凝血酶对培养大鼠皮层神经细胞的毒性作用研究

目的通过研究凝血酶对培养神经细胞的毒性作用,探讨脑出血凝血酶致神经细胞损伤的机制.方法采用新生1～2 d大鼠皮层神经元进行原代分散培养,分别在含150 U/ml凝血酶、150 U/ml凝血酶 150 U/ml重组水蛭素以及正常的培养液中孵育3 d后测定下列指标:①甲苯胺蓝染色法测定残存细胞数并计算神经细胞丧失率;②TdT介导的dUTP缺口末端标记法检测TUNEL阳性细胞的表达;③免疫组化二步法测caspase-3免疫反应性(Immune Reactivity,IR)细胞的表达;④培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性.结果凝血酶组较水蛭素干预组及对照组神经细胞明显减少(P＜0.05);凝血酶组有较多的TUNEL阳性细胞及caspase-3 IR细胞表达,并明显多于对照组及水蛭素干预组(P＜0.05),凝血酶组TUNEL阳性细胞比率及caspase-3 IR细胞比率明显高于对照组及水蛭素干预组(P＜0.01或P＜0.05);与实验前相比,实验三组各组LDH活性均升高(P＜0.05),三组间两两比较LDH活性无统计学差异(P＞0.05).结论 150 U/ml的凝血酶可导致培养的神经细胞死亡,并可被凝血酶的特异抑制剂水蛭素阻断,细胞死亡的原因可能为细胞凋亡而非坏死,脑出血后凝血酶的释放是脑出血神经细胞凋亡性损伤的机制之一.     

大鼠脑出血后神经元凋亡与caspase-3表达的关系

目的　研究大鼠实验性脑出血模型中神经细胞凋亡发生的规律以及与caspase 3表达的关系 ,观察caspase抑制剂zVADfmk对出血性脑损伤的保护作用。方法　应用立体定向技术 ,将自体不凝血注入大鼠尾状核区制备脑出血模型 ,将动物随机分为假手术组、出血组和zVADfmk干预组 ,分别在不同时间点断头取脑 ,连续切片作TUNEL染色和caspase 3免疫组化染色。 结果　脑出血后 6h血肿内部及周边组织出现TUNEL阳性细胞 ,72h达高峰 ,2周时仍有少量表达 ;caspase 3在脑出血后 6h表达明显增高 ,2 4h达到高峰 ,各组与假手术组之间差异显著 (P <0 .0 5 )。脑出血后的TUNEL阳性细胞与caspase 3的表达呈正相关 (r =0 .6 0 7,P <0 .0 5 ) ,且caspase 3的高峰时间早于凋亡的发生。经caspase 3抑制剂干预 ,血肿周围组织TUNEL阳性细胞明显减少 ,与对照组相比差异显著 (P <0 .0 5 )。结论　凋亡机制参与了脑出血后继发性损伤的过程 ,而caspase 3的激活在其中起着重要作用 ,通过阻断caspase的激活可以减少脑出血后神经细胞凋亡的发生     

凝血酶与出血性脑组织损伤的相关性动物实验研究

目的 观察大鼠脑内注入凝血酶或全血后神经细胞凋亡和脑组织水肿的动态改变，并观察凝血酶特异性抑制剂（水蛭素）能否减轻凝血酶对脑组织的损伤。方法 成年168只SD大鼠随机分为5组，即凝血酶组、脑出血组、凝血酶加水蛭素组、脑出血加水蛭素组和生理盐水对照组，分别向大鼠右侧基底节区注入凝血酶、全血、凝血酶加水蛭素、全血加水蛭素和生理盐水，于注射后6、24、72h，7d取脑组织，检测脑组织水含量（干湿重法）、神经细胞的凋亡情况（Tunel法）。结果 与生理盐水对照组比较，凝血酶组和脑出血组的脑组织水含量及凋亡细胞数明显增加。时效学研究显示脑出血组脑组织水肿和神经细胞凋亡开始于术后6h，72h达高峰，7d后下降；凝血酶组开始于术后6h，24h达高峰，72h下降。与生理盐水对照组比较，脑出血组术后6h凋亡细胞数无统计学差异（P〉0、05），凝血酶组注入凝血酶后6h凋亡细胞数有明显增加（P〈0、05）。水蛭素干预后脑出血组和凝血酶组的脑组织水含量和神经细胞凋亡数明显降低（P〈0、05）。结论 大剂量凝血酶诱导的组织水肿和细胞凋亡在24h达高峰，脑出血后组织水肿及细胞凋亡均于72h达高峰可能与脑出血后凝血酶逐渐由血肿释放有关，水蛭素能显著减轻脑组织水肿和神经细胞凋亡。     

实验性脑出血后大鼠神经细胞凋亡与NF—κB的表达

目的：研究实验性脑出血后大鼠神经细胞凋亡与NF—κB表达的动态变化,并初步探讨两者的关系。方法：将大鼠随机分为脑出血组、假手术组和对照组,应用立体定向技术将自体不凝血注入大鼠尾状核制备脑出血模型,大鼠分别在不同时间点断头取脑,连续冠状切片做TUNEL染色和NF—κB免疫组化染色。结果：凋亡细胞在脑出血后6h出现,1d后开始增多,3d达到高峰,并持续到7d仍有表达,并且与NF—κB的表达变化一致,各组与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。脑出血后TUNEL阳性细胞与NF—κB的表达呈正相关（r=0．957,P〈0．01）。结论：脑出血后存在细胞凋亡,且可能与NF—κB的激活有关。     

大鼠脑出血急性期给予水蛭素后血肿周围组织胶质纤维酸性蛋白的表达

目的通过观察水蛭素对大鼠脑出血后血肿周围组织胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达的影响,探讨能否早期应用活血化瘀药物。方法采用胶原酶生理盐水0．8μL（1μL含胶原酶0．5U和肝素6U）注入法制作实验性脑出血动物模型。Wistar大鼠随机分为甘露醇6h、甘露醇3d、水蛭素6h、水蛭素3d、甘露醇＋水蛭素6h、甘露醇＋水蛭素3d组。光镜下定性观察脑出血后血肿周围脑组织的病理变化;免疫组化染色法观察脑出血后GFAP的表达。结果甘露醇＋水蛭素6h组及3d组的灰度值分别高于单用水蛭素组或单用甘露醇组（P〈0．05）,且6h组灰度值高于3d组（P〈0．05）,说明近期效果优于远期效果。结论脑出血早期在控制脑水肿基础上加用水蛭素可阻止过度的GFAP上调,抑制过度的反应性胶质化,促使星形胶质细胞形态向正常方向发展,可减轻急性期脑组织损伤,脑出血后早期应用水蛭素有可能缩短病程,改善预后。     

丁咯地尔对大鼠坐骨神经损伤后背根神经元凋亡及Caspase-3、Bcl-2表达的影响

目的:研究丁咯地尔对大鼠坐骨神经损伤后背根神经元凋亡及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、Bcl-2表达的影响.方法:将48只成年健康SD大鼠随机分为正常组、模型组、丁咯地尔组,预处理14 d后制作坐骨神经损伤动物模型,分别在模型制备后12,24,72 h与7 d各组提取L1～5背根神经节,用原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记法(TUNEL法)检测神经细胞的凋亡水平和用免疫组化方法计数Caspase-3、Bcl-2阳性细胞表达数,并加以组间比较.结果:正常组大鼠背根神经细胞凋亡和Caspase-3阳性细胞较少;而模型组在坐骨神经损伤后12 h,神经细胞凋亡及Caspase-3阳性表达数明显增多,72 h达高峰,7 d表达减弱;丁咯地尔组在坐骨神经损伤后12 h,神经细胞凋亡及Caspase-3阳性表达数也增多,但较模型组减少(P＜0.05),24 h至7 d均较同期模型组明显减少(P＜0.01);丁咯地尔组于模型制备后12 h Bcl-2即有明显表达,72 h达高峰,7 d时与模型组比较仍有明显差异(P＜0.05).结论:坐骨神经损伤后背根神经元存在广泛的细胞凋亡现象,丁咯地尔通过抑制Caspase-3蛋白表达,上调Bcl-2表达,从而抑制细胞凋亡来发挥其神经保护作用.     

微创血肿抽吸术后大鼠脑出血周围组织细胞凋亡的研究

目的探讨脑出血周围组织神经细胞凋亡相关基因热休克蛋白70(HSP70)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的变化规律及微创血肿抽吸干预治疗对神经细胞凋亡的影响。方法将SD大鼠75只分为假手术组、脑出血组、血肿抽吸组,各组又分为12 h、1 d、2 d、3 d、7 d 5个时间点。假手术组注入尾状核2μL生理盐水,脑出血组注入大鼠尾状核2μLⅣ胶原酶。血肿抽吸组是在脑出血模型制作6 h后进行血肿抽吸。各组分别于各时间点处死大鼠取脑组织,采用免疫组织化学染色测定各组大鼠脑出血周围HSP70、Caspase-3蛋白的表达并进行统计学处理。结果 HSP70、Caspase-3含量脑出血组较血肿抽吸组及假手术组均明显增高(P<0.05),血肿抽吸组比假手术组明显增高(P<0.05)。HSP70表达在12 h出现,3 d达高峰,随后表达逐渐减少。Caspase-3蛋白的表达在12 h出现,在3 d时达高峰,第7天表达明显减少。结论 Caspase-3蛋白高表达说明在脑出血第3天神经细胞凋亡和损害达到高峰,随后逐渐降低,HSP70高表达对出血脑组织具有明显的保护效应,且对Caspase-3蛋白的表达具有抑制作用,而且在早期对脑出血进行微创血肿抽吸干预治疗可以减少脑出血后神经细胞的凋亡。     

大鼠实验性脑出血后细胞凋亡和神经损伤的关系

目的　研究脑出血后血肿周围水肿带细胞凋亡随出血时相点的变化规律 ,以及脑出血后神经细胞凋亡和神经功能的关系。方法　健康雄性Wistar大鼠体质量 2 0 0～ 2 5 0g ,随机分组 ,脑内尾状核注射分别Ⅳ型胶原酶 肝素生理盐水溶液、单纯生理盐水 ,分为术后 6、12、2 4h、3、7d共 5个时相点。术后在相应时相点评价大鼠神经功能缺损后 ,制作冰冻切片 ,对切片进行HE染色和TUNEL染色 ,之后利用图像分析仪 ,观察阳性细胞数。结果　脑出血后动物出现不同程度神经功能缺损 ,在 3d神经功能损害最严重。出血 6h后血肿周围出现TUNEL阳性细胞 ,3d左右TUNEL阳性细胞范围最广。结论　脑出血后细胞凋亡与神经功能损害程度一致 ,细胞凋亡在脑出血后神经功能损伤中起重要作用。     

局部应用重组水蛭素治疗脑出血后脑水肿的实验研究

目的 探讨局部应用凝血酶特异性抑制剂（重组水蛭素）治疗脑出血后保护机制。方法 成年雄性SD大鼠随机分为生理盐水组、脑出血组和水蛭素组（出血后3h）。以50m自体血注入大鼠尾状核方法建立脑出血模型，应用干一湿重法观察脑水肿变化，前肢放置实验观察行为学。每组每时相点（1、2、3、7、14、28天）各6只大鼠。结果 脑出血组和水蛭素组脑含水量与生理盐水组在24h、48h、72h比较P〈0．05，7天时各组间无明显差异（P〉0．05）；脑出血组大鼠前肢放置实验结果与生理盐水组比较（P〈0．05），水蛭素组与脑出血组比较P〈0．05。结论 脑出血后24～48h水肿达高峰；重组水蛭素可明显减轻脑水肿，同时可以改善脑出血后的神经功能缺损。     

大鼠急性脊髓损伤后神经细胞凋亡及caspase-3、AIF的表达

目的 研究大鼠急性脊髓损伤后神经细胞凋亡及caspase-3、凋亡诱导因子(AIF)的表达.方法 将78只成年健康Sprague-Dawley(SD)鼠按Nystrom法建立大鼠脊髓(T8、T9)急性压迫损伤模型,HE染色观察脊髓组织病理学变化,免疫组化测定各时间点AIF和caapase-3的表达变化,原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)标记法(TUNEL法)检测神经细胞的凋亡水平.结果 免疫组化结果显示正常及假手术组大鼠脊髓神经细胞caspase-3,AIF,TUNEL阳性细胞较少,脊髓损伤后1 d,AIF阳性细胞数明显增多(P<0.05),5 d表达减弱.caspase-3阳性细胞数在脊髓损伤后8 h明显增多,3 d迭高峰(P<0.01),7 d表达减弱.TUNEL阳性细胞数也在8 h明显增多,3 d达高峰(P<0.01),7 d表达减弱.结论 脊髓损伤后存在广泛的细胞凋亡现象,caspase-3、AIF均参与了细胞凋亡的调节.     

促红细胞生成素对脑出血神经生长因子表达的影响

目的研究促红细胞生成素(EPO)对脑出血后神经功能缺损、细胞凋亡及神经生长因子表达的影响。方法用立体定向技术,将自体不凝血注入大鼠尾状核区制备脑出血模型。110只Wistar雄性大鼠,随机分成四组:正常组、假手术组、ICH对照组、rhEPO治疗组。应用免疫组化及原位细胞凋亡检测脑出血灶周组织NGF、BDNF表达及凋亡细胞。统计学方法采用t检验和LSD-t检验。结果与对照组比较,rhEPO治疗后48～168 h大鼠神经行为学评分明显减少(P0.05)。ICH对照组及rhEPO治疗组术后6h血肿周围皮质TUNEL、NGF、BDNF阳性细胞明显增加,72h达到高峰,120h下降,各时间点与假手术组比较差异有显著性(P0.01)。rhEPO治疗组TUNEL阳性细胞数明显少于同时点ICH对照组(P0.01),但NGF、BDNF阳性细胞数明显增加(P0.01)。结论凋亡机制参与脑出血后继发性损伤过程,EPO能促进神经元BDNF、NGF的表达,对脑出血后神经损伤起保护作用。     

去铁胺减少老年大鼠急性脑出血后神经元凋亡作用及其机制

目的:探讨去铁胺(deferoxamine,DFX)降低急性脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)诱导的神经元凋亡作用及其机制。方法:雄性SD大鼠右侧基底节区尾壳核注射100μL自体全血,随机分为观察组和对照组。观察组ICH后2 h注射DFX,以后每12 h注射一次,直至7 d;对照组注射等量生理盐水(normal saline,NS)。两组均在ICH后1、3、7 d进行行为学检测,并检测血肿大小、神经元凋亡、铁蛋白、血浆铁蛋白水平。结果:观察组ICH后7 d前肢放置明显恢复(P<0.01),ICH后3、7 d右转百分比明显降低(P<0.01);ICH后7 d,观察组血肿分辨率明显降低(P<0.01);ICH后1 d,观察组TUNEL阳性细胞数显著降低(P<0.05),但ICH后3 d,两组TUNEL阳性细胞数差异无统计学意义(P>0.05);观察组铁蛋白重链和轻链表达显著减少(P<0.05);血浆铁蛋白水平在ICH后3、7 d有所降低,但与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:DFX缓解老年大鼠急性ICH后神经细胞凋亡及神经功能缺损,可能是通过影响急性ICH的内源性反应而发挥保护作用。     

大鼠脑纹状体出血后神经功能损伤的研究

目的:研究影响大鼠脑出血(ICH)后神经功能的因素。方法:将88只SD大鼠随机分为NCG、SCG、ICHG,各组根据术后时间又分为12h、1d、2d、3d、7d5个亚组;用胶原酶/肝素/生理盐水液注入大鼠脑纹状体制备ICH模型;分别在术前和术后各时间点对大鼠进行神经功能评分;干湿重法测脑水含量;TUNEL法观察凋亡细胞;电镜观察血肿周围细胞超微结构改变。结果:1ICH后大鼠出现不同程度神经功能损伤,在ICH3d神经功能损害最严重;2ICHG脑水含量明显高于SCG,以ICH3d脑水含量最高;3在ICH12h血肿周围出现TUNEL阳性细胞,3dTUNEL阳性细胞数最多,范围最广,以神经细胞为主;4电镜观察到ICHG血肿周围神经细胞出现凋亡细胞的形态改变。结论:ICH后血肿对周围神经组织的压迫、炎症反应、脑水肿以及细胞凋亡均为大鼠神经功能损伤的因素。     

大鼠脑出血后血肿周围组织细胞凋亡及抑肽酶的干预作用

目的探讨脑出血后血肿周围细胞凋亡的规律以及抑肽酶的干预作用。方法采用未抗凝新鲜自体股动脉血注入大鼠尾状核建立脑出血动物模型。将75只大鼠随机分成对照组、脑出血组、抑肽酶组，各实验组分6h、1d、3d、5d及7d5个时间点。分别采用TUNEL染色法观察血肿周围细胞凋亡的发生。结果脑出血后72h血肿周围组织可见大量凋亡细胞，抑肽酶干预可使凋亡细胞的数量明显下降（P〈0．01）。结论提示抑肽酶可以减轻脑出后血肿周围脑组织细胞凋亡。     

实验性脑出血大鼠脑组织血管内皮生长因子的表达及意义

目的 探讨实验性脑出血大鼠脑组织血管内皮生长因子(VEGF)的表达及其意义。方法 应用立体定向技术于大鼠尾壳核注射自体尾动脉血建立大鼠脑出血模型，动态观察组织病理学改变，动态观察脑组织含水量。免疫组织化学染色显示脑出血后VEGF在脑组织内的表达。结果 大鼠脑出血后脑含水量于24h开始明显升高。48h达高峰并持续到72h，与病灶对侧及假手术组比较有统计学意义；脑出血后脑内VEGF阳性细胞数随时间逐渐增多。以24h，48h，72h最为显著，7d时呈现血管样结构。结论 脑出血后脑内VEGF的表达与脑水肿相关，且VEGF可促进血肿周围组织的血管增生，可能对脑出血后的组织修复起促进作用。     

依达拉奉对脑出血大鼠血肿周围组织 NF-κB p65 蛋白表达的影响

目的 探讨依达拉奉对脑出血大鼠血肿周围组织NF—κB p65蛋白表达的影响。方法 108只健康雄性Wistar大鼠随机分为正常组、假手术组、脑出血组和依达拉奉治疗组,其中脑出血组和依达拉奉治疗组又分为3h、6h、12h、1d、2d、3d、5d、7d8个亚组,每组6只。采用大鼠尾动脉自体不凝血50μL注入尾状核区建立脑出血模型。依达拉奉治疗组于模型制作成功后2h开始腹腔内注射3mg／kg依达拉奉。1次,d。免疫组化法检测NF—κB p65蛋白表达变化。结果 与脑出血组相比,依达拉奉治疗组于出血后6h、12h、1d、2d、3d、5d、7d血肿周围组织NF—κB p65蛋白表达均减少（P〈0．05或P〈0．01）。结论 依达拉奉对脑出血后血肿周围脑组织损伤有保护作用．可能与其抑制NF—κB p65蛋白表达有关。