曼氏迭宫绦虫成虫及裂头蚴蛋白电泳初步分析

本文应用PAGE和SDS-PAGE技术对曼氏迭宫绦虫成虫及其裂头蚴的可溶性蛋白作了初步分析及其分子量测定。PAGE:成虫显带23条,主带4条;裂头蚴显带18条,主带5条。SDS-PAGE:成虫显示37条区带、主带10条(分子量分别为71,63,53,44,41,33,30,22,20,10.5KD);裂头蚴显示24条区带,主带4条(分子量分别为54,41,36,33KD)。成虫和裂头蚴的蛋白电泳图谱及主带分布有显著差别。     

mRNA差异显示技术分离猬迭宫绦虫幼虫特异表达基因

目的　查找猬迭宫绦虫幼虫裂头蚴阶段特异性表达基因。　方法　裂头蚴和成虫组织用异硫氢酸胍一步法提取总 RNA,用 DNA酶去除总 RNA中污染的 DNA。使用 T1 2 MA、T1 2 MC、T1 2 MG和 T1 2 MT4种锚定引物反转录合成 c DNA,再用 1种随机引物与上述 4种锚定引物在含同位素的反应液中进行 PCR反应。将 PCR产物用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 ,经放射自显影后 ,从凝胶上选出裂头蚴与成虫不同的差异带 ,PCR扩增后经杂交试验鉴定出不同种类的基因片段 ;以筛选出的差异带作探针 ,分别与裂头蚴和成虫 RNA进行 Northern杂交证实裂头蚴阶段表达基因 ;将差异带测序后与 Gen Bank中的序列进行同源性比较。　结果　从凝胶中共选出 11条差异带。将回收的 11条带再经PCR扩增和杂交试验 ,从中选出 3种不同的基因片段。经 Northern杂交证实片段 1和片段 2为裂头蚴特异表达基因 ,而片段 3为裂头蚴和成虫共同表达的基因。3个基因片段测序后与 Gen Bank中的基因进行同源性分析 ,基因片断 1和 2无同源序列 ;基因片段 3与多种生物的 2 8S r RNA同源。　结论　通过 m RNA差异显示技术查找出 2个裂头蚴阶段特异性表达基因片段     

曼氏迭宫绦虫裂头蚴可溶性蛋白质的分析

目的分析曼氏迭宫绦虫裂头蚴可溶性蛋白组分。方法提取曼氏迭宫绦虫裂头蚴总蛋白后,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和双向凝胶电泳(2-DE)进行分离,转膜后用感染裂头蚴小鼠的血清和健康小鼠血清作为一抗,行蛋白质印迹(Western blotting)分析,比较杂交蛋白点的差异。结果曼氏迭宫绦虫裂头蚴可溶性蛋白经SDS-PAGE分离出33条蛋白带,相对分子质量(Mr)范围在13800～145400,其中Mr26500、Mr37600、Mr88200和Mr130200为高丰度蛋白区带。经Western blotting分析,Mr31600和Mr37600条带为曼氏迭宫绦虫裂头蚴特异性蛋白条带,能被感染小鼠血清识别。裂头蚴总蛋白双向电泳凝胶的蛋白质斑点总数为367个,大部分分布在Mr18840～46800,246个蛋白质斑点的等电点为4.0～7.0,占总数的67%;Western blotting分析显示,30个抗原抗体结合点为特异性抗原斑点。结论曼氏迭宫绦虫裂头蚴可溶性蛋白有2条特异性蛋白带和30个特异性蛋白斑点,以偏酸性为主。     

三种蚤酯酶同工酶的比较分析

应用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳(PAGE)对印鼠客蚤、猫栉首蚤指名亚种和秃病蚤蒙冀亚种进行了酯酶同工酶的比较分析,结果发现蚤类酶谱存在差异,3种蚤约有20—22条迁移率不同的酶带。印鼠客蚤约显示14条带,主带5-6条;猫蚤显示9条带,主带4条:秃病蚤亦显示9条带;主带4—5条带。3种蚤间有共同的主带和次级酶带,亦有各自特异的标志酶带。吸血前后的雌、雄成虫酶谱基本一致,而成虫与幼虫间略有差异。所以酯酶同工酶酶谱的差异和特异性,是蚤类分类鉴定的一个分子遗传学指标。     

曼氏迭宫绦虫成虫及裂头蚴3种同工酶电泳分析

应用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(PAGE),对曼氏迭宫绦虫成虫及幼虫裂头蚴的乳酸脱氢酶同工酶、酯酶同工酶及苹果酸脱氢酶同工酶进行了分析测定。结果显示,成虫与幼虫的3种同工酶谱均有明显差别,反映出该绦虫在不同的发育时期,其代谢特点不同。     

旋毛虫不同发育阶段同工酶的电泳分析

目的 通过对旋毛虫不同发育阶段同工酶酶谱变化的研究，以探讨其生物发育过程中的一些规律。方法 应用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和UVP凝胶分析仪对猪型黑龙江株旋毛虫成虫，肌肉期幼虫和新生幼虫的酯酶同工酶时期的MDH，EST酶谱基本相似。LDH的酶谱虽均有1条带，但新生幼虫最深，肌肉期幼虫最浅，MUF酶谱新生幼虫最深，成虫较浅，肌肉期幼虫未见酶带，结论 旋毛虫发育过程中MDH，EST同工酶变化较小，但是LDH、MUF同工酶存在较大差异。     

旋毛虫不同发育阶段同工酶的电泳分析

目的　通过对旋毛虫不同发育阶段同工酶酶谱变化的研究 ,以探讨其生物发育过程中的一些规律。　方法　应用聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)和 UVP凝胶分析仪对猪型黑龙江株旋毛虫成虫、肌肉期幼虫和新生幼虫的酯酶同工酶(EST)、乳酸脱氢酶同工酶 (L DH)、苹果酸脱氢酶同工酶 (MDH)、延胡索酸酶同工酶 (MUF)进行分析。　结果　 3个发育时期的 MDH、EST酶谱基本相似 ;L DH的酶谱虽均有 1条带 ,但新生幼虫最深 ,肌肉期幼虫最浅 ;MUF酶谱新生幼虫最深 ,成虫较浅 ,肌肉期幼虫未见酶带。　结论　旋毛虫发育过程中 MDH、EST同工酶变化较小 ,但是 L DH、MUF同工酶存在较大差异     

广西、海南、云南微小按蚊3种同工酶谱比较研究

目的　探索我国微小按蚊复合体同工酶谱鉴别指标。　方法　选择广西微小按蚊 (A .m .G)、海南微小按蚊(A .m .H)和云南微小按蚊 (A .m .Y)的单雌线雌蚊匀浆 ,采用不连续性聚丙烯酰胺凝胶垂直板状电泳法分离 ,特异性底物染色 ,比较观察乳酸脱氢酶 (LDH)、醇脱氢酶 (ADH)和酯酶 (EST) 3种同工酶谱。　结果　三地微小按蚊的LDH同工酶谱相同 ,均具 1条Rm14酶带 ;ADH酶谱中三地微小按蚊均显一条酶带 ,A .m .G与A .m .H具相同酶带Rm 3 4,而A .m .Y则是 1条Rm 40酶带 ;EST的主带谱A .m .G与A .m .H基本相似 ,前者显示Rm18、3 5和 61,后者显示Rm18、3 5、5 9和 61。而A .m .Y明显不同于A .m .G和A .m .H ,显示Rm18、3 9、43、5 0、5 6和 5 9六条主带。　结论　ADH和EST同工酶谱在不同种的微小按蚊中存在明显差别 ,可能在区别我国微小按蚊姐妹种中有较大的应用价值。     

不同理化因素对曼氏裂头蚴感染性的影响

目的观察不同理化因素对曼氏裂头蚴感染性的影响。方法取含有裂头蚴的黑斑蛙肉(约1 cm3),分别经不同温度(-20℃、4℃、37℃和56℃)或不同乙醇浓度(20%、30%、40%、50%和60%)处理1、2或3 h,或经生姜汁、食用醋(总酸浓度4.5%,pH 3.05)或食用酱油(含19.3%NaCl)浸泡3、6、12或24 h,同时均设20℃生理盐水对照组。每种条件分别处理含30条裂头蚴的蛙肉,喂饲10只昆明小鼠(3条/只)。另将含20条裂头蚴的蛙肉机械匀浆处理3 min后平均喂饲10只小鼠。所有处理组喂饲1周后剖杀,计数阳性感染鼠数和小鼠体内的裂头蚴数。结果裂头蚴于-20℃处理2 h,无小鼠感染;56℃处理2 h或3 h后,所有小鼠均被感染,分别检获裂头蚴18和13条,具有感染性的裂头蚴所占比例分别为60%和43%,与对照组(均为90%,27/30)之间差异均有统计学意义(P<0.05)。裂头蚴于60%乙醇中浸泡2 h,无小鼠感染;60%乙醇中浸泡1 h,或者50%乙醇中浸泡2 h或3 h后,所有小鼠均被感染,分别检获裂头蚴18、17和15条,具有感染性的裂头蚴所占比例分别为60%、57%和50%,均显著低...     

曼氏裂头蚴排泄分泌物中特异性诊断抗原的研究

目的寻找曼氏裂头蚴排泄分泌(excretory-secretory,ES)物中的特异性诊断抗原。方法应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹(Western blot)对裂头蚴ES抗原中的蛋白组分进行分析及鉴定,并与可溶性抗原进行比较。结果 SDS-PAGE显示,裂头蚴可溶性抗原有19条蛋白带,分子质量单位分别为134、129、124、108、100、80、70、56、47、45、43、40、38、36、35、32、27、241、6 ku;ES抗原有7条蛋白带,分子质量单位分别为66、53、42、36、29、24、20 ku。Western blot表明,可溶性抗原中的362、4 ku蛋白组分可被裂头蚴感染小鼠及裂头蚴病患者血清识别,其他蛋白组分则无抗原活性,或与其他寄生虫感染小鼠或寄生虫病患者血清有交叉反应;ES抗原中的36 ku蛋白组分只可被裂头蚴感染小鼠及裂头蚴病患者血清识别,而不与旋毛虫、血吸虫、弓形虫感染小鼠及正常小鼠血清产生交叉反应,与囊尾蚴病、棘球蚴病、并殖吸虫病、华支睾吸虫病、日本血吸虫病患者血清及健康人血清亦无交叉反应。结论裂头蚴ES抗原中的36 ku蛋白组分为裂头蚴的特异性抗原,可用于裂头蚴病的血清学诊断和流行病学调查。     

曼氏裂头蚴病动物模型的建立及诊治技术研究 Ⅰ小鼠动物模型建立及感染后血清特异性IgG抗体变化

目的 建立曼氏裂头蚴感染小鼠动物模型,并观察感染后小鼠血常规及血清中特异性IgG抗体变化。方法 从青蛙体内检获曼氏裂头蚴,以口服灌胃法感染昆明小鼠25只（3条/只）。于感染前2 d和感染后第2、7、14、21、28、35、42、49天采集小鼠血液,检测血常规（白细胞总数、红细胞总数、血红蛋白、血小板总数）及血清中特异性IgG抗体（ELISA法）;于感染后第49天处死全部小鼠,解剖并仔细查找小鼠体内的曼氏裂头蚴。结果 小鼠感染曼氏裂头蚴后,白细胞总数在第2天明显升高;血清中特异性IgG抗体于感染后第14天开始检出,于第21天从全部小鼠检出。在小鼠多个组织器官检出曼氏裂头蚴,其中以皮下肌肉多见。结论 成功建立小鼠感染曼氏裂头蚴动物模型,该法造模简单、经济。白细胞及血清中特异性抗体检测可作为曼氏裂头蚴的辅助诊断方法。     

曼氏裂头蚴病动物模型的建立及诊治技术研究Ⅱ原尾蚴灌胃法建立曼氏裂头蚴病小鼠模型

目的　探索通过感染原尾蚴的剑水蚤灌胃小鼠建立曼氏裂头蚴病小鼠动物模型的可行性。方法　实验室条件下用曼氏裂头蚴感染家猫,收集当日新产猫粪,用去氯水淘洗后过滤获得曼氏迭宫绦虫虫卵,制成虫卵悬浊液。将20只C57BL/6j小鼠随机分为实验组和对照组,实验组15只、对照组5只。以曼氏迭宫绦虫钩球蚴感染野生剑水蚤,使每只剑水蚤体内含有3 ~ 5条原尾蚴;再将感染原尾蚴的剑水蚤灌胃实验组小鼠,每只小鼠灌入剑水蚤15只,对照组灌胃等体积去氯水。6个月后处死小鼠,分离疑似裂头蚴虫体,并用间接酶联免疫吸附试验检测小鼠血清中抗曼氏裂头蚴特异性IgG抗体水平。提取疑似虫体基因组DNA,以曼氏裂头蚴细胞色素C氧化酶1（CO1）基因片段为目的序列进行PCR扩增以鉴别疑似虫体。结果　实验组15只小鼠中,6只小鼠血清抗曼氏裂头蚴特异性IgG抗体检测呈阳性;于其中4只小鼠皮下发现并分离出乳白色虫体。每只小鼠均仅检出1条虫体,虫体形态与曼氏裂头蚴相似。基于CO1基因的疑似虫体PCR扩增产物在毛细管电泳上于151 bp处显示特异性条带,测序结果与已知曼氏裂头蚴序列100%符合。结论　本研究成功建立了一种曼氏裂头蚴病小鼠动物模型。     

Immunoelectrophoretic study on common antigens of S?o Louren?o da Mata and Belo Horizonte strains of Schistosoma mansoni adult worms and Biomphalaria snails.

Immunoelectrophoretic studies on common antigens were carried out by using rabbits sera immunized against S?o Louren?o da Mata and Belo Horizonte strains of Schistosoma mansoni adult worms and antigens of Biomphalaria glabrata pigmented (Jaboat?o--PE); B. glabrata albino (Belo Horizonte--MG) and B. straminea (S?o Louren?o da Mata, PE). Furthermore, the reverse approach was proceeded, namely, sera anti Biomphalaria snails produced in rabbits were tested against both strains of Schistosoma adult worm antigens. The analysis of the common antigens between the SLM strains of S. mansoni adult worm and B. glabrata pigmented showed 8 to 9 precipitin bands, 3 bands with B. glabrata albino and only 1 band with B. straminea crude extracts. On the other hand, the BH strain of S. mansoni adult worm antisera produced 6 to 7 bands with B. glabrata pigmented, 5 bands with B. glabrata albino and 1 band with B. straminea antigenic extract. Biomphalaria snails crude extracts were fractionated by Sephadex G-100 column and three fractions were collected from each snail strain. The fractions were tested with anti SLM and BH strains of S. mansoni adult worm sera by immunoelectrophoresis. The common antigens fractionated from Biomphalaria snails crude extracts and those found for both strains of S. mansoni adult worm mostly existed in the first fraction and they were estimated to have molecular weight over 158,000 daltons. In our laboratory, it was found a relationship between the antigenic similarities and experimental infection rates of S. mansoni towards Biomphalaria snails so that more bands were seen with increasing infection rates of S. mansoni.     

生食蝌蚪感染曼氏裂头蚴发病的发现与调查

目的通过调查研究,了解河南省漯河等地区居民因生食蝌蚪感染曼氏裂头蚴病的情况,为防治提供科学依据。方法①采用现场考察与问卷调查,了解河南省漯河等地区地理环境与居民传统生食蝌蚪情况。②调查方法:显微镜下检查剑水蚤原尾蚴;蛙用肉眼和解剖镜检;解剖镜下检查蝌蚪裂头蚴;收集猫、狗粪便,水洗沉淀镜检虫卵;对生食蝌蚪史者,作曼氏迭宫绦虫裂头蚴血清免疫学检测。结果漯河、周口、商丘3市农村,池塘、沟渠、洼地众多,气候环境适宜各种蛙类繁衍,且居民多有生食蝌蚪"清热降火"习俗;剑水蚤检查85只,发现感染蚤3只,感染率3.53;蝌蚪检查308只,发现感染者22只,感染率为7.14;蛙类检查44只,发现感染者25只,感染率为56.82。调查猫、犬34只,发现感染者7只,感染率为20.59。有生食蝌蚪史者,血清学阳性率为8.99(17/189);其中13人有明显临床症状,占76.47。结论证实漯河、周口、商丘市存在曼氏迭宫绦虫病流行区,其中漯河市为曼氏迭宫绦虫严重的自然疫源地;当地居民生食蝌蚪,是感染曼氏裂头蚴病的主要原因。     

小鼠感染曼氏裂头蚴后组织病理学改变动态观察

目的动态观察小鼠感染曼氏裂头蚴后的组织病理学改变,了解曼氏裂头蚴对组织的损害。方法从黑斑蛙体内检获曼氏裂头蚴,口服法以3条/只感染昆明小鼠,于感染后第2～10周分别处死小鼠进行组织病理学观察。结果在感染小鼠皮下、肌肉、腹腔等处发现裂头蚴,主要位于皮下肌肉组织。组织病理学观察：肉眼观察,寄生处的组织有弥漫性淤血斑点,囊包块形成;HE染色发现病变部位脂肪组织及横纹肌组织变性、坏死,纤维组织增生并包绕脂肪组织,少部分血管纤维素样坏死等。病变部位早期以中性粒细胞浸润为主的急性炎症,随着病程的进展,局部组织的损伤程度不断加重,炎症范围不断扩大,并出现以淋巴细胞为主的慢性炎症表现。结论小鼠感染曼氏裂头蚴后寄生于多组织器官,其中以皮下肌肉处多见。曼氏裂头蚴寄生处组织随病程进展出现不同程度的以急慢性炎症反应为主的病理损伤。     

2010—2018年湘西自治州曼氏裂头蚴感染情况调查

目的 了解湘西自治州人群和动物曼氏裂头蚴感染情况.方法 收集和分析2010—2018年湘西自治州疾控中心寄生虫病室曼氏裂头蚴IgG抗体检测病人的临床个案、治疗记录等资料,并对中间宿主和保虫宿主进行流行病学调查.结果 2010—2018年共检测677人,其中男性348人,阳性36人;女性329人,阳性20人,性别间阳性率...     

曼氏迭宫绦虫动物模型的建立和生活史观察

目的建立曼氏迭宫绦虫动物模型,观察其生活史。方法从感染蛇体内分离曼氏裂头蚴,感染终宿主（猫）和中间宿主（剑水蚤、蝌蚪）,以观察其从虫卵孵出幼虫、感染第一、二中间宿主剑水蚤、蝌蚪和终宿主猫的生活史过程。结果感染猫12d后粪检发现虫卵,经解剖猫获得成虫、虫卵;虫卵在室温培养12d孵出钩球蚴,感染剑水蚤6d后发育为原尾蚴;感染蝌蚪后第28d发现裂头蚴。结论成功建立曼氏迭宫绦虫动物模型,裂头蚴在猫体内成熟时间仅12d。     

广西10例人芽囊原虫基因型和同工酶谱的研究

目的分析广西10个人芽囊原虫(Blastocystis hominis)分离株基因型,及其乳酸脱氢酶(LDH)和酯酶(EST)的同工酶谱特征。方法从感染者粪便中分离到的10个人芽囊原虫(BhGX1～BhGX10),体外培养并提取基因组DNA。用已知的7对特异性序列标记位点(sequene tagged sites,STS)引物PCR扩增,来鉴定基因型。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),分别进行乳酸脱氢酶和酯酶2种同工酶染色,比较分析10个分离株的酶谱。结果 10个人芽囊原虫分离株中有8个为基因Ⅰ型;另外2个分离株(BhGX4和BhGX7)经7对引物扩增均为阴性,为未知基因型。10个人芽囊原虫分离株在LDH谱中共出现10条酶带,常见酶带为Rm37、Rm49、Rm57、Rm68和Rm92;在EST谱中共出现12条酶带,其中Rm14、Rm18、Rm23、Rm27、Rm45、Rm50和Rm77酶带较常见。各分离株之间的LDH和EST同工酶谱均存在差异。结论广西10个人芽囊原虫分离株以基因Ⅰ型为主,但各分离株之间的LDH和EST同工酶谱存在差异。     

曼氏裂头蚴cDNA文库的构建及诊断候选抗原筛选

目的　构建曼氏裂头蚴cDNA文库,通过免疫筛选获得曼氏裂头蚴病诊断候选抗原基因。方法　提取曼氏裂头蚴虫体总RNA,反转录合成cDNA,连接噬菌体载体,经体外包装后构建曼氏裂头蚴SMART cDNA文库。用曼氏裂头蚴病患者血清免疫筛选cDNA文库,获得阳性克隆,测定阳性克隆插入片段的DNA序列,进行同源性分析并预测编码蛋白的结构和功能。结果　成功构建了曼氏裂头蚴cDNA文库,文库滴度为6.25 × 106 pfu/mL,重组率为100%,文库插入片段的平均长度大于1 100 bp。经免疫筛选获得12个阳性克隆,分为Sm⁃Ⅰ、Sm⁃Ⅱ、Sm⁃Ⅲ和Sm⁃Ⅳ4类,其代表克隆为Sm60⁃1、Sm58⁃1、Sm20⁃1、Sm22⁃3,插入片段长度分别为1 134、1 063、883、969 bp,编码蛋白分别与欧猥迭宫绦虫抗原多肽、胞质抗原、核糖体蛋白S4样蛋白和未命名蛋白具有较高同源性。结论　成功构建了曼氏裂头蚴SMART cDNA文库,获得了4类阳性克隆,为曼氏裂头蚴病诊断抗原的进一步研究奠定了基础。