生物发光技术定量检测SD鼠睾丸组织内端粒酶活性的实验研究

目的：定量研究不同月龄SD(Sprague—Dawley)鼠睾丸组织内端粒酶活性的表达及其意义。方法：应用生物发光技术原位杂交技术，对各月龄组健康雄性SD鼠睾丸组织中端粒酶活性进行了定量检测，并结合光镜、电镜观察对不同月龄SD鼠睾丸组织内的端粒酶活性表达状况进行了研究。结果：从出生后第l天直到第27个月，各月龄组雄性SD鼠的睾丸组织中均可检测到端粒酶活性的表达(阳性率l00％)。出生后第9天时SD鼠睾丸中可检测到高水平的端粒酶活性。结论：SD鼠睾丸组织中终生表达端粒酶活性，作为雄性生殖系统的干细胞，A型精原细胞表达高水平的端粒酶活性。     

吲哚美辛对原代培养胃癌细胞端粒酶活性的调节作用

目的:探讨吲哚美辛对原代培养胃癌细胞端粒酶活性的影响,研究其抗肿瘤的作用机制。方法:常规组织块培养法进行胃癌原代细胞培养,取终浓度为200、400及600μmol/L的吲哚美辛作用于原代培养胃癌细胞后,用MTT比色法测定细胞的生长抑制率,采用半定量-TRAP银染法检测端粒酶活性,流式细胞学检测Bcl-2表达水平。结果:不同浓度的吲哚美辛对原代培养胃癌细胞的增殖均有抑制作用,与对照组相比差异有统计学意义(P0.05);对胃癌细胞的端粒酶活性有抑制作用,其作用呈时间-剂量依赖性;端粒酶活性的降低与Bcl-2水平下降有关。结论:吲哚美辛能抑制胃癌细胞的增殖,降低端粒酶活性,作用机制与Bcl-2水平下降有关。     

端粒酶反义寡核苷酸对肾癌细胞端粒酶活性及其体外增殖的影响

目的　探讨端粒酶反义核酸对肾癌细胞端粒酶活性和体外增殖的影响。　方法　以端粒酶RNA模板区为靶点 ,序列为TAGGGTTAGACAA的硫代磷酸修饰的反义寡核苷酸 (ASON )与肾癌细胞株RCZ细胞共同孵育 ,计 1～ 2 8天细胞数 ,MTT比色法测细胞生长抑制率 ,PCR ELISA法检测端粒酶活性。　结果　ASON实验组与随机引物及空白对照组比较 ,端粒酶活性明显降低 (P<0 .0 0 1) ,细胞增殖数目显著减少 (P <0 .0 1) ,抑制率显著增加 (P <0 .0 0 1) ,抑制效果显示剂量依赖性 (P <0 .0 5 ) ,具有序列选择的特异性。　结论　以端粒酶RNA模板区为靶点的反义寡核苷酸抑制肾癌RCZ细胞的端粒酶活性和体外增殖 ,可能对肿瘤治疗有潜在的意义。     

反义寡核苷酸对胆囊癌细胞端粒酶活性作用的实验研究

目的：探讨反义寡核苷酸对胆囊癌细咆端粒酶活性的影响及对胆囊癌细咆生长增殖的作用。方法：设计针对端粒酶RNA亚基模板序列并经硫代磷酸修饰的反义、正义和随机序列寡核苷酸，并以正常人成纤维细胞作对照，观察其对人胆囊癌细胞（GBC—SD）端粒酶活性和细胞生长增殖的影响作用以及对正常人成纤维细胞的作用。结果：反义寡核苷酸可有效地抑制胆囊癌细胞的端粒酶活性，呈剂量依赖性，并明显的抑制胆囊癌细胞的生长，对正常人成纤维细胞生长无明显作用。结论：硫代反义寡核苷酸（PS-ODN）对胆囊癌端粒酶活性有明显的抑制用并促进细胞凋亡。     

化学治疗药物对大肠癌细胞端粒酶活性的影响

目的：研究常用化学药物对大肠癌细胞HT－29端粒酶活性的影响。方法：利用端粒酶重复扩增实验（TRAP）结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法。测定HT－29细胞经过几种化学药物（顺铂，阿霉素，吡柔比星，丝裂霉素，5－FU）不同浓度和时间作用后端粒酶活性的变化。结果：当各种药物大剂量处理细胞4h后再祛除药物培养20h,顺铂对酶的活性完全抑制，丝裂霉素，吡柔比星，阿霉素和5－FU无明显抑制作用。而未经20h再培养则无作用；小剂量药物处理细胞6d。其结果同大剂量相似。结论：顺铂对大肠癌HT－29细胞端粒酶活性有明显抑制作用，而其他几种化学药物没有明显的抑制作用。     

PCR-ELISA法检测膀胱肿瘤患者尿脱落细胞端粒酶活性

目的：探讨尿脱落细胞端粒酶活性变化在膀胱肿瘤诊断中的作用。方法应用PCR－ELISA法检测53例膀胱肿瘤患者尿液脱落细胞端粒酶的活性。结果：非膀胱肿瘤和膀胱肿瘤患者尿液脱落细胞端粒酶活性阳性率分别为64．15％（34．53）和7．69％（2／26）,健康对照者7例均为阴性,膀胱肿瘤患者与正常人及非膀胱肿瘤患者的端粒酶活性分别相比,差别均有极显著性意义（P＜0．001）。但端粒酶活性与肿瘤的分期分级无相关性。结论：尿脱落细胞端粒酶活性检测可以作为诊断膀胱肿瘤的无创性检测方法,但不能预测膀胱肿瘤的临床分期分级。     

膀胱癌组织中端粒酶活性研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）为基础的端粒酶活性检测方法（ＴＲＡＰ法），对５例正常膀胱组织、４例膀胱炎症组织、４２例膀胱癌组织和癌旁正常组织进行检测。正常膀胱组织和膀胱炎症组织无端粒酶活性，膀胱癌组织端粒酶表达阳性率７６．２％，癌旁组织阳性率为２６．２％，端粒酶活化与膀胱癌分期分级呈正相关。结果提示：端粒酶活化与膀胱癌浸润发展密切相关，癌旁组织端粒酶活化提示肿瘤微浸润可能。     

A型精原细胞体外分离纯化及其端粒酶活性抑制后的形态学变化

目的 :探讨分离纯化、体外培养的A型精原细胞在端粒酶活性受到抑制后细胞形态学的改变。方法 :以脂质体LipofectAMINE 2 0 0 0介导将硫代磷酸修饰的端粒酶mTR反义寡核苷酸 (ASODN)转染体外分离纯化的 (SD)大鼠精原细胞 ,采用生物发光技术检测精原细胞中端粒酶活性的改变 ,光镜及电镜观测端粒酶活性抑制后A型精原细胞的形态学变化。结果 :mTR ASODN可明显抑制精原细胞端粒酶活性 (P <0 .0 5 )。ASODN转染 4 8～ 72h后 ,光镜下可见细胞生长缓慢 ,染色质浓缩 ,胞质出现颗粒样物质 ,72h后死细胞数较空白对照组明显增多。电镜下可见部分细胞核异染色质浓聚集、浓缩和边集 ,胞质胞核内均可见空泡 ;部分细胞核完全固缩。单纯脂质体组及正义寡核苷酸对照组形态学均无显著变化。结论 :mTR ASODN可明显抑制体外培养的A型精原细胞端粒酶活性 ,并在转染 4 8～ 72h后使细胞形态学出现明显改变     

Detection of telomerase activity in breast masses by fine-needle aspiration

Background: Telomerase is an RNA-dependent DNA polymerase that compensates for the telomere shortening that occurs in its absence. Reactivation of telomerase is thought to be an important step in cellular immortalization, and recent studies have indicated that telomerase activity is often detected in primary human malignancies. The clinical implications of telomerase activity in human tumors are currently under investigation. Methods: Eighty-nine samples (46 FNAs and 43 gross tissue biopsies) from 44 patients with breast masses were analyzed prospectively for the presence of telomerase activity by a modification of the telomere repeat amplification protocol (TRAP). All samples were obtained directly from the excised mass at the time of specimen removal in the operating room. Results: Telomerase activity was detected in 17 of 19 (90%) FNA samples and 15 of 18 (83%) invasive breast cancer tissue biopsies. Telomerase was also detected in 9 of 16 (56%) FNAs and 8 of 15 (53%) tissue biopsies from 16 fibroadenomas. Other benign proliferative lesions (n=5) did not have detectable telomerase activity in either FNA or tissue specimens. FNA-TRAP results correlated with the gross tissue specimen TRAP results in 95% of all cases. Conclusion: The FNA-TRAP assay for telomerase detection is a highly sensitive and accurate method for the detection of telomerase activity in breast masses. Future application of these techniques should facilitate evaluation of telomerase as a tumor marker in the clinical management of breast and other solid malignancies. These authors contributed equally to this work.     

RNA干扰对肾癌细胞端粒酶基因表达和活性的抑制作用及其增殖、凋亡的影响

目的探讨小干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞端粒酶基因表达、活性的抑制作用及对肾癌细胞增殖、凋亡的影响。方法将针对人端粒酶RNA(hTR)模板区的siRNA(100nmol/L)转染肾癌7860细胞,采用RTPCR检测7860细胞端粒酶mRNA表达,端粒重复序列扩增酶联免疫吸附法检测端粒酶活性,MTT法检测细胞增殖,免疫细胞化学TUNEL法检测细胞凋亡。结果hTRsiRNA处理组7860细胞端粒酶mRNA表达(40.7±1.5)%降低,端粒酶活性(32.7±2.3)%降低,细胞增殖抑制率(63.6±1.6)%增加,凋亡细胞阳性率(39.4±0.6)%增加。分别与阴性siRNA对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论siRNA能抑制人肾癌细胞端粒酶mRNA表达及活性,进而抑制其增殖、促进其凋亡,有望成为肾癌基因治疗的有效工具。     

大肠癌与端粒酶活性相关性的研究

目的　探讨端粒酶活性在大肠癌发生、发展以及浸润转移中的意义。方法　应用端粒重复扩增 (TRAP)及免疫组织化学法对 30例大肠癌、癌旁组织、正常大肠组织及 2 0例大肠腺瘤性息肉组织端粒酶活性、端粒酶催化亚基蛋白 (hTERT)的表达进行检测。结果　端粒酶活性在癌组织中检出率明显高于其他组织 (P <0 .0 5) ;大肠癌组织端粒酶活性与淋巴结是否有转移之间关系密切 ,伴淋巴结转移大肠癌端粒酶阳性表达率明显高于无淋巴结转移者 (P <0 .0 5)。结论　端粒酶活性与大肠癌的发生发展以及浸润转移密切相关 ,检测端粒酶活性对临床预测大肠癌淋巴结转移趋势、评价恶性程度和判断预后均有重要意义     

端粒酶活性和端粒长度在大肠癌组织中的表达及其意义

目的　探讨端粒长度及端粒酶活性在大肠癌发生发展中作用。方法　采用Southernblot及端粒重复扩增 (TRAP)法检测端粒长度和端粒酶活性水平。结果　大肠癌端粒酶活性明显高于癌旁组织及正常大肠黏膜组织 ;大肠癌组织端粒长度较癌旁组织及正常大肠黏膜明显缩短 ,且随大肠癌Dukes分期的进展进一步缩短。结论　端粒的短缩和端粒酶的激活可能对大肠癌的发生发展起重要作用.     

端粒酶活性表达在肾恶性肿瘤中的临床意义

目的　探讨端粒酶活性表达在肾恶性肿瘤中的临床意义。　方法　采用端粒酶 PCR ELISA法检测 3 1例肾恶性肿瘤、3 1例肿瘤旁组织和 6例正常肾组织标本端粒酶活性 ,按不同的临床病理参数分组分析。　结果　 3 1例肾恶性肿瘤组织端粒酶表达阳性率 80 .6% ,肿瘤旁组织及正常肾组织端粒酶表达均阴性 ,差异有显著性意义 (P <0 .0 1) ;病理分级Ⅰ级者端粒酶表达阳性率 58.3 %(7/ 12 ) ,Ⅱ级者阳性率 91.7% (11/ 12 ) ,Ⅲ～Ⅳ级者阳性率 10 0 .0 % (7/ 7) ,Ⅱ～Ⅳ级者端粒酶表达明显高于Ⅰ级者 (P <0 .0 5) ;RobsonⅠ期阳性率 77.8% (14 / 18) ,Ⅱ期阳性率 81.8% (9/ 11) ,Ⅲ～Ⅳ期 2例均阳性 ;T1N0 M0 期 3例均阳性 ,T2 N0 M0 期阳性率 79.2 % (19/ 2 4) ,T3N0 M0 期阳性率 66.7% (2 / 3 ) ,T2 N2 M0期 1例阳性 ,端粒酶表达与肿瘤临床分期无明显相关 (P >0 .0 5)。　结论　端粒酶活性检测结合病理检查对肾恶性肿瘤的早期诊断及预后判断有重要价值。     

人脂肪组织来源干细胞体外增殖分化中端粒酶的表达

目的 探讨体外培养条件下人脂肪干细胞增殖和分化过程中端粒酶的表达水平,为其作为种子细胞的应用研究提供理论基础.方法 体外分离、培养人脂肪干细胞并传代,行流式细胞表面抗原分析,并用油红O染色及茜素红染色行成骨和成脂诱导分化的鉴定;采用TRAP法分别检测新鲜的不同时间培养的人脂肪干细胞和诱导分化为脂肪细胞的人脂肪干细胞的端粒酶活性.结果 脂肪干细胞具有向脂肪细胞、成骨细胞多向分化的能力,且表达干细胞相关表面标志物.新鲜分离和传代的脂肪干细胞,在体外培养12代内端粒酶活性呈阴性或低水平表达;一旦经过成脂诱导分化,细胞端粒酶活性表达上调,培养3～6 d后端粒酶活性开始出现逐渐降低.结论 用胶原酶消化法从脂肪抽吸术中得到的细胞主要是人脂肪干细胞;在体外培养增殖的过程中,人脂肪干细胞的端粒酶活性未见异常表达;成脂诱导分化早期人脂肪干细胞端粒酶活性增高,其后开始出现下降趋势.     

端粒酶活性检测对胰腺癌的早期诊断价值

目的 探讨端粒酶活性检测对胰腺癌的早期诊断价值.方法 检索早期经胰液、胰管刷取物、针吸组织细胞等样本检测端粒酶活性诊断胰腺癌的研究文献.筛选文献并提取纳入研究中有关准确度的数据.采用Meta-DiSc1.4软件进行Meta分析.结果 共纳入文献12篇,经异质性检验无阈值效应;Meta回归分析表明实验盲法、不同样本间无异质性,不同检测方法是纳入研究间异质性的主要来源.进一步亚组分析,TRAP法检测端粒酶活性早期诊断胰腺癌的敏感度、特异度分别为0.86(95%CI:0.78～0.91)、0.78(95%CI:0.68～0.87),综合受试者工作特征曲线下面积(AUC)=0.9005,Q*=0.8318;TRAP-ELISA法检测的上述指标分别为0.72(95%CI:0.63～0.79)、0.63(95%CI:0.47～0.77),AUC=0.7634,Q*=0.7046.结论 端粒酶活性检测对胰腺癌的早期诊断价值中等,可以作为胰腺癌早期诊断或筛查可选的检查方法,单独作为诊断指标尚有不足.     

端粒酶反义寡核苷酸对乳腺癌端粒酶活性及细胞生长的影响

目的　探讨端粒酶反义寡核苷酸对人乳腺癌细胞端粒酶活性的影响及抑制端粒酶活性以控制乳腺癌细胞生长的可能性。方法　采用 10 μmol/L与端粒酶催化亚基 (hTRT )mRNA互补的反义寡核苷酸处理乳腺癌细胞 ;于处理后 2 4、72h用端粒重复序列扩增及酶联免疫吸附方法检测细胞端粒酶活性 ;于处理后 72h以流式细胞术测定细胞周期 ;于处理后 12 0h采用原位末端标记法检测细胞凋亡。结果　经hTRT反义寡核苷酸作用后 ,细胞端粒酶活性明显受到抑制 ,至作用后 72h ,端粒酶活性较对照组降低 65 .6% (P <0 .0 5 ) ;细胞生长明显受到抑制 ;细胞周期发生显著变化 :G0 /G1期细胞数增多 ,S期及G2 /M期细胞数则减少 ;细胞增殖指数由 0 .46降低至 0 .2 5 ;并可观察到凋亡细胞的出现 ,凋亡发生率为 12 .5 % ;而无义组及空白对照组以上各指标均无明显变化 (P >0 .0 5 )。结论　端粒酶反义寡核苷酸可明显抑制乳腺癌细胞端粒酶活性 ,抑制细胞生长和增殖 ,诱导细胞凋亡 ;表明应用反义技术抑制端粒酶活性治疗乳腺癌具有广阔的前景。     

腺病毒载体介导外源性端粒酶在组织工程种子细胞中的表达

目的　通过腺病毒载体将外源性人端粒酶逆转录酶催化亚基 (hTERT)基因导入组织工程常用种子细胞中 ,探讨其对各细胞生存状况的影响。方法　取第 4代的猪耳软骨细胞、猪骨髓基质干细胞和人皮肤成纤维细胞 ,分别以Adeno hTERT和Adeno lacZ进行基因转染。 5d后 ,取各组细胞样品 ,以逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)和PCR 酶联免疫吸附法 (PCR ELISA)分别检测各自的hTERTmRNA表达及其hTERT的活性。各组hTERT转染细胞与对照细胞接种于 96孔板中 ,通过MTT法对细胞的生存和活力状况进行检测。结果　各组细胞经hTERT转染后 ,端粒酶的表达和活性均显著上升 (P <0 .0 1)。四甲基偶氮唑盐 (MTT)氧化反应结果显示hTERT转染的细胞中 ,细胞存活和活力状况显著高于对照组的细胞 (P <0 .0 1)。猪耳软骨细胞经hTERT转染后达到空白对照组细胞的 (12 1.75± 5 .3 7) % ;猪骨髓基质干细胞达 (12 5 .2 2± 2 .78) % ;人皮肤成纤维细胞达 (112 .5 7± 3 .99) %。结论　腺病毒载体介导的外源性hTERT基因在组织工程种子细胞中的表达 ,可以提高其在体外的扩增潜力 ,改善组织工程构建中种子细胞来源不足的情况。     

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目的 探讨乳腺肿块细针穿刺端粒酶活性检测在乳腺癌术前诊断中的临床应用价值。方法 对８５例乳腺肿块病人者细针穿刺,对穿刺细胞分别用端粒重复扩增法（ＴＲＡＰ）进行端粒酶活履检测和光镜细胞检查。以术后石蜡病理切片结果最地两种检测方法在术前诊断乳腺癌方面的灵敏度、特异性和约登指数进行了比较。结果 术前端粒酶活性检测同穿刺细胞学相比,特异性分别为７３．９％和８２．６％（Ｐ〉０．０５）,差异无显著性;灵敏度分     

力尔凡联合顺铂对恶性腹腔积液临床疗效及端粒酶活性的影响

目的探讨力尔凡对恶性腹腔积液的临床治疗价值及对端粒酶活性的影响。方法48例恶性腹腔积液患者分为治疗组和对照组。治疗组(28例)采用力尔凡联合顺铂腹腔内注入,对照组(20例)单用顺铂腹腔内注入。分别在治疗前,治疗后1周、2周及3周,观察腹腔积液消失情况,评定疗效,采用半定量TRAP-银染法检测腹水细胞端粒酶活性。结果治疗组临床治疗有效率89.3%,对照组为60.0%(P<0.01),随着治疗时间的延长,端粒酶活性逐渐下降。结论力尔凡联合顺铂治疗恶性腹腔积液具有协同作用,其对端粒酶活性的抑制可能参与了以上机制,检测端粒酶活性可作为评价其疗效的敏感生物学指标。