切割海马伞大鼠海马中65kD和83kD差异蛋白诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的作用

目的：探讨切割海马伞大鼠海马中65 kD、83 kD差异蛋白是否具有诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的作用。方法：切割海马伞后的海马进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,将65 kD、83 kD差异蛋白胶条与大鼠神经干细胞球共培养,计数神经球朝胶条方向1/4扇区内迁移出的细胞数。10 d后行微管相关蛋白2(MAP-2)免疫荧光,计数其中MAP-2阳性神经元数,图像处理其胞体面积和细胞周长。结果：83 kD切割组朝胶条方向迁移的细胞最多,迁移速度最快。其分化的神经元数量多,胞体大、周长长,明显地优于83 kD正常组、65 kD切割组、65 kD正常组和空白对照组。结论：大鼠海马组织中83 kD蛋白具有诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的作用。     

大鼠海马内移植神经干细胞的存活和迁移

为观察成鼠神经干细胞移植入切割海马伞侧海马和正常侧海马后的存活和迁移状况 ,用无血清培养和单细胞克隆技术获取成年 SD大鼠前脑室下带组织的神经干细胞 ,并用 Brd U标记、扩增。在切割 SD大鼠右侧海马伞术后 14 d,将标记有 Brd U的神经干细胞植入双侧海马齿状回中。分别于术后 1周、2周、1个月和 2个月时取脑、冰冻切片 ,进行 Nissl染色和 Brd U免疫荧光检测。结果发现 ,1周和 2周时移植细胞主要围绕在移植点周围 ;1个月和 2个月时 ,移植细胞沿着海马齿状回颗粒下层迁移排列成条带。在所有的脑组织切片中 ,切割海马伞侧海马内移植细胞的密度均明显地大于正常侧海马内的移植细胞密度 ,且切割海马伞侧海马内 Nissl深染的大胞体神经元样细胞明显地多于正常侧。提示 ,移植至海马齿状回中的神经干细胞可存活并可沿海马齿状回颗粒下层迁移 ;切割海马伞侧海马中存活和迁移的神经干细胞密度大于正常侧者 ,可能与某种物质的表达增加有关     

新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究

研究新生大鼠海马区脑组织中神经干细胞体外培养方法,为治疗神经系统疾病寻找合适的细胞来源。取新生SD大鼠的海马区脑组织,采用accutase结合机械分离法获取神经干细胞,在含有B－27、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子的DMEM／F12无血清培养液中培养;Accutase酶消化后传代培养,取第3代细胞行抗巢蛋白免疫荧光染色鉴定并以含10％胎牛血清培养液诱导分化,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色检测NSCs向神经元及胶质细胞分化的能力。分离的新生大鼠海马区脑组织中细胞,在无血清培养液中形成大量的神经球,部分神经球出现融合及贴壁分化现象,细胞呈典型NSCs 形态。经巢蛋白染色鉴定,大部分为阳性细胞。神经细胞球经含有胎牛血清培养液培养后,可分化为神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白表达阳性的细胞。从新生大鼠海马组织分离培养的NSCs具有自我更新和增殖能力,在含胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

Brn-4在大鼠海马神经干细胞向神经元分化中的作用

为探讨Brn-4在海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)向神经元分化过程中的作用,分别制备切割海马伞侧和正常侧海马提取液,将鼠胚海马神经干细胞球分成3组:(1)切割组加入含切割侧海马提取液的DMEM/F12无血清培养基;(2)正常组加入含正常侧海马提取液的DMEM/F12无血清培养基;(3)对照组加入单纯的DMEM/F12无血清培养基。培养后第14d行Brn-4/MAP-2免疫荧光双标染色。在荧光显微镜下分别计数每个视野下Brn-4单标神经元和Brn-4/MAP-2双标神经元的数量,并测量双标神经元的胞体面积、细胞周长以及Brn-4的免疫荧光强度。用图像处理系统和Stata7.0软件对所得数据进行统计学分析。结果显示:Brn-4/MAP-2双标神经元数在切割组中较多、胞体较大、突起较丰富,且Brn-4的免疫荧光亦较强;正常组次之,对照组最差。上述数据经组间比较分析,3组间差异有显著性意义(P<0.01)。本研究结果提示Brn-4在海马神经干细胞向神经元分化过程中可能发挥重要作用。     

不同鼠龄生后大鼠海马神经干细胞的传代和分化

目的研究不同鼠龄大鼠海马神经干细胞(NSCs)的传代增殖和分化情况。方法将生后SD大鼠分为3d、10d、20d 3组,应用胰酶消化法将海马组织制成单细胞悬液,用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、B27的无血清细胞培养技术进行体外培养,单克隆培养后通过Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞、神经元、星形胶质细胞;细胞传3代后,在各组培养基中加入终浓度为10%的血清诱导分化,1周后进行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例,进行统计学分析。结果3组SD大鼠海马组织细胞,单克隆培养后表达Nestin,诱导分化后分别表达NSE和GFAP。生后3d大鼠神经干细胞在传1-6代时每代均快于生后10d和20d大鼠,传6代后,3组细胞传代时间间隔几近一致;生后3d组大鼠海马神经干细胞分化为神经元的比例较其它2组高(P<0.05)。结论生后3d大鼠神经干细胞增殖速度和分化为神经元的数量都高于10d和20d大鼠。     

海马胆碱能刺激肽促进神经干细胞向神经元分化

目的探讨海马胆碱能刺激肽(HCNP)在神经干细胞向神经元分化过程中所起的作用。方法切割SD大鼠右侧穹窿海马伞,14天后取切割穹窿海马伞侧海马制成海马提取液;将神经干细胞接种于24孔板中,分为HCNP与海马提取液联合培养组、HCNP组以及空白对照组,每组八孔;细胞分化至14天时行Tuj-1、MAP-2免疫荧光检测;计数Tuj-1、MAP-2阳性神经元数及细胞周长,并观察胞体大小和突起长度。结果联合培养组Tuj-1、MAP-2阳性神经元最多,胞体大,突起长;HCNP组神经元数量较前组少,胞体较小,突起数量和长度均小于前组;对照组则仅有少量胞体小、突起短的神经元。HCNP与切割穹窿海马伞侧海马提取液联合培养组神经元成熟度优于其它两组。结论 HCNP对神经干细胞向神经元的分化具有明显促进作用。     

联合应用EGF和NGF对成年大鼠海马神经干细胞分化的影响

目的探讨联合应用表皮生长因子(EGF)和神经生长因子(NGF)对成年大鼠海马神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年大鼠海马神经干细胞,单克隆培养细胞行Nestin免疫细胞化学染色,诱导分化1w后细胞行GFAP和NSE免疫细胞化学染色;根据培养基中所加营养因子的不同将第4代细胞分为4组培养:EGF组、EGF+NGF组、NGF组、对照组,此4组细胞培养1w后行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果单克隆培养后克隆球表达Nestin,诱导分化1w后细胞表达NSE、GFAP。与空白对照组相比,EGF组、NGF组和EGF+NGF组细胞分化为神经元的比例较高(P<0.05),其中EGF+NGF组细胞的比例最高。结论单独或联合应用EGF、NGF可以促进成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化。     

星形胶质细胞条件培养液促进新生大鼠海马神经干细胞分化

目的探讨星形胶质细胞条件培养液(ACM)对神经干细胞(NSCs)体外分化的影响。方法行新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的纯化培养后收集ACM,将新生大鼠海马NSCs单克隆培养后行nestin免疫细胞荧光染色,诱导分化5d后行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(GALC)免疫细胞荧光染色;将单克隆培养的NSCs分为对照组和实验组,对照组为单纯NSCs培养液,实验组根据NSCs培养液与ACM比的不同分3组:A组(2:1),B组(1:1),C组(1:2)。各组培养1周,采用NSE免疫细胞荧光检测方法标记神经元并计数和统计学分析。结果纯化的星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白抗体标记阳性率为96.5%;单克隆培养的海马NSCs呈nestin阳性,诱导后呈NSE、GFAP和GALC阳性表达。ACM培养的海马NSCs各组分化为神经元的比例明显高于对照组(<0.01),其中A组的比例最高。结论ACM可以促进新生大鼠海马NSCs向神经元分化。     

耳蜗提取液诱导海马神经干细胞分化的实验研究

为探讨新生鼠耳蜗提取液对于诱导海马神经干细胞分化为内耳毛细胞的影响,采用无血清和单克隆培养方法,将新生鼠耳蜗部位的提取液加入离体的海马神经干细胞的培养液中。应用nestin、BrdU、NF200、GFAP、MyosinⅦA和P27KIP1免疫荧光染色,观察神经干细胞的形态及分化而来的神经元、神经胶质细胞、内耳毛细胞和内耳支持细胞的形态,并检测由海马神经干细胞分化而来的细胞数量。结果表明海马神经干细胞在无血清培养下,可形成nestin阳性细胞球。但在诱导液中加入耳蜗提取液后,免疫荧光染色可见NF200、GFAP、MyosinⅦA和P27KIP阳性细胞。结果提示在耳蜗微环境的作用下海马神经干细胞除了向神经元和神经胶质细胞方向分化外,还可向内耳毛细胞和支持细胞方向分化。     

穹窿海马伞切割侧海马对植入神经干细胞分化为神经元的影响

为观察成鼠神经干细胞移植入切割穹窿海马伞侧海马和正常侧海马后存活和分化为神经元的状况 ,用无血清培养和单细胞克隆技术获取成年 SD大鼠前脑室下带神经干细胞 ,进行 Brd U标记和扩增。切割 SD大鼠右侧穹窿海马伞 ,术后 2周将标记有 Brd U的神经干细胞植入双侧海马齿状回。 2月后 ,行 Nissl染色、Brd U免疫荧光、NF -2 0 0 / Brd U免疫荧光、β-tubulin- / Brd U免疫组织化学染色和 ACh E组织化学染色。结果发现 ,移植的神经干细胞在海马齿状回中存活并沿颗粒下层迁移 ,切割侧海马齿状回中有较多的 Nissl深染的大胞体神经元样细胞 ,而正常侧多为小胞体胶质样细胞。切割侧海马齿状回颗粒下层中见有数个NF-2 0 0 / Brd U、β-tubulin- / Brd U双标神经元和 ACh E阳性神经元 ,而正常侧海马中则未能见到。上述结果提示 ,移植到海马中的神经干细胞能存活、迁移 ,穹窿海马伞切割侧海马中某些物质的表达增强 ,可诱导植入其内的神经干细胞向神经元或 ACh E阳性神经元分化。     

海人酸诱导大鼠海马nestin的表达

为了探讨海人酸(kainicacid,KA)侧脑室注射后大鼠海马内nestin的表达变化,本文选用成年雄性SD大鼠,并随机分成实验组和对照组。实验组大鼠侧脑室注射1μl(0.5μg/μl)KA,分别于术后1、3、7、14、30、60、90d处死动物,并应用免疫荧光方法观察神经前体细胞标记物nestin、神经元特异烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。实验组大鼠海马的nestin阳性细胞在KA注射后3d开始出现于齿状回、CA3和CA1区,到7d达到高峰,然后逐渐减少。注射侧的nestin阳性细胞数均较非注射侧多(P<0.01);对照组仅有散在阳性细胞。本结果提示,海人酸可诱导和增强大鼠海马nestin的表达,而这些表达nestin的细胞主要为星形胶质细胞。     

骨髓间充质干细胞向神经细胞分化及在成年胶质瘤大鼠脑内的迁移

本文初步探讨了骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs治疗大鼠胶质瘤的可行性。体外实验以C6细胞条件培养基作BMSCs诱导剂,诱导7d后,表达微管相关蛋白2(MAP2)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的阳性细胞分别为2.08%和9.37%。体内实验中,将BMSCs经Hoechst33342标记后,移植到胶质瘤模型大鼠正常侧大脑纹状体内。14d后,移植的BMSCs多沿着注射途径分布,胼胝体和血管壁可见少量迁移的细胞。21d后,移植的BMSCs广泛分布于胼胝体、大脑皮层和血管。免疫组化染色结果显示:移植的BMSCs分别表达MAP2和GFAP,分化相对比例分别为33.93%和18.02%。以上结果表明BMSCs可以分化为神经元样细胞,并在脑内向胶质瘤部位迁移,有望成为基因治疗胶质瘤的载体。     

新生大鼠海马源性神经干细胞的分离培养及其向胆碱能神经元定向诱导分化研究

本研究目的是从新生SD大鼠海马分离、培养神经干细胞并诱导其向胆碱能神经元方向分化。利用含b FGF(20ng/ml)和B27的无血清DMEM/F12培养基培养新生SD大鼠海马分离的具有自我更新和多向分化能力的细胞群,用免疫细胞化学技术检测巢蛋白(nestin),并于分化后分别检查特异性成熟神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的标记抗原β微管蛋白(Tuj1 )、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷脂(Galc)的表达;用鸡胚骨骼肌提取液,诱导神经干细胞向胆碱能神经元方向分化。结果显示:从海马分离的细胞群具有自我更新能力,表达nestin,分化成熟后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原;与对照组3. 9%相比,鸡胚骨骼肌提取液可以诱导这些细胞中的9. 6%分化成为胆碱能神经元。提示分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,是中枢神经系统的干细胞;在加有鸡胚骨骼肌提取液的培养基诱导下,能向胆碱能神经元方向分化。     

小鼠胚胎干细胞植入大鼠脑内分化的研究

观察小鼠胚胎干细胞植入大鼠隔区和海马内之后的分化状况。以 SD大鼠为宿主 ,将胚胎干细胞移植入宿主隔区和海马内 ,移植后在 l、2、3、4和 8周取脑 ,冰冻切片 ,进行 Nissl染色和 M6、NSE、GFAP免疫组织化学反应。胚胎干细胞移植入大鼠隔区和海马之后 ,从第 2周开始表达 M6、GFAP、NSE等抗原 ,持续至第 4周 ,主要位于移植区内 ,较少迁移。小鼠胚胎干细胞移植入大鼠隔区和海马内之后 ,分化为神经元和神经胶质细胞     

人胚胎脑海马区神经前体细胞移植到损伤的成年大鼠脑内存活及迁移的研究

本文从人胚胎脑海马区分离、培养、鉴定了神经前体细胞(neuralprecursorcells,NPCs),并初步观察了大鼠纹状体海人酸(kainicacid,KA)损伤后,人神经前体细胞(hNPCs)移植到成年大鼠侧脑室和纹状体后存活和迁移的情况。取胎龄8~12周的人胚胎脑海马区细胞,用含人表皮生长因子(humanepidermalgrowthfactor,h-EGF)、人碱性成纤维细胞生长因子(humanbasicfi-broblastgrowthfactor,h-bFGF)以及人白细胞抑制因子(humanleukemiainhibitorygrowthfactor,h-LIF)的DMEM/F12培养液离体培养,以含1%胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)的DMEM/F12诱导分化,巢蛋白(nestin)免疫荧光染色鉴定NPCs的特征。向成年大鼠右侧纹状体内立体定位注射KA,造成大鼠纹状体局部损伤。用溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)体外标记第2代hNPCs,48h后分别移植到正常成年大鼠和损伤大鼠手术侧的侧脑室和纹状体。6周后用抗BrdU抗体检测HNPCs的存活和迁移。结果显示:体外培养呈悬浮球状生长的细胞是nestin阳性的hNPCs。hNPCs移植6周后,在大鼠损伤侧的纹状体和侧脑室内,均检测到了BrdU阳性细胞,并有一部分细胞迁移到了周围纹状体实质和胼胝体。结果提示:体外分离培养的hNPCs移植到成年大鼠脑损伤区周围可以存活和迁移,损伤区域可能对移植细胞的迁移有一定的诱向作用。     

胚胎大鼠脊髓神经干细胞体外培养与定向分化为胆碱能神经元的研究

为了研究胚胎大鼠脊髓源神经干细胞(ESCSCs)的培养和体外分化为胆碱能神经元的情况,本文从孕龄13d的胚胎大鼠脊髓组织中分离获得神经干细胞,采用含表皮生长因子(EGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清限定性培养基培养,并通过添加维甲酸(RA)、音猬因子(SHH)和神经营养因子-3(NT-3)等诱导因子,进行干细胞体外诱导,用免疫荧光细胞化学方法观测其向胆碱能神经元分化的情况。结果表明:从胚胎脊髓中可分离得到大量的神经干细胞,通过含EGF和bFGF的限定性培养基培养可获得干细胞球,通过添加RA、SHH和NT-3等诱导因子后,可见有胆碱能神经元生成。本研究结果提示,胚胎大鼠脊髓神经干细胞在添加EGF与bFGF的限定性培养基中可以增殖并长期保持稳定的ESCSCs性状,在添加特殊因子的条件下,并在体外ESCSCs可以被定向诱导分化为胆碱能神经元。     

成年鼠大脑皮质损伤后神经前体细胞的增殖、迁移和分化

探讨皮质损伤后室管膜下区(SVZ)神经前体细胞增殖、迁移和分化的变化。在立体定位仪上纵切SD大鼠的大脑皮质,于手术后10d腹腔注射BrdU,分别于术后10、13、16、19和21d处死动物。用BrdU、nestin、GFAP和NSE免疫组化单标或双标染色方法,观察损伤后神经前体细胞增殖、迁移和分化的情况。结果显示:损伤后第10d,除损伤区出现大量BrdU阳性细胞外,SVZ背外侧角也聚集大量BrdU阳性细胞;第13d时,SVZ背外侧角的BrdU阳性细胞开始沿胼胝体向损伤区迁移;至第16d和19d,BrdU阳性细胞已迁移到SVZ背外侧角和损伤区之间;第21d时,BrdU阳性细胞已进到损伤区;BrdU阳性细胞为神经前体细胞,但未见分化为星形胶质细胞和神经元。结果提示机械性大脑皮质损伤可诱导SVZ背外侧角神经前体细胞增殖并引导向损伤区迁移,可能参与脑损伤后的修复。     

海马中56kD蛋白诱导人神经干细胞向神经元分化的作用

在已证明切割海马伞海马中差异表达的56kD蛋白具有诱导神经干细胞迁移作用的基础上,进一步探讨其诱导神经干细胞向神经元和AChE阳性神经元分化的作用。取切割SD大鼠海马伞后14d及正常海马组织的匀浆进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)。将用无血清培养技术获取的人胚神经干细胞球分别与切割海马伞后14d和正常海马56kD差异蛋白的胶条及空白对照胶条共培养,在倒置显微镜下观察神经干细胞球中细胞的迁移和分化情况,于第21d分别应用MAP-2免疫荧光和AChE组织化学方法检测人神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元的情况,并进行神经元的计数、细胞面积、细胞周长的图像处理和统计学分析。结果显示,分化的MAP-2阳性神经元的数量、细胞面积及细胞周长三项指标切割组最好,正常组次之,而空白对照组最差;三组AChE组织化学染色均为阴性结果。上述结果提示切割海马伞后海马中差异表达的56kD蛋白具有诱导神经干细胞向MAP-2阳性神经元分化的作用,但不能诱导神经干细胞向AChE阳性神经元分化。