成年大鼠嗅鞘细胞的原代培养与鉴定

目的 探索一种简便、经济实用的获得成年大鼠嗅鞘细胞的方法.方法 无菌条件下取2.5月龄的SD大鼠嗅球最外二层,经分散后将细胞种植于含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基中.采用差速贴壁和阿糖胞苷抑制相结合的方法培养.定期进行形态学观察并摄片.在培养第14 d行胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和神经生长因子受体(NGFRp75)的免疫细胞化学染色鉴定,并计算嗅鞘细胞的纯度.结果 培养的嗅鞘细胞呈双极、多突起形、扁圆形三种,其中扁圆形较少,嗅鞘细胞的纯度在90%以上.结论 差速贴壁和阿糖胞苷化学抑制相结合进行成年大鼠嗅鞘细胞原代培养是一种简便经济实用的方法,可获得高纯度的嗅鞘细胞.     

人胚嗅粘膜嗅鞘细胞的分离、培养和纯化

目的 采用经我们改良的差速贴壁法结合神经营养因子3(NT3)和低浓度血清的培养方法对人胚嗅粘膜嗅鞘细胞进行分离和原代纯化培养,探讨建立嗅粘膜嗅鞘细胞体外培养的方法.方法 对差速贴壁后的人胚嗅粘膜嗅鞘细胞交替应用含10%胎牛血清和含2.5%胎牛血清、NT3的DMEM-F12培养基进行原代培养.观察嗅粘膜嗅鞘细胞的形态学变化.采用p75NTR和GFAP免疫细胞化学染色进行鉴定和纯度检测.结果 人胚嗅粘膜嗅鞘细胞形态多呈双极、三极,伴有细长的突起.p75NTR和GFAP染色均呈阳性反应,体外培养9 d时纯度可达83%.结论 差速贴壁法结合低浓度血清和NT3应用可以分离培养出人胚嗅粘膜嗅鞘细胞.     

人胚嗅粘膜嗅鞘细胞的分禽、培养和纯化

目的采用经我们改良的差速贴壁法结合神经营养因子3（NT3）和低浓度血清的培养方法对人胚嗅粘膜嗅鞘细胞进行分离和原代纯化培养，探讨建立嗅粘膜嗅鞘细胞体外培养的方法。方法对差速贴壁后的人胚嗅粘膜嗅鞘细胞交替应用含10％胎牛血清和含2．5％胎牛血清、NT3的DMEM—F12培养基进行原代培养。观察嗅粘膜嗅鞘细胞的形态学变化．采用p75^NTR和GFAP免疫细胞化学染色进行鉴定和纯度检测。结果人胚嗅粘膜嗅鞘细胞形态多呈双极、三极，伴有细长的突起。p75^NTR和GFAP染色均呈阳性反应，体外培养9d时纯度可达83％。结论差速贴壁法结合低浓度血清和NT3应用可以分离培养出人胚嗅粘膜嗅鞘细胞。     

新生大鼠嗅鞘细胞的原代培养及形态学观察

目的探讨新生大鼠嗅鞘细胞的原代培养及纯化方法，并对其形态学特征进行观察。方法分离培养新生大鼠嗅球中的嗅鞘细胞，联合应用差速贴壁法和阿糖胞苷抑制法进行纯化，NGFRp^75免疫组化染色鉴定细胞。结果可获得较高纯度的嗅鞘细胞，其形态主要为双极、多极和无突起的“油煎蛋”形，细胞突起细长并交织成网状。结论该方法步骤简便，可重复性好，具有较高的实用价值。     

不同纯化方法体外培养人胚嗅球嗅鞘细胞

目的 采用不同纯化方法原代培养人胚嗅球嗅鞘细胞(OECs),探讨简单实用可获得高纯度人胚嗅球OECs的体外培养方法.方法 以差速贴壁法为基础结合阿糖胞苷法、无血清饥饿法和问断神经营养因子3(NT3)法纯化培养人胚嗅球OECs.观察不同纯化方法下OECs生长变化,采用免疫细胞化学染色进行纯度鉴定.结果 体外培养的人胚嗅球OECs为双极、三极细胞.细胞突起细长,并可形成细胞突起网络.差速贴壁法培养3～6 d时纯度约为88%,以后成纤维细胞增殖,OECs纯度迅速下降.无血清饥饿法培养3～6 d时OECs纯度约为90%,但细胞状态差.间断NT3法培养3～9 d时OECs纯度约为95%,且细胞状态良好.经统计学处理,第6 d后差速贴壁 间断应用NT2法优于其他方法,细胞纯度的差异有统计学意义(P<0.05).结论 差速贴壁结合同断NT3法可获得高纯度状态良好的OECs,是一种简单实用的OECs纯化培养方法 .     

成年大鼠嗅球嗅鞘细胞的分离、培养、纯化与生物学特性的研究

目的探讨成年大鼠嗅球嗅鞘细胞（OECs）的分离、培养和纯化方法,并观察其形态学变化及免疫细胞化学特性。方法采用原代培养技术,从成年大鼠的嗅球分离培养OECs,用差速贴壁＋Thy1.1抗体及补体等方法纯化培养OECs,并用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）扩增OECs,倒置相差显微镜下观察OECs的形态变化特点及生长情况,采用GFAP、NGFRp75、S100等抗体行免疫细胞化学染色,根据NGFRp75免疫细胞化学染色结果统计培养的OECs的纯度,并计算OECs的增殖率。结果体外培养的成年大鼠OECs主要为双极或三极细胞,其突起细长。差速贴壁＋Thy1.1抗体及补体纯化法的纯化效率高于其他两种。免疫细胞化学染色显示,培养的成年大鼠OECs呈现GFAP、NGFRp75、S100蛋白染色阳性。bFGF能明显促进OECs的增殖（P〈0.01）,对OECs的形态、纯度没有明显影响。结论差速贴壁＋Thy1.1抗体及补体纯化法是一种高效率的纯化培养OECs的方法,bFGF能明显促进OECs的增殖。     

嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑出血的实验研究

目的：嗅鞘细胞移植入大鼠脑出血模型后,观察偏瘫大鼠功能恢复以及移植细胞后30 d内的形态学变化。方法：差速贴壁法培养出高纯度的嗅鞘细胞,制作38只大鼠脑出血模型,分三组：第1组10只为空白组,第2组10只为HBSS移植组,第3组18只为嗅鞘细胞移植组;三组大鼠分别在术后3 d、7 d、14 d和30 d用forelimb placing方法进行评分,判断嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑出血模型的作用。结果：hoechst示踪及电镜观察结果,均证实嗅鞘细胞能在大鼠体内存活;对三组大鼠进行评分,嗅鞘细胞移植组的功能恢复明显优于其他两组。结论：从成年大鼠嗅黏膜用差速贴壁法能成功培养出嗅鞘细胞,并用于细胞移植,移植细胞能存活;嗅鞘细胞移植能改善大鼠脑出血后偏瘫肢体的功能。     

大鼠嗅鞘细胞的纯化及活性检测

目的采用改良差速贴壁联合胰酶限时消化法纯化大鼠嗅鞘细胞,并检测嗅鞘细胞的生物活性。方法分离新生7d的SD大鼠嗅球嗅鞘细胞,分组后采用改良的6h和18h两次差速贴壁法联合不同时段（1、3和5min）胰酶消化法纯化培养,观察不同时段纯化的嗅鞘细胞的形态特点及生长情况;应用FITC标记的神经生长因子受体p75抗体（兔抗鼠NGFRp75抗体）检测嗅鞘细胞并评估细胞纯度;应用CCK-8法和酶联免疫吸附法分别检测嗅鞘细胞在纯化后3～15d的增殖活性和分泌脑源性神经营养因子的含量。结果随着细胞的生长,梭形的嗅鞘细胞逐渐增多;改良差速贴壁联合胰酶限时消化1min、3min、5min法所得嗅鞘细胞纯度分别为（57.52±2.13）%、（78.95±2.60）%、（49.01±0.74）%,3min组最明显,组间两两比较差异有统计学意义（P〈0.05）;改良差速贴壁法联合胰酶限时消化1min、3min、5min法所得嗅鞘细胞在纯化后7、9、11d时增殖的细胞数目和脑源性神经营养因子分泌量显示3min组最优,组间比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论改良差速贴壁（6h＋18h）联合胰酶限时消化3min的纯化方法能获得较高纯度的嗅鞘细胞。     

嗅内衬细胞的培养

目的 :探索一种简单的培养纯化嗅内衬细胞的方法。方法 :取新生 2 0 d的大鼠嗅球表层 ,以阿糖胞苷和牛垂体提取液分别作用 ,应用差速贴壁分选方法纯化培养细胞 ,以P75NGFR抗体鉴定。结果 :取得了较高纯度的嗅内衬细胞。结论 :应用阿糖胞苷和牛垂体提取液 ,联合差速贴壁分选法是有效可行的获取高纯度嗅内衬细胞的方法。     

OECs无血清上清液体外诱导UB-MSCs向神经细胞分化

目的:观察大鼠嗅鞘细胞无血清上清液诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化的作用。方法:采用差速贴壁联合阿糖胞苷抑制法获得较高纯度的嗅鞘细胞,在最佳状态细胞无血清培养后取上清液。收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,采用差速贴壁法纯化间充质干细胞,传第三代后用上述收集的嗅鞘细胞无血清上清液诱导,观察诱导分化过程,免疫组化鉴定分化结果。结果:用差速贴壁和阿糖胞苷抑制法可获得纯度高达95%的嗅鞘细胞,使用无血清嗅鞘细胞上清液培养脐血间充质干细胞后,发现能诱导脐血间充质干细胞向神经细胞形态分化,胞体呈椭圆形,伸出长突起。诱导7天后相差显微镜下可观察到神经干细胞、神经元和胶质细胞形态的细胞,与NSE、GFAP细胞免疫组化结果一致。结论:大鼠嗅鞘细胞无血清上清液有明显诱导脐血间充质干细胞分化为神经细胞的作用。     

大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的分裂增殖和免疫细胞化学特性

目的:体外培养大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞(olfactoryensheathingcells,OECs),观察其形态、分裂增殖和免疫细胞化学特性,探索自体嗅黏膜嗅鞘细胞作为OECs来源的可能性。方法:采用差时贴壁的方法分离培养成年大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞,相差显微镜下观察细胞形态和分裂增殖;用免疫组化方法观察GFAP、NGFRp75、S鄄100、NGF、BDNF、NT鄄3的表达。结果:培养的细胞根据形态来分,可分为双极、多极和偏平状;细胞分裂时先回缩成球形,分裂成两个子球,再伸出突起,变成梭形或多极形。GFAP、NGFRp75、S鄄100、BDNF和NT鄄3表达阳性。结论:在含血清培养基上,大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞能正常分裂增殖和分泌神经营养因子。     

嗅鞘细胞培养上清胶质源性神经生长因子含量的测定

目的观察嗅鞘细胞培养上清胶质源性神经生长因子(GDNF)的含量随培养时间的变化关系，为选择嗅鞘细胞移植的最佳时间提供理论依据。方法采用差速贴壁纯化培养方法培养嗅球及嗅粘膜嗅鞘细胞，培养21天，3天留取标本一次，采用ELISA法对上清GDNF进行测定。结果GDNF的含量随培养时间的延长逐渐升高，但绝对含量很低。结论培养的嗅鞘细胞能分泌GDNF，细胞移植在14天以后为宜。     

嗅粘膜源性嗅鞘细胞移植联合NGF对脊髓损伤的修复

目的：探讨大鼠嗅粘膜嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells， OECs）移植联合神经生长因子(nerve growth factor， NGF)修复脊髓急性损伤的可行性和疗效，并观察二者的协同作用。方法：自成年Wistar大鼠嗅粘膜取材，采用差速贴壁和阿糖胞苷抑制纯化相结合的方法培养纯化嗅鞘细胞。建立大鼠脊髓半切模型，并随机分成对照组（A组），OECs组（B组）和OECs＋NGF组（C组），在不同时段进行肢体活动的BBB评分。8周后取脊髓标本进行组织学检查，评价对脊髓损伤的修复作用。结果：B组和C组2周后BBB评分高于A组（P＜0.05），C组自4周后明显优于A组和B组（P＜0.01）。组织学检查表明，C组可明显促进轴突再生。结论:OECs联合NGF具有良好的脊髓损伤修复作用，且二者具有明显的协同作用。     

低氧诱导的大鼠嗅黏膜来源嗅鞘细胞自噬及其对细胞增殖能力的影响

目的: 探讨低氧诱导SD新生鼠嗅黏膜来源嗅鞘细胞(OECs)自噬的发生,分析自噬对细胞增殖能力的影响。方法: 采用酶消化法和改良的Nash差速贴壁法分离提纯培养SD新生鼠嗅黏膜来源OECs,利用免疫荧光法鉴定细胞属性和纯度。以低氧条件(氧浓度为2％)培养的SD新生鼠嗅黏膜来源OECs作为低氧处理组,以正常条件下培养的OECs作为对照组,采用自噬抑制剂3-MA处理后的OECs继续在低氧条件下培养作为3-MA低氧处理组。相差显微镜下观察各组细胞形态;Western blotting法检测对照组、4h低氧处理组和8h低氧处理组OECs中低氧诱导因子1α(HIF-1α)、自噬标志蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ和自噬标志基因Beclin-1的蛋白表达水平;采用CCK-8法检测对照组、3-MA低氧处理组、低氧处理组和3-MA低氧处理组OECs的增殖能力。结果: 在对照组、低氧处理组和3-MA低氧处理组经分离提纯的OECs均呈梭形,表现为典型的双极、三极细胞形态,3组间无明显差异。OECs呈NGFRp75和GFAP阳性,纯度为87%;与对照组比较,低氧处理组OECs中HIF-1α表达水平升高(P<0.05),LC3Ⅰ/Ⅱ和Beclin-1表达水平升高(P<0.05);与低氧处理组比较,3-MA低氧处理组OECs增殖能力降低。结论: 低氧诱导的自噬可降低SD新生鼠嗅黏膜来源OECs的增殖能力。     

Culture and purification of human fetal olfactory ensheathing cells using different attachment rates combined with intermittent NT3 nutrition

Objective：To explore a simple and pragmatic method to obtain sufficient olfactory ensheathing cells from human fetus by selective attachment of harvested cells combined with intermittent NT3 nutrition. Methods：DMEM/F12 culture solution including 10% fetal bovine serum or NT3 was used to culture olfactory ensheathing cells intermittently every 48 h. The cell state and growth rates of OECs were observed, and P75 staining was used to estimate the purity of the cells. Results：Human fetal OECs were positive with P75 immunocytochemical staining. OECs in dipolar or tripolar shape formed networks by their processes in vitro. The purity of OECs in ＂good state＂ was about 95% at 9 d and 83% on 12 d, respectively. Conclusion：The method of using different attachment rates combined with intermittent NT3 addition is a simple and effective way to culture and purify OECs.     

大鼠嗅球成鞘细胞的分离、培养与鉴定

目的：探讨大鼠嗅球成鞘细胞（Olfactory cnsheating cells,OECs）分离与培养的方法。方法：无菌条件下嗅球置于少量人工脑脊液中，用眼科镊子直接将嗅球撕烂、挤压，得片状组织块，胰酶消化，吹打，细胞悬液进行培养。结果：本方法分离、培养的OECs具有双极或多极突起，且突起十分细长，神经生长因子受体和胶质纤维酸性蛋白免疫组化呈阳性。结论：该方法简便易行，为深入研究OECs神经生物学特性、阐明促进中枢神经元轴突生长的作用机制打下基础。     

低氧微环境促进嗅黏膜间充质干细胞向神经元分化及其相关机制

目的：研究低氧微环境下利用嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)上清液诱导嗅黏膜间充质干细 胞(olfactory mucosa mesenchymal stem cells，OM-MSCs)更多地向神经元分化及其相关的机制。方法：分离培养OECs和 OM-MSCs，应用流式细胞仪和免疫荧光方法分别进行鉴定；实验将OM-MSCs分为3%O2+低氧诱导因子-1α(hypoxia- inducible factor-1α，HIF-1α)抑制剂利非西呱(lifi ciguat，YC-1)+OECs上清诱导组(A组)、3%O2+OECs上清诱导组(B组)及 21%O2+OECs上清诱导组(对照组)。采用免疫荧光检测分化后的神经元，采用定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction，Q-PCR)和Western印迹分别检测HIF-1α的mRNA及 βIII-微管蛋白(βIII-tubulin)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic portein，GFAP)的表达，再用膜片钳检测分化后的神经元钾离子通道开放情况。结果：实验各组相比 较，B组OM-MSCs诱导后免疫荧光显示βIII-tubulin表达最多，Q-PCR显示B组HIF-1α表达明显增高(均P<0.05)；Western 印迹表明B组中βIII-tubulin蛋白表达显著增多，而胶质细胞标志物GFAP表达明显降低(均P<0.05)；且诱导分化后的神 经元经膜片钳检测发现钾离子电流。结论：低氧微环境下的OM-MSCs经OECs上清液诱导能显著提高其向神经元分化 的比例，并明显降低了神经胶质细胞的产生，且与细胞HIF-1α信号通路被激活有关。     

嗅鞘细胞条件培养液对PC12细胞神经丝蛋白?突触蛋白?突触素蛋白表达的影响

目的:观察嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)条件培养液对PC12细胞神经丝蛋白(neurofilament protein,NF)、突触蛋白(synapsin)和突触素蛋白(synaptophysin)表达的影响,探讨嗅鞘细胞条件培养液促神经细胞分化生长的作用机制。方法:原代培养并纯化OECs,收集培养上清制备成嗅鞘细胞培养液(OEC culture medium,OECCM),与PC12细胞培养24、48、72h,观察细胞形态学变化;通过免疫荧光法检测PC12细胞NF的表达及分布;蛋白质印迹法检测NF、突触蛋白和突触素的相对含量。结果:OECCM培养的PC12细胞长有突起,并随着培养时间的延长,细胞形态酷似神经元;免疫荧光染色显示NF起初在核周分布,OECCM作用后NF的分布范围逐渐增加,其分布面积与β-tubulin分布面积的比值显著增高(P<0.05)。蛋白质印迹法显示OECCM组NF、突触蛋白(synapsin)和突触素蛋白(synaptophysin)的表达水平明显高于对照组(P<0.05)。结论:嗅鞘细胞能分泌一些促PC12细胞分化的因子,这些因子能促进P...