Eu标记RT-PCR检测丙型肝炎病毒RNA

目的 采用一种新的铕螯合物BHHCT，制备高灵敏度荧光标记物，建立检测丙型肝炎病毒（HCV）RNA的方法。方法 采用柱层析纯化的方法抽提血清中HCV RNA。以5′端带有生物素的引物进行RT－PCR Tth酶一步法扩增，通过固定于微孔板上的捕获探针与带有生物素的PCR扩增产物杂交后，利用标记有铕的链霉亲合素与生物素的特异性结合，将铕连接到待测核酸上，在特定波长的激光光激发下发出荧光，进行检测。结果 铕标记检测法与酶标法的变异系数、敏感性、特异性分别为10．43％、100％，100％与16．25％，94％，100％。结论 Eu标记RT－PCR Tth酶一步法检测HCV RNA，具有敏感、特异、快速、重复性好、不受环境因素影响和无溴乙锭污染等优点，可望取代酶标法及电泳法。     

双抗原夹心ELISA检测抗HCV总抗体

目的建立检测抗HCV抗体的双抗原夹心ELISA法,评价其可行性。方法将与His或GST融合表达的HCV基因工程抗原,分别用作ELISA的包被和酶标记抗原,建立用于抗HCV总抗体检测的双抗原夹心ELISA。用此方法检测1 968份临床血清标本,并以间接ELISA(北京万泰试剂)与之对照;此外,用套式RT-PCR检测部分血清的HCV RNA。结果有1 761份血清2种ELISA检测均为阴性,有190份血清均为阳性,两种方法符合率为99.1%;有17份血清的检测结果不相符,间接法阳性而本法阴性的14份,其中HCV RT-PCR阳性1份;本法阳性而间接ELISA阴性的3份,其中RT-PCR阳性2份。双抗原夹心ELISA与间接ELISA的敏感性分别为99.48%、98.96%,特异性分别为99.94%、99.27%。结论新研制的检测抗HCV总抗体的双抗原夹心ELISA具有较高的敏感性和特异性,值得作进一步的深入研究。     

磁捕法对传染性非典型肺炎冠状病毒RNA富集体系的初步研究

目的 初步研究建立磁捕法对传染性非典型肺炎又称严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒RNA的富集、纯化体系,以提高逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测SARS冠状病毒RNA的敏感性。方法 根据国际基因库公布的SARS冠状病毒基因序列,自行设计引物、探针,体外克隆目的RNA片段作为标准物质;利用标准RNA以及模拟SARS血清标本的RNA,评价自行设计的SARS冠状病毒巢式RT-PCR检测体系和磁捕法SARS冠状病毒RNA富集检测体系的检测效果。结果SARS冠状病毒巢式RT-PCR检测体系,对于模拟血清SARS标本RNA的最低检测样本浓度为20拷贝/μl,而磁捕法SARS冠状病毒RNA富集检测体系的最低检测样本浓度为1拷贝/μl。结论 初步建立的磁捕法SARS冠状病毒RNA富集检测体系,可有效地对低浓度的RNA样本进行浓缩、纯化,有效提高SARS RT-PCR检测方法的敏感性。     

丙型肝炎病毒1b亚型诊断芯片的制备与实验室研究

目的建立一种简单有效的制备、筛选丙型肝炎病毒(HCV)1b亚型cDNA基因芯片探针的技术。方法应用cDNA文库法制备芯片探针，限制性内切酶Sau3AI消化HCV-1b全长cDNA。所得的酶切片段在72℃补平加单个碱基A，然后与pMD18-T载体连接，AT克隆，用载体引物进行PCR初步鉴定，并测序。将筛选出的片段打印在氨基修饰的玻片上制备成cDNA芯片并进行杂交验证分析。样品标记采用限制性显示PCR(Restriction Display PCR RD—PCR)技术。结果应用cDNA文库法，共得到22大小相对一致(250—750bp)的基因片段，序列分析表明，均属于HCV—1b基因，可以作为诊断芯片探针；芯片杂交结果显示，样品和诊断基因芯片杂交的敏感性和特异性均佳。结论用cDNA文库法收集片段是一种快速、简便制备芯片探针的实用方法；制备的诊断芯片可以用于检测HCV-1b RNA，具有敏感、检测结果较为可靠的优点。     

定量PCR与传统RT-PCR检测HCV RNA的比较研究

目的用荧光定量PCR（FQ-PCR）和逆转录PCR（RT-PCR）法检测抗-HCV阳性血清中的HCVRNA，探讨两种方法检测结果的临床意义。方法抗-HCV阳性血清样本1062份，其中481份用RT-PCR法检测，465份用FQ-PCR法检测，另有116份同时用两种PCR法检测。结果RT-PCR法检测HCV RNA的阳性率为49．90％（240／481），FQ-PCR法的阳性率为62．58％（291／465），两种方法的阳性率有显著性差异（P〈0．001）。同时用两种方法检测116份，RT-PCR法阳性率为49．14％（57／116），FQ-PCR法阳性率为65．52％（76／116），也有显著性差异（P〈0.05）。FQ-PCR法检测的40份阴性中RT-PCR法检测出4例HCVRNA阳性。结论FQ-PCR检测HCVRNA比RT-PCR特异性高．但RT-PCR的敏感性较FQ-PCR高，部分FQ-PCR检测的阴性结果不能排除HCV RNA阳性的可能性。     

微量酶标夹心杂交法定量检测人iNOS—mRNA

目的：建立一种高灵敏度、高特异性、精确、简便的微孔板酶联夹心杂交技术，对人iNOS—mRNA进行定量检测。方法：设计两条特异探针，其中一条为用捕获探针，5’端连接氮基，能与微孔板表面的NOS基团共价结合，“竖直”地包被在微孔中，另一个为检测探针，3’端带有生物素标记。用脂多糖(LPS)刺激人外周血单个核细胞24h后，提取巨噬细胞总RNA，进行RT—PCR扩增，PCR产物热变性后加入到已包被捕获探针的微孔板内，并加入检测探针进行夹心杂交，最后加入链亲和素一辣根过氧化物酶(SAV—HRP)及底物，在450nm波长检测杂交信号。结果：该方法检测iNOS—mRNA的灵敏度明显高于RT—PCR一琼脂糖凝胶电泳；特异性高，RT—PCR和酶联夹心杂交均无非特异阳性信号出现；重复性良好。结论：本方法操作简单、灵敏度高、特异性强、结果数据化，适合于iNOS—mRNA的定量检测。     

线性探针分析法检测结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变的研究

目的研制线性探针分析法检测结核分枝杆菌(结核菌)rpoB基因耐药突变试剂盒。方法设计15条结核菌rpoB基因野生型和突变型的线性探针，固定尼龙膜上；在rpoB基因引物上标记生物素，扩增结核菌DNA，获得生物素标记扩增产物，与rpoB基因线性探针杂交，加入标记过氧化物酶的亲合素，再加四甲基联苯胺显色。结果应用线性探针分析法检测87株结核菌，其与rpoB基因直接测序法、传统药敏法符合率分别为98．8％(82／83)和94．3％(82／87)。结论线性探针分析法检测rpoB耐药基因突变是一种操作简便、特异性高、敏感性高，易开展的方法。     

南京地区丙型肝炎病毒基因分型的研究

目的 了解南京地区丙型肝炎病毒(HCV) 基因型分布的特点.方法 采用针对HCV三种主要基因型1,2,3和1b亚型设计的型-特异性引物,通过RT-PCR和套式PCR扩增HCV基因组高度保守的5'端非编码区,检测55例HCV IgG阳性血清的HCV RNA,并对其中40例进行基因分型.结果 PCR检测的抗HCV IgG阳性血清标本55例中,50例为HCV RNA阳性,阳性率为90.91%;对40例HCV RNA阳性的血清进行分型,发现23例为1b型,15例为2,1 b混合型,HCV-1b亚型含有率为95%,其余两例分别为2型和1,2混合型.结论 该地区HCV流行优势株为1b亚型.     

检测丙型肝炎病毒F抗体的一种间接ELISA的初步评价

目的评价以丙型肝炎病毒（HCV）F蛋白为包被抗原的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）的准确性和可靠性。方法以基因工程重组HCV F抗原包被酶标微孔板,检测HCV感染者血清抗-F滴度,建立阳性判断值,计算HCV感染者血清抗-F阳性率。与某市售HCV ELISA试剂同时检测HCV感染者和非感染者抗-F阳性率,计算该ELISA的敏感性和特异性等技术指标。结果该间接ELISA检测的敏感性为66.7%,特异性为96.7%,正确指数为63.3%,一致率为81.7%,Kappa值为0.63,变异系数（CV）为6.23%。结论该间接ELISA初步评价指标符合准确性和可靠性要求,具有潜在补充检测HCV感染的扩展应用价值。     

非甲非乙患者丙型肝炎病毒核酸序列的检测

丙型肝炎病毒(HCV)的基因组提示HCV 是正链RNA 病毒。1989年,根据HCV cDNA 克隆36~6和376建立了检测肝、血浆或血清中HCV RNA 的敏感的半定量的cDNA/聚合酶链反应(cPCR)技术。本文报道用cPCR 法和放射免疫法(RIA)检测病人和实验黑猩猩的HCV RNA 和抗-C100-3抗体的结果。对象为15例慢性非甲非乙肝炎(NANBH),1例原因不明肝病,1例慢性HBV 感染的肝活检标本和血清,2例实验性HCV 感染的黑猩猩(771和910)的血浆和4份人类及4份黑猩猩的对照血清。从肝脏活检和血浆标本的RNA 提取液中合成     

酶免疫法检测丙型肝炎病毒RNA的聚合酶链反应产物

目的建立一灵敏、快速的检测丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ逆转录－套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）产物的酶免疫法。方法对第２次ＰＣＲ所用的引物进行双标记，使扩增产物同时被修饰有生物素和荧光素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）成分，再经过固相的链亲合素进行捕获、辣根过氧化物酶标记的抗－ｆｌｕｏｒｅｓ－ｃｅｉｎ反应后显色测定。结果所建立的方法与常规聚丙烯酰胺凝胶电泳法相比灵敏、快速、准确，结果判断客观，重复性也较好；所测结果可反映ＰＣＲ产物量的多少，但不能准确表示模板量的大小。结论建立的方法可取代电泳法而成为ＨＣＶＲＮＡ常规ＰＣＲ反应产物的检测技术。     

基于丙型肝炎病毒NS5B基因序列分析的基因分型

目的：建立基于丙型肝炎病毒(HCV)NS5B基因序列分析的基因分型方法，对上海地区慢性丙型肝炎进行基因分型。方法：用HCVRNA实时荧光定量检测试剂盒对慢性丙型肝炎患血清标本的HCV RNA水平进行定量分析。用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和套式-PCR扩增HCV RNA阳性的41份标本的部分HCV NSSB区基因，PCR产物经回收、纯化后直接进行测序分析。从GenBank中下载25份不同基因型的HCV原型序列，用NSSB区222bp的基因片段构建系统进化树，对临床标本相应的HCVNS5B区序列进行分析。结果：基于HCVNS5B基因序列的系统进化树分析，可成功地对本组41份标本进行基因分型。分型结果显示，1b型占85．4％(35／41)，2a型占12．20％(5／41)，3a型占2．44％(1／41)。结论：基于HCVNSSB区基因序列的系统进化树分析是一种可靠和方便的HCV基因分型方法。上海地区的HCV基因型以1b型为主。     

丙型肝炎病毒载量与核心抗原及丙氨酸转氨酶检测的比较研究

目的研究实时荧光定量PCR定量检测丙型肝炎病毒(HCV)RNA载量与HCV核心抗原和丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测的相关性及符合性。方法逆转录-PCR荧光探针法定量检测94例怀疑HCV感染患者的血清HCV RNA,同时用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HCV核心抗原,全自动生化分析仪检测ALT水平。结果 94份样本中HCV RNA阳性率为56.4%(53/94),核心抗原阳性率为53.2%(50/94),经统计学分析,两种方法的阳性率差异无统计学意义(P>0.05),符合率为84.9%(45/53);ALT异常率为62.3%(33/53),并随HCV RNA载量的升高而增加。结论 HCV RNA定量检测及HCV核心抗原检测结合ALT结果分析有助于临床了解HCV在体内的复制水平和肝脏的炎性反应状态,指导临床用药及观察疗效。     

纳米金比色芯片同步目视化检测HBV和HCV

目的 建立一种简单、快速的比色芯片可同时目视化检测HBVDNA和HCVRNA。方法 利用多重PCR方法扩增HBsAg阳性合并抗HCV阳性的患者血清中提取的HBVDNA和HCVcDNA。制备Au纳米颗粒基因探针，检测探针与固定在尼龙膜上的捕捉探针构成双探针，用斑点杂交法检测HBVDNA、HCVcDNA的多重PCR产物，加入银离子（Ag^＋）-对苯二酚液染色观察结果。结果 多重PCR可同时扩增HBVDNA和HCVcDNA，出现预期的431bp和323bp特异性条带。纳米金比色芯片可以同步目视化检出乙型、丙型肝炎合并感染患者血清中HBVDNA和HCVRNA的PCR产物。结论 目视化HBV、HCV纳米金比色芯片诊断方法操作简单、特异性好、成本低廉、结果 判定指标客观，此类基因芯片在病毒基因检测领域将会有广泛用途。     

Tyramide signal amplification of biotinylated probe in dot-blot hybridization assay for the detection of parvovirus B19 DNA in serum samples

Highly sensitive assay systems are necessary for large-scale virological screenings. We evaluated the use of tyramide signal amplification (TSA) for biotinylated probe in dot-blot hybridization assay to detect B19 DNA in serum samples. The probe was constructed by PCR and directly labeled with biotin during amplification reaction. The sensitivity of the dot-blot hybridization assay with TSA detection method was evaluated in comparison with a hybridization assay using the direct detection of biotinylated probe by streptavidin-biotin-alkaline phosphatase substrate. The TSA detection was able to detect 1 pg of B19 DNA and proved to be 10-50 times more sensitive than the hybridization assay with the direct detection of biotinylated probe. The analysis of 720 serum samples by TSA detection of biotinylated probe showed that the assay may be a valid diagnostic tool in routine testing of B19 DNA in serum samples.     

拟输血手术患者混合血清样本丙型肝炎病毒核酸检测分析

目的 探讨不同数量混合血清样本丙肝病毒核酸(HCV RNA)检测在拟输血手术患者中的临床应用.方法 用酶联免疫吸附试验(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)检测单份血清样本抗-HCV,聚合酶链反应技术(polymerase chin reaction,PCR)检测单份血清样本、...     

Detection of hepatitis C virus RNA by a two-stage polymerase chain reaction with two pairs of primers deduced from the 5'-noncoding region

The 5'-noncoding region of hepatitis C virus (HCV) genomes is highly conserved. A two-stage polymerase chain reaction (PCR), involving two pairs of primers deduced from the 5'-noncoding region of the HCV genome, was developed for a sensitive and specific detection of HCV RNA. The first stage of PCR was performed for 35 cycles with primers capable of multiplying fragments of 221 base pairs. PCR products in samples negative for HCV RNA were subjected to the second stage of PCR for 30 cycles with primers located internal to those employed in the first stage of PCR. The two-stage PCR detected up to 10 chimpanzee infectious doses/ml of HCV, and HCV RNA in 11 (92%) of 12 sera from patients with chronic non-A, non-B hepatitis without detectable antibodies to HCV by a commercial assay kit. Primers from the 5'-noncoding region of the HCV genome would be suitable for detecting HCV RNA by PCR, since the other regions of the HCV genome diverge extensively in sequence because of its nature as an RNA virus.