PPARγ激动剂抑制脂多糖诱导肾小管上皮细胞分泌趋化因子及机制

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂15d-PGJ2对脂多糖(LPS)诱导的趋化因子表达的影响及可能机制。方法:用15d-PGJ2(5μM)预处理人近端肾小管上皮细胞2h后加入LPS(1μg/ml),与LPS组、15d-PGJ2组及未加任何刺激组进行比较。用Real-time PCR方法检测IL-8和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)mRNA表达水平;用ELISA法检测细胞上清中IL-8和MCP-1蛋白水平;通过RNAi技术沉默肾小管上皮细胞PPARγ,观察15d-PGJ2的作用是否依赖于PPARγ;用间接免疫荧光法观察NF-κB在细胞内的定位;用Western blot法检测胞质中IκB的磷酸化水平。结果:在HK-2细胞中,与对照组相比,LPS刺激4h使IL-8 mRNA及蛋白分别升高(5.67±1.83)和(1.62±0.12)倍,使MCP-1 mRNA及蛋白分别升高(5.24±1.33)和(2.25±0.40)倍,且胞质中IκBα磷酸化水平明显增加(P0.05)。与LPS组相比,15d-PGJ2+LPS组,IL-8和MCP-1表达在mRNA水平分别下降74.23%和79.42%,在蛋白水平分别下降69.03%和49.44%,差异有统计学意义;在PPARγ沉默的HK-2细胞中,与LPS刺激组相比,15d-PGJ2使IL-8和MCP-1表达在mRNA水平分别下降59.21%和44.08%,在蛋白水平分别下降47.11%和39.40%(均P0.05),并明显抑制LPS诱导NF-κB核易位,下调IκBα磷酸化水平。结论:15d-PGJ2可抑制LPS诱导的趋化因子表达,且不完全依赖于PPARγ,可能与抑制IκBα磷酸化有关。     

Toll样受体2对人主动脉瓣间质细胞炎症反应的调控作用

目的探讨Toll样受体(TLR2)调控Notch1信号通路对人主动脉瓣间质细胞炎症反应的作用。方法从正常主动脉瓣组织及主动脉瓣狭窄病人的主动脉瓣组织中分离出主动脉瓣间质细胞,酶联免疫吸附(ELISA)检测200 ng/ml的TLR2激活物脂多糖(LPS)干预细胞24 h后白细胞介素(IL)-6、巨细胞趋化因子(MCP)-1和细胞间黏附因子(ICAM)-1浓度;Western印迹检测200 ng/ml的LPS干预细胞2、4、8、12 h后NICD1蛋白表达,ELISA检测Jagged1浓度;60 nmol/L的人Notch1特异性siRNA沉默Notch1及200 ng/ml的LPS刺激细胞24 h后,Western印迹检测NICD1及ICAM-1蛋白表达;5μg/ml的Jagged1及200 ng/ml的LPS处理细胞,ELISA检测IL-6、MCP-1和ICAM-1浓度。结果正常主动脉瓣组织及主动脉狭窄病人瓣膜组织的主动脉瓣间质细胞经LPS刺激后IL-6、MCP-1和VCAM-1的浓度均显著高于无LPS刺激组,主动脉狭窄病人瓣膜组织的主动脉瓣间质细胞中IL-6、MCP-1和VCAM-1的浓度均显著高于正常组(P<0.01);LPS刺激能诱导NICD1的生成及增加,具有时间依赖性,且主动脉狭窄病人瓣膜组织的主动脉瓣膜间质细胞中NICD1生成量多于正常组;主动脉狭窄病人瓣膜组织的主动脉瓣膜间质细胞中Jagged1浓度显著高于正常组,且随着时间延长增加;沉默Notch1信号通路能减弱NICD1的蛋白表达,且能减少炎症因子ICAM-1的蛋白表达;Jagged1激活Notch信号通路能诱导产生低水平的IL-6、MCP-1、ICAM-1,而能明显增强TLR2诱导的IL-6、MCP-1、ICAM-1的水平。结论 TLR2能诱导人主动脉瓣间质细胞的炎症反应及活化Notch1信号通路,主动脉瓣狭窄的主动脉瓣组织间质细胞炎症反应更明显,沉默Notch1信号通路可减弱TLR2诱导的炎症反应,激活Notch信号通路则增强TLR2诱导的炎症反应。     

NF-κB"诱骗"寡核苷酸对结肠癌SW480细胞IL-8表达的影响

目的 探讨核转录因子κB (NF-κB)"诱骗(decoy)"寡核苷酸(ODNs)对结肠癌SW480细胞IL-8表达的影响.方法 体外培养SW480细胞,LPS(10 μg/L )刺激3 h后,用脂质体lipofectin2000介导NF-κB decoy ODNs转染 6 h,ELISA法检测上清液中IL-8,RT-PCR检测细胞IL-8 mRNA,并设对照组、LPS组、SODN组、lipofectin2000组.结果 转染NF-κB decoy ODNs细胞的 IL-8 mRNA和IL-8的表达高于对照组(P<0.01),但明显低于其他组(P<0.01). 结论 NF-κB decoy ODNs明显抑制SW480细胞IL-8的表达.     

RAW264.7细胞M1/M2亚型的诱导和鉴定

目的诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7分化为M1/M2亚型,并分别根据其标志物的表达情况进行鉴定。方法干预前一天以105个/ml密度铺好细胞,用不同浓度的IFN-γ+LPS干预,刺激分化为M1亚型;用不同浓度IL-4干预,刺激分化为M2亚型。分别于干预后12h提取细胞的总RNA。用realtime PCR方法对M1/M2亚型的标志物iNOS,CD86/MR(CD206),I型精氨酸酶(ArginaseI,Arg-I)进行mRNA水平表达量的鉴定,最终选择最合适的刺激浓度进行后续试验。结果 (1).不同浓度干预试剂刺激12h后,大剂量干预组RAW264.7的细胞状态差,死亡细胞数多,中小剂量组细胞状态良好,完全贴壁,但细胞的形态发生改变;(2).2.5ng/ml IFN-γ+200ng/ml LPS共同作用12h后,RAW264.7的iNOS和CD86表达量最高,较基础水平有明显差异;(3).10ng/ml IL-4作用12h后,RAW264.7的MR(CD206)和ArgI的表达量最高,较基础水平有明显差异。结论用适当浓度的IFN-γ+LPS/IL-4刺激RAW264.7细胞12h,可使其分化为M1/M2亚型。     

锌离子螯合剂对脂多糖诱导的小胶质细胞中细胞因子表达的影响

目的研究锌离子螯合剂四吡啶甲基乙二胺(TPEN)对脂多糖(LPS)诱导的小胶质细胞中细胞因子表达的影响及机制。方法体外培养小鼠小胶质瘤细胞系小胶质细胞后分为对照组、LPS组(100 ng/ml LPS,30 min或4h)、TPEN+LPS组(25μmol/L TPEN,1 h+LPS,30 min或4 h)、细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂PD98059+LPS组(PD98059+LPS组,25μmol/L PD98059,30 min+LPS,4 h),采用实时定量PCR法分析细胞因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6、TNF-αmRNA的表达,Western blot法检测pERK1/2蛋白的表达。结果与对照组比较,LPS组pERK1/2蛋白表达和IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达明显升高(P<0.05,P<0.01);与LPS组比较,TPEN+LPS组pERK1/2蛋白表达和IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01),而PD98059+LPS组IL-1β、IL一6、TNF-αmRNA表达明显降低(P<0.01)。结论 TPEN可能通过减少pERK1/2表达来抑制LPS诱导的细胞因子的大量释放。     

红景天苷对内毒素诱导的RAW264.7细胞损伤拮抗作用的研究

目的:观察不同浓度的红景天苷（SDS）对内毒素（LPS）引起的巨噬细胞RAW264.7损伤的拮抗作用,并初步探讨其作用机制。方法: 将小鼠巨噬细胞RAW264.7随机分为正常对照组（A组）、LPS组(B组)、SDS (5 μg/ml)对照组（C组）、SDS(5 μg/ml)+LPS组（D组）、SDS(10 μg/ml) 对照组（E组）、SDS(10 μg/ml)+LPS组(F组)、SDS(20 μg/ml) 对照组(G组)和SDS(20 μg/ml)+LPS组(H组)。选取对数生长期的细胞,相继用SDS（0~20 μg/ml）预处理1 h及1 μg/ml LPS刺激24 h后,收集细胞,用MTT比色法检测细胞的活力。6 h后收集细胞用Western blot检测细胞中NF-κB的含量,用ELISA法检测细胞上清中TNF-α、IL-6和IL-10的含量,同时用光密度法检测细胞上清中LDH的含量。结果: LPS可显著降低细胞的活力（P<0.05,P<0.01）,增加NF-κB的表达（P<0.01）,并显著增加细胞上清中TNF-α、IL-6、IL-10和LDH的含量（P<0.05,P<0.01）。而SDS则可以浓度依赖的方式对抗LPS所致细胞活力的减低、NF-κB含量的增加,使TNF-α、IL-6和LDH的含量明显减少,IL-10的含量明显增加;但不同浓度的SDS对正常细胞的上述指标没有影响。结论: SDS对LPS引起的细胞损伤具有对抗作用,其作用可能与其抑制炎症介质的释放有关。     

IL-22对人气道细胞的作用

目的 探讨IL-22对人气道上皮细胞、气道平滑肌细胞、气道成纤维细胞的生理学作用.方法 用实时定量PCR 检测气道上皮细胞、气道平滑肌细胞、气道成纤维细胞哮喘血清刺激前后IL-22R1 mRNA表达的变化.不同浓度的IL-22(10 ng/ml,100 ng/ml,1 000 ng/ml)刺激气道上皮细胞、气道平滑肌细胞和气道成纤维细胞后,用MTT法检测细胞的增殖,用流式细胞技术(FACS)检测细胞的凋亡和坏死.结果 哮喘血清刺激后气道上皮细胞IL-22R1 mRNA表达降至正常对照组的9%,气道平滑肌细胞IL-22R1 mRNA表达升高至正常对照组的345倍,而气道成纤维细胞IL-22R1 mRNA表达无明显变化.高剂量(1 000 ng/ml)的IL-22刺激气道上皮细胞和气道成纤维细胞12、24 h可显著降低细胞增殖(P<0.05,P<0.01).三种不同浓度的IL-22刺激气道上皮细胞24 h后均导致细胞凋亡显著下降(P<0.05),低浓度的IL-22(10 ng/ml)导致细胞坏死增加(P<0.01).不同浓度的IL-22刺激气道平滑肌细胞后,细胞凋亡和坏死无显著性变化.中、高浓度IL-22(100 ng/ml,1 000 ng/ml)刺激气道成纤维细胞后,细胞坏死率显著下降(P<0.05).结论 IL-22在支气管哮喘中对气道上皮的作用具有双重性,并与支气管哮喘的病程相关;而对气道平滑肌细胞的作用则可能与浓度及病程相关.支气管哮喘后续阶段,IL-22对气道成纤维细胞作用轻微.     

LPS对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞炎症因子表达的影响——对建立支架内再狭窄炎症细胞模型的探索

目的探索LPS作用不同时间对体外培养的人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)炎症因子表达的影响,为支架置入术后再狭窄炎症细胞活化模型的建立提供实验数据支持。方法体外培养的HCASMC 3~5代,接种于6孔细胞培养板,用不同浓度(0.01,0.1,0.5,1.0,10)μg/ml的LPS作用不同时间(6 h,24 h,48 h),通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清液中炎症因子白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)以及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达变化。结果对照组只有少量的IL-1β分泌。加入不同浓度LPS刺激后,与对照组比较,干预6 h的各LPS浓度组IL-1β表达量无明显变化,差异无统计学意义(P均0.05)。而干预24 h或48 h的各LPS浓度组与对照组相比IL-1β表达量明显增加,差异有统计学意义(P均0.05)。对照组有少量IL-6分泌。加入不同浓度LPS刺激后,与对照组比较,0.5μg/ml浓度组LPS干预6 h、24 h、48 h均可显著诱导IL-6的表达增加,1μg/ml浓度组则在24 h、48 h刺激条件下表达增加,差异有统计学意义(P均0.05)。对照组有少量TNF-α的分泌,加入LPS干预后,TNF-α的变化趋势与IL-6相一致。结论 0.5μg/ml和1μg/ml浓度的LPS刺激24 h或48 h使HCASMC的IL-6、IL-1β和TNF-α表达增加,可作为构建HCASMC炎症活化模型的参考。     

1-磷酸鞘胺醇受体3参与巨噬细胞迁移及脓毒症诱导的心肌损伤

目的探讨巨噬细胞中1-磷酸鞘胺醇受体(sphingosine 1-phosphate receptor,S1PR)的表达及其作用,观察干预S1PR3(S1P3)对脂多糖诱导的心肌损伤的影响。方法传代培养小鼠Ana-1巨噬细胞,给予脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,100 ng/ml)刺激或S1P3特异性抑制剂CAY-10444(10μmol/L)干预,细胞随机分为对照组、LPS组、CAY-10444组、CAY-10444预处理2h+LPS组,Transwell小室观测巨噬细胞迁移,蛋白免疫印迹检测巨噬细胞S1PR的表达,并检测p-Akt/Akt蛋白水平。在体实验,6~8周龄雄性C57/B6小鼠,随机分为对照组、LPS组、CAY-10444组、CAY-10444干预+LPS组,每组12只,LPS(10 mg/kg)腹腔注射,或CAY-10444 1 mg/kg于LPS诱导后30 min腹腔注射干预,24 h后取心脏组织HE染色观察病理改变,免疫组化染色观察巨噬细胞浸润程度以及炎症因子的表达情况,实时荧光定量PCR检测心肌损伤标记分子BNP、巨噬细胞表面分子F4/80、炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平。结果与对照组比较,LPS诱导巨噬细胞大量迁移S1P3蛋白表达增加(P0.01),p-Akt Ser473/Akt表达上调(P0.01);与LPS组相比,S1P3抑制剂CAY-10444干预后再给予LPS刺激,巨噬细胞迁移被抑制(P0.01),p-Akt Ser473/Akt表达也降低(P0.01);在体实验,LPS诱导小鼠后BNP mRNA水平明显上调(P0.01),同时F4/80以及炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平上调(P0.01),HE染色可见心肌损伤及炎细胞浸润,免疫组化染色法显示F4/80及炎症因子的大量阳性表达(P0.01);使用S1P3抑制剂后,与LPS组比较,心肌损伤减轻免疫组化中巨噬细胞减少(P0.01),炎症因子表达降低(P0.01),BNP mRNA水平降低(P0.01),F4/80以及TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平也明显降低(P0.01)。结论抑制巨噬细胞S1P3表达可抑制巨噬细胞的迁移并提示p-Akt/Akt与了这一过程,此外,S1P3抑制剂的干预可有效减轻LPS诱导的心肌损伤。     

大黄酸对人肾小管上皮细胞血小板反应蛋白1和转化生长因子β1表达的影响

目的:探讨大黄酸对人肾小管上皮细胞(HK-2)血小板反应蛋白1(TSP-1)和转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响。方法:体外培养HK-2细胞,观察AngⅡ(1×10-7mol/L)诱导下低、中和高浓度的大黄酸(10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml)对HK-2TSP-1、TGF-β1的mRNA和蛋白表达的影响。采用Real Time PCR检测细胞TSP-1、TGF-β1mRNA表达,采用Westernb lot检测TSP-1、TGF-β1蛋白表达。培养上清液中TGF-β1和活性TGF-β1检测采用ELISA法。结果:与空白对照组比较,AngⅡ(1×10-7mol/L)明显上调了HK-2TSP-1的mRNA表达(3.84±0.48vs1.32±0.19;P<0.05)、伴有TGF-β1的mRNA表达增加(3.68±0.46vs1.18±0.13;P<0.05)。同时AngⅡ(1×10-7mol/L)也上调TSP-1蛋白表达(0.5246±0.0936 vs 0.1015±0.0768;P<0.01),伴有TGF-β1蛋白表达的增加(0.5948±0.0624 vs 0.1264±0.0811;P<0.01)。与AngⅡ阳性对照组比较,中浓度和高浓度大黄酸明显抑制了AngⅡ(1×10-7mol/L)诱导的TSP-1、TGF-β1的mRNA(P<0.05,P<0.01)和蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。中浓度大黄酸干预组总的TGF-β1含量和活性TGF-β1含量均减少,(P<0.05);高浓度大黄酸干预组总的TGF-β1含量和活性TGF-β1含量均明显减少(P<0.01)。结论:大黄酸能抑制人肾小管上皮细胞TSP-1、TGF-β1的mRNA和蛋白表达,抑制TGF-β分泌。