子及静脉注射ＰＡＦ受体拮抗剂ＮＢ５２０２１,观察其对颈颈髓损伤后脊髓组织ＰＡＦ含量,颈髓线粒体ＡＴＰ酶活性,线粒体呼吸功能的影响,结果;颈髓损伤后颈髓组织ＰＡＦ含量明显增加,蛛网膜下腔注射ＰＡＦ可使伤后ＰＡＦ含量增加更为显著;ＰＡＦ能够抑制Ｃａ＾２＋－ＮＭｇ＾２＋－ＡＴＰ酶,Ｎａ＾＋－Ｋ＾＋－ＡＴ「Ｐ酶活性,明显降低线粒体耗年头