仿生髓核组织工程材料支架对体外培养髓核细胞合成代谢的影响

目的：观察自行设计构建的仿生髓核组织工程材料——CⅡ／HyA-CS（CHCS）支架对体外培养髓核细胞合成代谢的影响。方法：将体外培养的传1代髓核细胞接种于培养瓶内，置入CHCS支架，体外培养10d后，分别测定^3H-脯氨酸掺入量、培养液中糖胺聚糖（GAG）含量、髓核细胞可凝集蛋白多糖（Aggrecan）、核多糖（Decorin）、二聚糖（Biglycan）的mRNA表达及Aggrecan的蛋白表达等。结果：实验组与对照组的^3H-脯氨酸掺入量、培养液中GAG含量、髓核细胞Aggrecan、Decorin、Biglycan mRNA表达、Aggrecan蛋白表达等均无统计学差异。结论：CHCS支架对体外培养髓核细胞的合成代谢无明显抑制作用。     

不同Pfirrmann分级椎间盘内髓核细胞生物学特性的比较

目的比较不同Pfirrmann分级椎间盘内髓核细胞的生物学特性,验证腰椎间盘退变Pfirrmann分级能否反应髓核组织在细胞水平的退变程度。方法取术中获得的患者的髓核组织,按腰椎椎间盘退变Pfirrmann分级标准进行分组。组织切片甲苯胺蓝观察比较各组髓核内细胞的密度。采用酶消化法分离培养髓核细胞。台盼蓝染色计算各组细胞活性比率,光镜观察细胞形态,透射电镜观察细胞的超微结构。MTT法绘制各组2代细胞的生长曲线。阿利辛蓝法检测各组细胞的蛋白聚糖含量,比较各组差异。结果随退变级别升高,标本内胶冻样物质含量减少,透明度降低,纤维化组织增多,Ⅴ级标本完全纤维化,并伴有钙化,无法区分髓核组织。Ⅰ级和Ⅱ级髓核内细胞密度明显高于Ⅲ级,Ⅳ级又明显高于Ⅳ级。Ⅰ级组髓核细胞的活性比率为（93.5±3.7）%;Ⅱ级组细胞活性比率为（91.6±4.3）%;Ⅲ级组细胞活性比率为（83.5±6.7）%;Ⅳ级组细胞活性比率为（74.8±5.9）%。除Ⅰ级与Ⅱ级比较差异无统计学意义外,其余各组两两比较差异均具有统计学意义（P〈0.05）。光镜下Ⅰ级和Ⅱ级组细胞呈短梭形或多角形轮廓清晰饱满,折光性强。Ⅲ级组胞突较长,Ⅳ级组胞突更长,细胞轮廓模糊。电镜下Ⅰ级和Ⅱ级组细胞相似,胞浆内含有大量粗面内质网和线粒体,Ⅲ级组细胞内的粗面内质网和线粒体减少,出现小的空泡,可见溶酶体出现。Ⅳ级组细胞溶酶体大量聚集,可见巨大的空泡样结构。Ⅰ级组和Ⅱ级组细胞生长速率快于Ⅲ级组（P〈0.01））。Ⅲ级组细胞生长速率快于Ⅳ级组（P〈0.05）。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组细胞GAG含量分别为（423.19±41.21）mg/L,（408.23±29.25）mg/L、（273.05±52.44）mg/L、（91.73±38.06）mg/L,Ⅰ级组和Ⅱ级组细胞高于于III级组（P〈0.05））。Ⅲ级组细胞高于Ⅳ级组（P〈0.05）。结论椎间盘退变的Pfirrmann分级,能很好的反映髓核组织在细胞水平的退变程度。是一种简单有效的退变分级系统。     

不同代次髓核细胞生物学特性的比较研究

目的通过兔髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)自然传代培养退变模型,观察不同代次NPCs生物学特性。方法取6～8周龄新西兰大白兔(体质量1.5～2.5 kg)胸腰椎节段髓核组织,采用酶消化法获取原代NPCs,计为P0代;胰蛋白酶消化法传代获取第1～3代NPCs,依次计为P1、P2、P3代。倒置相差显微镜观察各代NPCs形态特征;膜联蛋白Ⅴ/碘化丙啶双染流式细胞术检测细胞凋亡率;免疫细胞荧光染色法和Western blot检测各代NPCs的缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)、聚集蛋白多糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2,MMP-2)表达。结果 NPCs形态从P0代的三角形、多角形、多边形逐渐向P3代的梭形变化,细胞体积变大,含特征性空泡细胞逐渐消失,细胞生长倍增时间延长。P0～P3代兔NPCs细胞凋亡率分别为5.47%±0.91%、13.77%±2.42%、33.46%±1.82%、38.76%±1.50%,随着培养代数增加,细胞凋亡率明显增加,比较差异均有统计学意义(P0.05)。免疫细胞荧光染色示,随着培养代数的增加,HIF-1α、Ⅱ型胶原和Aggrecan荧光强度逐渐减小,MMP-2荧光强度逐渐增加。Western blot检测示,HIF-1α蛋白相对表达量在P0代较高,P1代有升高趋势,而后逐渐降低,各代次间比较差异均有统计学意义(P0.05)。Ⅱ型胶原蛋白相对表达量从P0～P3代逐渐降低,各代次间比较差异均有统计学意义(P0.05)。Aggrecan蛋白相对表达量从P0～P2代逐渐降低,两两比较差异均有统计学意义(P0.05);P2代与P3代间比较差异无统计学意义(P0.05)。MMP-2蛋白相对表达量在P3代有明显升高,除P0代与P2代间比较差异无统计意义(P0.05)外,其余各代次间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论自然传代培养法可成功构建NPCs退变模型,退变时细胞形态变化、凋亡增加,细胞合成代谢减慢,分解代谢加快。     

成人退变性椎间盘髓核细胞体外培养及形态学观察

目的通过对成人退变椎间盘髓核细胞的体外培养和形态学观察,进一步研究细胞因素在椎间盘退变中的作用机制。方法取5例患椎间盘突出症并行椎间盘摘除手术的成人髓核,分离后在培养基中进行髓核细胞培养,细胞染色、逆转录聚合酶链式反应、免疫荧光检测细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达。结果椎间盘髓核细胞可在体外培养,30d后方可进行传代,最佳的培养条件为胎牛血清/培养基体积分数为10%～20%,pH值7.0。髓核细胞中出现Ⅰ型胶原,并具有较高的表达,Ⅱ型胶原表达微弱。结论成人退变髓核细胞体外培养时间较长,细胞增殖能力低下,特定培养条件的摸索是成功与否的关键。     

兔髓核内细胞的培养及生长曲线的测定

目的 建立兔髓核内细胞的体外培养方法，绘制其生长曲线。方法取一月龄新西兰兔的髓核，胰酶和胶原酶消化，DMEM／F12培养基中培养，倒置显微镜观察细胞形态。MTT法测定细胞OD值以绘制其生长曲线。结果 原代培养髓核内细胞多为多角形，另有细胞为圆形或椭圆形，内含空泡。随传代培养的次数增加，细胞形态渐变为梭形，出现反分化的特性。生长曲线显示，髓核内细胞在19d时达到高峰。结论 功建立了兔髓核细胞体外培养体系，为组织工程化椎间盘的研究打下基础。在实际应用时，以采取次代细胞为佳，并应将其培养至第19天。     

髓核细胞鉴定的研究进展

目前髓核细胞尚无特异性细胞标记,通常认为来源于髓核并表达Ⅱ型胶原、SOX-9和聚集糖胺聚糖的细胞即髓核细胞。仅以Ⅱ型胶原、SOX-9和聚集糖胺聚糖来在定义髓核细胞显然是不足的,因为上述细胞标记无法鉴别髓核细胞与软骨细胞。干细胞治疗椎间盘退行性疾病是目前的研究热点之一,精确鉴定髓核细胞在干细胞治疗椎间盘退变的背景下具有重要意义。     

不同代次兔髓核细胞冻存后的生物学特性比较

目的:比较不同代次兔髓核细胞冻存后的生物学特性,找出适合作为种子细胞冻存的兔髓核细胞代次。方法:取3～4月龄新西兰大白兔10只,麻醉后在严格无菌条件下分离胸腰椎间盘(T1/2～L7/S1)髓核细胞,体外传代培养,分别取一、二、三、四、五代细胞冻存2～3个月后复苏,取一代未冻存细胞作为对照组(A组,n=10);一、二、三、四、五代冻存后复苏的细胞作为实验组(分别为B、C、D、E、F组,各组n=10),在相同条件下培养2周,培养第2天时采用台盼蓝染色测定细胞成活率;培养第2d、5d、10d、14d时采用MTT法检测细胞生长活性,采用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖(PG)含量;培养第14d时采用阿利新兰染色法测定糖胺聚糖(GAG)合成总量,用RT-PCR法检测各组细胞Ⅱ型胶原基因的表达情况。检测细胞浓度均为1×105个/ml。采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。结果:培养第2d时B、C组细胞成活率接近A组(P>0.05);D、E、F三组细胞成活率明显低于A、B、C组(P<0.05)。不同时间点各组细胞均有不同程度的增殖,A、B、C、D四组生长趋势较接近,A、B、C三组相同时间点生长活性比较差异无统计学意义(P>0.05),D组与同一时间点A组比较有显著性差异(P<0.05),E组第10d和第14d以及F组各时间点间比较差异无显著性(P>0.05);A、B、C三组各时间点的PG含量及GAG含量高于相应时间点D、E、F组(P<0.05);A、B、C三组的Ⅱ型胶原基因表达量高于D、E组(P<0.05),明显高于F组(P<0.01)。结论:不同代次兔髓核细胞冻存后生物学特性不同,第一、二代细胞冻存后能较好保持髓核细胞特性,可作为种子细胞进行低温保存。     

hBMSCs诱导分化类髓核细胞

目的 探讨人椎间盘细胞和关节软骨细胞的分子表型差异,分析hBMSCs经TGF-β,和BMP-7联合诱导后能否分化为软骨细胞和髓核细胞.方法 取9例自愿捐赠者髂嵴骨髓20～40 mL分离培养hBMSCs.取第4代hBMSCs行三维微球培养.根据基础培养基中加入的生长因子不同,实验分成4组,分别为加入10 ng/mL TGF-β3组(A组)、200 ng/mL BMP-7组(B组)、同时加入两种生长因子组(C组)以及空白对照组(D组).于培养后21 d,行组织学及免疫组织化学观察:于培养后4、21 d进行PCR检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅹ型胶原、蛋白多糖和SOX9基因的表达.结果 培养后21 d,HE染色示A组和C组细胞呈软骨细胞样形态特征,甲苯胺蓝染色及免疫组织化学染色Ⅱ型胶原表达呈阳性.B组和D组细胞形态无明显改变,PCR检测示培养后21 d,A、C组SOX9、蛋白多糖、Ⅰ型胶原及Ⅱ型胶原表达较4 d时明显增加(P＜0.05).B、D组Ⅰ型胶原表达较4d时明显增加(P＜0.05),SOX9、蛋白多糖及Ⅱ犁胶原较4d时无明显变化(P＞0.05).其中仅A组X型胶原表达呈阳性.结论 TGF-β,和BMP-7联合应用能促进hBMSCs分化更接近于椎间盘细胞,可能为椎间盘组织工程提供种子细胞.     

兔腰椎间盘髓核细胞的培养及形态观察

目的：通过对兔腰椎间盘髓核细胞的培养,观察细胞内的演变,探讨髓核细胞的生物学行为及影响因素。方法：取兔腰椎间盘髓核细胞,在加10％灭活胎牛血清的F12－DMEM液中培养,建立体外髓核细胞培养模型。通过光镜、电镜观察,同时进行细胞活力测定。结果：（1）原代细胞生物学性状最接近体内细胞,传代后细胞呈现衰老现象。（2） 活力测定提示随着培养时间的延长及传代,活力逐渐降低。（3）髓核细胞内细胞器的变化与其生物学活性变化相一致。结论：兔腰椎髓核细胞的体外培养成功为人腰椎髓核细胞的培养奠定了基础。     

退变腰椎间盘髓核细胞立体培养与单层培养的生物活性比较

目的：比较体外单层培养和旋转微载体立体培养人退变腰椎间盘髓核细胞的生物学活性指标,探讨更加有效的椎间盘髓核细胞体外培养方法.方法：对获取的腰椎间盘突出症患者的24个椎间盘按年龄分为A组（20～25 岁）、B组（26～30 岁）、C组（36～45 岁）及D组（＞45岁）,分别利用酶消化法进行单层细胞培养和旋转微载体立体培养系统进行立体培养,观察细胞生长形态,检测细胞生长曲线及速度、细胞生长活性、细胞分裂指数及胶原含量.结果：单层培养的髓核细胞贴壁后为多角形或梭形,伸出伪足;立体培养的细胞在微载体上呈梭形或不规则形,呈立体状生长.立体培养的细胞生长速度较快,1周内两种培养方法各时间点及各组间比较均具有统计学意义（P＜0.05）.立体培养的髓核细胞活性提高,随年龄增加细胞活性下降;指数生长期细胞分裂指数与单层培养相比有统计学意义（P＜0.05）;Ⅰ、Ⅱ型胶原含量与单层培养相比有统计学意义（P＜0.05）,A组分别与B组、C组及D组比较均有统计学意义（P＜0.05）.结论：旋转立体培养人退变椎间盘髓核细胞的活性保持良好,较单层培养能够大量、优质收集种子细胞,可用于椎间盘组织工程中种子细胞的研究.     

兔髓核细胞体外最佳培养条件的探索

[目的]探索髓核细胞培养的最佳条件，为进一步作为椎间盘组织工程种子细胞提供可能。[方法]以DMEM／F12(1：1，添加FBS10％，pH7．2)作为基础培养液，通过依次改变培养液pH、胎牛血清浓度、抗坏血酸浓度、培养温度、CO2浓度以及培养板处理，计数10d克隆形成数，检测细胞生长代谢，确定最佳培养条件。[结果](1)髓核细胞不易贴壁生长，在未经处理的培养板中进行单层培养细胞增殖能力较弱，克隆形成少；而铺被多聚赖氨酸的培养板中培养可以较快贴壁并形成相对较多的克隆；(2)生长培养液在DMEM／F12(1：1)，pH7．0、胎牛血清浓度15％、抗坏血酸30μg／ml、温度37℃以及CO2浓度为5％时，髓核细胞生长良好，Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖(aggrecan)mRNA表达增高。[结论]在最佳培养条件下，髓核细胞生长状态良好，为椎间盘组织工程髓核细胞的培养奠定了基础。     

Three-dimensional culture of human nucleus pulposus cells in fibrin clot: comparisons on cellular proliferation and matrix synthesis with cells in alginate

Abstract:  Regeneration of nucleus pulposus (NP) tissue may stop or reverse early intervertebral disk (IVD) degeneration. Cellular proliferation and matrix synthesis can be promoted by incorporation of cells and bioscaffolds. However, insertion of preshaped solid bioscaffolds may damage remaining IVD integrity. Fibrin clots can be introduced in a minimally invasive manner with polymerization in desired three-dimensional shape and retention of cells. In this study, we investigated the cellular proliferation and matrix synthesis of human NP cells in the fibrin clots in vitro. Monolayer-expanded cells were embedded in fibrin clot or alginate and were cultivated in vitro for 2 weeks. Increased DNA content and decreased expression of apoptosis stimulating fragment (Fas)-associated death-domain protein in fibrin scaffolds suggested higher cellular proliferation and reduced apoptosis. Superior proteoglycan synthesis was found in fibrin scaffolds. As expression of collagens I and X increased and SOX9 expression decreased, fibrin scaffolds tended to promote fibrotic transformation and inhibit chondrogenesis. Adjustments of fibrin preparations are needed to make it more suitable for IVD regeneration.     

兔髓核与纤维环细胞生物学特性差异的研究

目的:同时建立兔髓核细胞与纤维环细胞体外培养模型,比较两者生物学特性差异。方法:新西兰大白兔5只(2～3kg,雌雄不限),无菌条件下分离髓核及纤维环,酶消化法联合组织块法含15%FBS的DMEM/F12(1∶1)培养液培养,当细胞90%融合后进行传代培养。通过倒置相差显微镜观测细胞形态,台盼蓝染色测定细胞活力,甲苯胺蓝和HE染色进行组织学观察,MTT法测定细胞增殖,分析比较髓核细胞与纤维环细胞形态、活力、增殖的差异。结果:原代及第1代髓核细胞和纤维环细胞形态上无明显差异,第2代髓核细胞开始有空泡出现。髓核细胞较纤维环细胞贴壁时间晚、细胞活力低;原代髓核细胞从第9天开始增殖速度较纤维环细胞慢(P<0.05)。结论:纤维环细胞的细胞活性明显高于髓核细胞。椎间盘退变性疾病可能是由髓核发生衰退引起,从而局部生物力学改变,导致纤维环破裂等组织结构的改变及功能的丢失。     

不同来源椎间盘髓核间质干细胞特性及其多向分化能力研究

 目的 比较来源于先天性脊柱侧凸与腰椎间盘退变髓核组织中髓核间质干细胞增殖特性及其多向分化能力差别。方法 收集2 例先天性脊柱侧凸与2 例腰椎间盘突出患者的椎间盘组织, 采用酶消化法分离细胞, 在含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM 完全培养液中培养髓核间质干细胞, 用MTT法及台盼蓝染色检测脊柱侧凸与椎间盘退变来源的两组细胞的代谢活力与增殖能力。流式细胞仪鉴定两组髓核间质干细胞CD44、CD105、CD29、CD24 表达差异, 观察两组细胞成骨、成脂、成软骨分化能力。结果 侧凸组髓核间质干细胞以梭形为主, 退变组髓核间质干细胞以多边形及三角形为主, 传代后两组细胞大多以纺锤梭形为主。MTT及台盼蓝染色法提示侧凸组代谢活力及增殖能力强于退变组。侧凸组和退变组髓核间质干细胞CD44、CD105、CD29 表达比例分别为97%~100%和88.7%~97%, CD24 表达均为阴性, 两者均不表达造血细胞标志物CD45、CD34、CD14、HLA-DR。侧凸组与退变组髓核间质干细胞均可向成骨、成软骨分化, 但均未向成脂分化。结论 先天性脊柱侧凸与椎间盘退变髓 核组织中均存在髓核间质干细胞, 前者的髓核间质干细胞具有较强的细胞代谢活性及增殖能力, 两者成骨、成软骨分化能力无差别, 但均无成脂能力。     

以骨基质明胶及软骨基质构建一体化纤维环-髓核双相支架的实验研究

 目的 以骨基质明胶和软骨基质构建一体化纤维环-髓核双相支架,并检测其理化性能及细胞相容性。方法 制备中空骨基质明胶环,并注入脱细胞软骨匀浆,经冷冻干燥、交联后制备成一体化纤维环-髓核双相支架。行Hoechst 33258、天狼星红、HE染色,扫描电镜观察支架内部结构,检测支架孔隙率和吸水率,检测双相支架复水后的力学性能。分离山羊纤维环和髓核细胞,接种至双相支架的相应部位,体外培养48 h,扫描电镜、活/死细胞染色评价支架与细胞的生物相容性。结果 镜下Hoechst 33258染色未见细胞残留,天狼星红染色阳性,HE染色示两部分结合紧密。扫描电镜可见支架呈多孔结构,孔隙相连通,纤维环相孔径为(401.4±13.1) μm,髓核相孔径为(112.4±21.8)μm。支架孔隙率为73.37%±2.56%,支架吸水率为655.7%±78.6%。支架压缩弹性模量为(49.06±15.57)kPa,小于正常椎间盘的(135.9±28.9)kPa,但在同一数量级。扫描电镜观察细胞黏附于支架表面,细胞周围有基质分泌,live/dead细胞染色示细胞在支架上活性良好。结论 以天然骨基质明胶和软骨基质构建的一体化纤维环-髓核双相支架,无免疫原性,具有良好的孔径和孔隙率,支架两部分连接处结合紧密,在结构、生化成分及生物力学性能上与椎间盘组织相似,且具有良好的生物相容性。     

盘外置管法注射胶原酶溶解髓核的实验研究

目的:观察盘外置管法注射胶原酶是否有利于髓核的溶解以及胶原酶的注射剂量与滴速对髓核溶解的影响。方法:实验中模仿临床的盘外置管法,将手术中摘取的髓核在体外与胶原酶反应,并且改变给药的速度和剂量,运用免疫组化的单克隆抗体技术对髓核中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原进行原位定性、定量研究以及HE染色对髓核中胶原的形态进行观察。结果:缓慢滴注胶原酶可使髓核中胶原含量明显减少,尤其是Ⅰ、Ⅱ型胶原的溶解更充分。结论:采用盘外置管法慢速滴注胶原酶,可提高胶原酶注射的精确性,延长胶原酶与髓核的作用时间。     

微载体立体培养腰椎间盘细胞蛋白多糖表达的研究

目的研究腰椎间盘细胞在微载体培养与单层培养中细胞表达蛋白多糖含量的差别。方法椎间盘疾病手术病例的术中切除组织采用酶消化法分别进行微载体三维细胞培养和单层细胞培养;取胎儿椎间盘组织,显微镜下区分髓核细胞和纤维环细胞,分别进行培养,同成入组对照。利用^35S放射标记渗入放免定量测定的方法进行蛋白多糖含量的检测。结果①椎间盘细胞胞内的蛋白多糖含量（cpm）,细胞单层培养组为101．909±11．439,微载体立体培养组为136．607±10．792,P〈0．05;②椎间盘细胞表达的蛋白多糖含量（cpm）,细胞单层培养组为105．119±13．040,微载体立体培养组为174．231±17．676,P〈0．05;③各组椎间盘细胞表达的蛋白多糖含量均高于细胞内的含量;④胎儿腰椎间盘细胞蛋白多糖的含量及表达量均高于成人退变椎间盘细胞,胎儿髓核细胞蛋白多糖的表达量高于纤维环细胞的表达量。结论椎间盘细胞的微载体三维立体培养相对单层培养具有较高细胞蛋白多糖的表达量,是一种较好的细胞培养方式。