人SR-AI转基因小鼠遗传与繁育的研究

目的探讨被转入的人SR-AI基因的整合与复制情况及其对小鼠繁育的影响.方法采用类似系祖建系的方法,对人SR-AI转基因小鼠的2、3534、3560、3638、3639五个系列进行了繁育.并用PCR和Southermblot的方法,检测五个系列小鼠尾组织的DNA样品.结果五个系列小鼠共产仔431只,PCR检出阳性小鼠178只,阳性率为41.2%.在3639系的F1、F2、F3代及纯合子转基因鼠中PCR阳性率分别为47.8%、71.3%、75%和100%.结论人SR-AI基因在子代鼠中能稳定遗传,且对生殖和发育无明显影响.     

乙型肝炎病毒转基因小鼠中外源基因整合的检测

目的：了解乙型肝炎病毒ＤＮＡ序列在乙型肝炎病毒转基因小鼠中的整合情况。方法：用头尾相接的乙型肝炎病毒全序列基因，通过原核显微注射法产生转基因小鼠，用Ｃ区特异性引物扩增鼠尾ＤＮＡ检测整合，对其中１０只阳性鼠的扩增产物测序。结果：１２８只仔鼠中，１４只整合阳性。对１０只阳性鼠测序，９只与所转基因序列完全相同，１只在１７３９、１７４０位缺失两个碱基。结论：外源乙型肝炎病毒基因确实整合至小鼠基因组，多数为     

乙型肝炎病毒转基因小鼠中外源基因整合的检测

目的 :了解乙型肝炎病毒DNA序列在乙型肝炎病毒转基因小鼠中的整合情况。方法 :用头尾相接的乙型肝炎病毒全序列基因 ,通过原核显微注射法产生转基因小鼠 ,用C区特异性引物扩增鼠尾DNA检测整合 ,对其中 10只阳性鼠的扩增产物测序。结果 :12 8只仔鼠中 ,14只整合阳性。对 10只阳性鼠测序 ,9只与所转基因序列完全相同 ,1只在173 9、1740位缺失两个碱基。结论 :外源乙型肝炎病毒基因确实整合至小鼠基因组 ,多数为正常整合 ,但也存在缺失整合。     

EB病毒膜抗原BLLF1基因在转基因小鼠中的表达

目的:分析EB病毒膜抗原(membrane antigen, MA)BLLF1基因在转基因小鼠外周血淋巴细胞中的表达.方法:EB病毒膜抗原BLLF1基因转基因首建鼠4只,尾组织经PCR检测携带有BLLF1基因,用流式细胞仪分析MA在外周血淋巴细胞中的表达并用激光共焦显微镜确定MA在细胞中的表达部位.结果:4只首建鼠中有2只KM-Tg-EBV1和KM-Tg-EBV5外周血淋巴细胞中有MA的表达,表达部位在细胞浆中和细胞膜上.结论:表达EB病毒膜抗原的转基因小鼠可作为研究EB病毒致病机制的一个新的动物模型.     

建立转bcl-xL基因小鼠的研究

目的 建立转bcl—xL基因小鼠，继而传代建系，用于缺血性脑血管疾病的研究。方法 采用显微注射法，将人bcl—xL基因注入民明小白鼠受精卵获得子代鼠，然后作PCR、Southern—blot、mRNA、Western—blot检测以获得阳性鼠。结果 实验中注射受精卵1654枚，移植卵数1448枚，受体鼠49只，怀孕鼠7只，子代鼠13只，整合4只并均有表达。注射受精卵的存活率87．54％，受精卵的总存活率0．78％，受体鼠的怀孕率14．28％，整合效率30．77％，总有效率为0．24％。结论 获得了转bcl—xL基因小鼠，但转基因的效率较低，表达不稳定。     

Nestin转基因小鼠模型的建立及nestin基因在器官中的表达

目的构建人nestin基因表达载体,制备nestin过表达转基因小鼠。方法以人神经胶质瘤细胞株U251的cDNA为模板,分
3段扩增出nestin基因cDNA全序列,并将其克隆入含有强启动子ROSA26的pBROAD3载体,酶切鉴定、测序,除去原核序列,
纯化。显微原核注射建立转基因小鼠。PCR验证nestin基因整合,确定建立首建者。将阳性鼠传代。Western blot方法检测F3
代转基因小鼠与野生型小鼠主要器官（心、肺、脑、肾）的nestin 表达。结果测序结果证明成功构建了受ROSA26启动子调控的
nestin转基因载体。出生34只小鼠,PCR检测证实存在首建者2只。Western blot方法证实,与野生型小鼠相比,F3代转基因小
鼠脑、肺组织存在较高水平nestin 表达。结论首次成功建立nestin过表达转基因小鼠,外源基因可遗传到子代并在脑和肺组织
中稳定表达,为深入研究nestin在肿瘤转移、细胞“干性”的维持和细胞的分化等功能提供了良好的实验动物模型。
     

HBV基因在第20代HBV转基因小鼠中的复制和表达

目的研究HBV基因在已传20代BALB／c-TgN（HBV D型1．3）SWS458小鼠中复制和表达情况。方法采用PCR荧光定量检测法、ELISA检测和免疫组化的方法研究HBV基因在转基因小鼠体内的复制和表达情况。结果F20代BALB／c-TgN（HBVD型1．3）SWB458小鼠血清HBVDNA为（104—106）copy／mL，HBsAg表达量为（124．41±33．46）ng/mL，preS1和HBcAg的OD值分别为0．248±0．076和0．635±0．338。肝组织有HBsAg和HBcAg表达，且HBsAg为胞浆型，HBcAg为核型。结论经过筛选和培育，本转基因小鼠传至20代时HBV基因复制表达稳定，表明我们已经获得一个传代表达稳定的HBV转基因小鼠品系。     

应用荧光原位杂交检测HBV基因在转基因小鼠染色体上的整合

目的应用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）,检测本研究中心制备的乙型肝炎病毒（HBV）转基因小鼠目的基因的整合位点。方法采用荧光原位杂交技术,以正常小鼠染色体标本为对照,通过荧光标记的探针与转基因小鼠染色体标本进行杂交,对比分析同一中期分裂相的G显带和FISH结果。结果转基因小鼠染色体检测到一对明显的荧光信号,推测其在14号同源染色体上,而对照组无信号。结论外源HBV基因以单位点形式稳定地整合到转基因小鼠的染色体上。     

重组人细胞因子基因在转基因中药细胞中的瞬时表达

目的 利用转基因中药表达人细胞因子基因，探讨培育基因修饰（GM）中药的可行性，方法 将体外扩增分别获得的人α-干扰素基因与RANTES基因酶切回收后插入中间载体，用EcoRI和HindⅢ双酶切鉴定重组子，由大肠杆菌分离重组质粒并导入根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens，通过加入卡那霉素（Km)和利福平（Rif)筛选含重组双元载体的转化子，用叶盘共培养法转化苦瓜和夏枯草外植体。结果 经RT-PCR检测到人α-干扰素基因与RANTES基因在中药转化愈伤组织中的瞬时表达。结论 首次报道了重组人α-干扰素基因与RANTES基因在转基因苦瓜和夏枯草细胞中的表达。为探讨利用转基因中药抗病毒尤其是抗艾滋病开创了新途径。     

人bcl-xl转基因小鼠外源基因的复制及传代的稳定性观察

显微注射法建立转bcl-xl基因小鼠，将PCR及Southern-blot检测阳性的小鼠与正常鼠酱并传代，然后检测子代中外源基因的遗传 情况。结果发现：10号小鼠传代过程中PCR阳性率保持稳定，符合孟德尔遗传规律，外源基因能够稳定遗传 。6号小鼠PCR阳性率呈轻微下降趋势，但能够保持相对稳定遗传 。13号和5号小鼠PCR阳性率均呈现明显的下降趋势。该二小鼠存在外源基因遗传丢失现象。结果提示：获得了能够稳定遗传 的转基因鼠系。     

丙烯酰胺对小鼠小脑SOD基因表达的影响

目的：研究丙烯酰胺对小鼠小脑超氧化物歧化酶基因表达的影响。方法：通过腹部皮肤涂布丙烯酰胺建立小鼠神经毒模型，采用逆转录PCR方法研究超氧化物歧化酶在小脑的表达情况。结果：丙烯酰胺组、VitC治疗组对Mn-SOD基因表达影响不明显，丙烯酰胺组、VitC组处理第4天、第7天Cu，Zn-SOD表达增高，第10天丙烯酰胺组、VitC组Cu，Zn-SOD基因低表达，且丙烯酰胺组较VitC组更低。结论：丙烯酰胺的神经毒作用可能与其抑制Cu，Zn-SOD表达有关。     

重组bcl-xL腺病毒对心肌细胞凋亡的影响

[目的]探讨转染人类抗凋亡基因bcl-xL能否提高心肌细胞对缺氧的耐受性,评价它对心肌细胞的抗凋亡作用.[方法]体外培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,建立模拟心肌缺氧模型;将携带人类bcl-xL基因的重组腺病毒感染心肌细胞;免疫细胞化学染色法分析bcl-xL蛋白的表达;TUNEL法检测凋亡指数;荧光显微镜下观察心肌细胞表达绿色荧光蛋白,用Hoechst33342染色观察细胞核的形态变化.[结果]转染rAd-bcl-xL/s的心肌细胞表达bcl-xL蛋白阳性单位(PU)(17.84±3.42)明显高于正常对照组(11.02±2.56)与rAd-bcl-xL/as转染组(8.53±2.25)(P＜0.01);缺氧诱导后心肌细胞凋亡指数为(45.67±8.47)%,而转染rAd-bcl-xL/s后的细胞凋亡指数减少至(9.42±2.48)%,有显著性差异(P＜0.01),未见典型的凋亡小体.[结论]腺病毒介导的bcl-xL基因能高效转染心肌细胞,并表达目的基因;外源性bcl-xL基因对体外培养的心肌细胞具有抗凋亡作用,能够提高心肌细胞对缺氧的耐受性,促进损伤心肌的恢复.     

人类肛门直肠畸形基因表达谱的研究

目的：研究肛门直肠畸形患儿直肠末端的基因表达谱，初步筛查肛门直肠畸形的差异表达基因。方法：应用基因表达谱芯片技术对3例先天性肛门直肠畸形患儿的直肠末端组织和3例正常直肠末端组织的基因表达进行检测。结果：在186个发育相关基因中，共发现差异表达基因54个，表达上调的52个，表达下调的2个。结论：先天性肛门直肠畸形的发生涉及多基因改变。基因表达谱芯片技术可同时定量研究大量基因表达水平，是一种快捷高效的方法。     

转基因小鼠和基因突变小鼠微卫星不稳定性分析

目的 探讨微卫星在转基因和基因突变小鼠中的变化,为基因修饰和遗传突变动物的遗传检测和表型分析提供理论依据和技术手段。方法 根据文献报道,从GenBank中选取198个等位基因数量多、富含多态性的微卫星位点,以野生型动物为对照,对6种近交系遗传背景的转基因小鼠和5种自然基因突变的近交系小鼠进行微卫星多态性检测,选用1.5%琼脂糖凝胶电泳和STR扫描技术,比较分析微卫星不稳定性。结果 共有40个微卫星位点在转基因和基因突变小鼠中表现出多态性。在基因突变小鼠中,微卫星不稳定性有55.6%（10/18）是由纯合变为杂合（I型）,有3个位点（16.6%,3/18）是纯合突变（II型）,有5个位点同时存在2种类型的突变。但是在转基因动物中,大多数的微卫星多态性为I型突变（87.5%,28/32）,只有2个位点（6.2%,2/32）是II型突变。另外有2个位点同时存在2种类型的突变。结论 基因修饰或基因突变可引起小鼠相关微卫星发生不稳定性,而且某些微卫星位点对基因改变敏感性较高。     

人神经营养因子-3基因在大肠杆菌中的克隆和表达

目的 :获得人神经营养因子 - 3 (hNT - 3 )在大肠杆菌中的克隆并表达。方法 :采用PCR方法从 2 0周人胎脑cDNA文库中扩增hNT - 3基因 ,通过双酶切法在M 13mp18载体上克隆获得全长基因 ,将正确全长基因插入PBV2 2 0载体 ,通过选择合适宿主菌获得hNT - 3的高效表达。结果 :获得全长基因完全正确的hNT - 3基因 ,获得占细菌总蛋白 3 0 %的hNT - 3表达菌株。结论 :本研究获得了序列正确的hNT - 3基因克隆 ,并实现了在大肠杆菌中的高效表达。     

肝脏特异性可调控丙型肝炎病毒核心蛋白表达的转基因小鼠模型的建立

【目的】制备TRE-HCV-C转基因小鼠，为四环素调控系统的体内研究提供了反应部分的转基因小鼠。以便与本实验室同时建立的调控部分的小鼠共同作用，为进一步建立双转基因小鼠模型奠定基础，更为丙型肝炎病毒核心蛋白（HCV-C）的发病机制的研究提供一个实用方便的模型。【方法】重组构建含有目的基因HCV-C、TRE序列和SV40polyA的转基因载体pTRE-HCV-C．以显微注射的方法将l_153kb的转基因片段注人BALB／C母鼠的受精卵．出生动物及其后代经PCR初步筛选出阳性．再经Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本行进一步鉴定。用转基因阳性小鼠和整合有肝脏特异性启动子ApoE和胛A基因的另一品系转基因小鼠杂交，得到子代F1小鼠，通过免疫组织化学来初步检测HCV-C在肝脏中特异性的可调控性的表达。【结果】产生了5只整合有TRE-HCV-C基因的首建鼠，以及它的子代也带有此基因。与基因组上整合有肝脏特异性启动子ApoE和rtTA基因的转基因小鼠杂交后，得到子代F1小鼠。特定时问与DOX作用后，小鼠肝脏的免疫组织化学结果表明，TRE-HCV-C小鼠为丙型肝炎病毒核心蛋白的发病机制研究提供了一个良好的动物模型工具。【结论】成功制备了HCV-C转基因小鼠，可利用四环素调控系统来研究HCV中的C基因对小鼠的作用，为进一步建立四环素调控系统调控下表达HCV-C基因双转基因小鼠模型奠定基础．也是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。     

利用昆虫杆状病毒载体表达人碱性成纤维细胞生长因子

目的利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growth factor,hbFGF)基因进行表达,并检测重组蛋白的特异性及生物学活性。方法将人bFGF的cDNA克隆至杆状病毒转座载体pFastBacHTb中,并转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细菌DH10Bac中,获得重组Bacmid/bFGF;纯化DNA后,转染昆虫细胞Sf21,PCR鉴定重组病毒;进一步将重组病毒感染Sf21细胞,在Sf21细胞中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western bloting分析;MTT法检测表达产物的生物活性。结果重组Bacmid/bFGFDNA直接转染昆虫细胞得到重组病毒rAcV-Bac-bFGF,病毒滴度MOI值≈8。重组病毒在感染后48h开始出现一相对分子质量为23000大小的特异带,感染后72h蛋白量明显增加,96h蛋白量达到最大,120h蛋白量开始减少。在正常昆虫Sf21细胞的对照中未见该蛋白带。Western bloting显示目的蛋白条带与人bFGF抗体发生特异反应。MTT结果显示重组蛋白能明显促进3T3细胞的分裂增殖。结论利用杆状病毒表达系统可成功表达具有生物学活性的bFGF蛋白。