重组人骨形成蛋白2在皮肤成纤维细胞中的表达

目的构建人骨形成蛋白2(BMP2)的真核表达载体以探讨成纤维细胞表达BMP2的情况.方法构建携带人BMP2基因的真核表达载体pRK5-hBMP2,并将其转染CHO细胞、NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞后,采用RT-PCR方法检测人BMP2在mRNA水平上的表达.结果RT-PCR显示转染后的CHO细胞、NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞可以有效地转录BMP2 mRNA.结论含有人BMP2 cDNA的重组质粒pRK5-hBMP2转染正常人皮肤成纤维细胞后可以有效地表达BMP2.     

重组人骨形成蛋白2在皮肤成纤维细胞中的表达

目的 构建人骨形成蛋白2(BMP2)的真核表达载体以探讨成纤维细胞表达BMP2的情况。方法 构建携带人BMP2基因的真核表达载体pRK5-hBMP2，并将其转染CHO细胞、NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞后，采用RT-PCR方法检测人BMP2在mRNA水平上的表达。结果 RT-PCR显示转染后的CHO细胞、NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞可以有效地转录BMP2 mRNA。结论 含有人BMP2 cDNA的重组质粒pRK5-hBMP2转染正常人皮肤成纤维细胞后可以有效地表达BMP2。     

骨形态发生蛋白3基因转染成纤维细胞诱导成骨的实验研究

目的 通过基因转染方法，使成纤维细胞NIH－3T3细胞具有合成及分泌骨形态发生蛋白（BMP）、体内诱导新骨生成的能力。方法 定向克隆法将BMP3基因构建于PcDNA3表达载体，脂质体介导法转染NIH－3T3细胞，G418筛选获得稳定转化体，Northern印迹法检测转染细胞有无BMP3基因表达，免疫组织化学检测转染细胞内的BMP3蛋白合成，钙钴法染色不同时相的转染细胞碱性磷酸酶并作图像分析。将转染细胞注入裸鼠肌袋，观察注射后第4周诱导新骨生成情况。结果 转染细胞体外培养6周Northern印迹法检测到有明显的BMP3基因表达，免疫组织化学染色见转染细胞培养筛选5－8周后细胞浆内有染成黄色的BMP3蛋白质颗粒出现，图像分析蛋白质生成在转染后第6周达高峰。钙钴法碱性磷酸酶染色及图像分析示转染细胞内碱性磷酸酶明显高于同期对照组，两组间有显著性差异（P＜0．01）。被转染NIH－3T3细胞裸鼠肌袋诱导成骨实验见注射后4周注射部位有大量软骨细胞出现，并伴有骨小梁生成。结论 通过基因转染方法可以使NIH－3T3细胞具有合成及分泌内源性BMP的能力，合成及分泌的BMP具有良好的生物活性，肌袋实验具有诱导成骨作用。但是，由于基因治疗的某些不可控性因素，其安全性仍有待于进一步研究。     

含EGFP的人BMP2表达载体在人皮肤成纤维细胞中的表达

目的构建带加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的人骨形成蛋白2(hBMP2)真核表达载体,观察其在正常人皮肤成纤维细胞中的表达情况.方法构建携带hBMP2和EGFP基因的真核表达载体pcDNA3-hBMP2-IRES-EGFP(pcBE),将其转染NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞后,采用RT-PCR和免疫组化染色方法分别检测人BMP2和EGFP基因在mRNA和蛋白质水平上的表达情况.结果转染后的NIH3T3和正常人皮肤成纤维细胞均能转录人BMP2 mRNA和表达人BMP2蛋白,同时显示绿色荧光.结论pcBE真核表达载体可在正常人皮肤成纤维细胞内有效表达人BMP2蛋白,并以其荧光报告基因起示踪作用.     

分泌性hrCEMP1在NIH3T3细胞中的表达

目的:通过转基因技术建立稳定表达hrCEMP1的成纤维细胞株.方法:利用高效率的阳离子聚合物,将含有hrCEMP1编码序列的真核表达质粒pcDNA3.1-hrCEMP1转染入NIH3T3细胞中,用G418筛选获得稳定转染细胞株,以RT-PCR检测hrCEMP1基因转录,以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测hrCEMP1...     

稳定表达神经营养素-3的NIH3T3细胞建立及鉴定

目的：建立稳定表达NT3的NIH3T3细胞株，通过体外共培养实验观察其对耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响．方法：以阳离子脂质体作为载体，将携带有外源性基因NT3的重组真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3转染小鼠成纤维细胞，进行RT-PCR，Western-blot分析及免疫组化鉴定，并与耳蜗螺旋神经节细胞进行共培养实验．结果：得到抗G-418的阳性细胞克隆；RT-PCR的产物约为744 bp；Western-blot可见一清晰的蛋白条带，与NT3的蛋白分子量相符合．NT3免疫组化染色结果显示转染NT3-cDNA的NIH3T3细胞胞质呈棕黄色着色．NT3转染组细胞与耳蜗螺旋神经节细胞共培养2wk后，与对照组相比，耳蜗螺旋神经节细胞无明显减少．结论：成功建立了稳定表达NT3的NIH3T3细胞株；该细胞对耳蜗螺旋神经节细胞有很好的营养支持作用．     

NIH3T3细胞中前脑啡肽原基因的稳定表达

目的:利用重组逆转录病毒载体pLNCX2-pENK,研究pENK基因在NIH3T3细胞中是否能够稳定表达.方法:用pLNCX2-pENK转染病毒包装细胞PT67,其病毒上清液感染NIH3T3细胞,检测pENK基因是否整合人NIH3T3细胞基因组中并通过RT-PCR及放射免疫法检测基因表达情况.结果:病毒基因组整合到NIH3T3细胞基因组中,并检测到目的基因转录及蛋白表达.结论:用逆转录病毒载体能将pENK基因整合到靶细胞NIH3T3基因组中,且该基因能长期稳定表达,为慢性疼痛的进一步治疗奠定了基础.     

Gankyrin真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建Gankyrin基因的真核表达载体并转染NIH3T3细胞,获得稳定转染Gankyrin的NIH3T3细胞株,研究Gankyrin在真核细胞中的表达及功能。方法:通过RT-PCR方法从肝癌细胞SMMC-7721,中扩增获得人Gankyrin编码区基因,克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP上,利用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞,经G418筛选获得稳定表达的细胞克隆。RT-PCR检测Gankyrin转染细胞后的转录;荧光显微镜观察确定Gankyrin在细胞中的定位分布;MTT法测定Gankyrin对细胞生长、血清依赖性及对地塞米松诱导细胞凋亡的敏感性影响。结果:重组表达载体pIRES2-EGFP-Gankyrin构建成功。Gankyrin在NIH3T3细胞中获得了有效转录及表达,并在细胞核和细胞浆中均广泛分布。Gankyrin可以显著促进NIH3T3细胞的增殖,降低血清依赖性并提高对地塞米松致细胞凋亡的耐受能力。结论:建立了稳定表达Gankyrin的NIH3T3细胞株,为进一步研究奠定了理论基础。     

含EGFP的人BMP2表达载体在人皮肤成纤维细胞中的表达

目的构建带加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的人骨形成蛋白2(hBMP2)真核表达载体，观察其在正常人皮肤成纤维细胞中的表达情况。方法构建携带hBMP2和EGFP基因的真核表达载体pcDNA3-hBMP2-IRES-ECFP(pcBE)，将其转染NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞后，采用RT—PCR和免疫组化染色方法分别检测人BMP2和EGFP基因在mRNA和蛋白质水平上的表达情况。结果转染后的NIH3T3和正常人皮肤成纤维细胞均能转录人BMP2 mRNA和表达人BMP2蛋白，同时显示绿色荧光。结论pcBE真核表达载体可在正常人皮肤成纤维细胞内有效表达人BMP2蛋白，并以其荧光报告基因起示踪作用。     

人肽脱甲酰基酶基因真核表达载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建人肽脱甲酰基酶(HsPDF)基因的真核表达载体并转染NIH3T3细胞,研究HsPDF基因在真核细胞中的表达及功能。方法:通过RT-PCR从人宫颈癌细胞系HeLa中扩增获得HsPDF基因,克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-),利用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞,G418筛选建立稳定表达细胞系;RT-PCR检测转染后HsPDF基因的mRNA转录水平;MTT法测定转染后细胞增殖能力的变化;苏木精-伊红(HE)染色观察HsPDF对NIH3T3细胞形态的影响。结果:成功构建重组表达载体pcDNA3.1(-)-HsPDF。该载体被转染入NIH3T3细胞后,外源HsPDF基因获得了有效的转录与稳定表达。HsPDF显著促进NIH3T3细胞的增殖,并使细胞呈现出一定的恶变特征。结论:HsPDF基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达并表现出明显的生物学功能,为深入研究奠定了基础。     

稳定表达人骨形成蛋白2成纤维细胞的建立与鉴定

目的 探讨ＢＭＰ对细胞分化的调节作用,为ＢＭＰ基因疗法的建立提供依据。方法 构建了含有人ＢＭＰ２开放阅读框（１．２ｋｂ）的真核表达载体ｐＢＫ－Ｂ２利用脂质本转染方法将其导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞,通过Ｇ－４１８筛选获得了性细胞克隆,细胞原位杂交和免疫组化检测ＢＭＰ２基因的稳定转染及表达情况。结果 转染细胞内有ＢＭＰ２ｍＲＮＡ的转录及其蛋白的表达,结论：人ＢＭＰ２基因ＮＩＨ３Ｔ３细胞中得到稳定有效的方法。     

Effects of secretive bone morphogenetic protein 2 induced by gene transfection on the biological changes of NIH3T3 cells

Background Bone morphogenetic proteins (BMPs), which belong to the transforming growth factor beta superfamily, are powerful regulators of cartilage and bone formation. This study investigated the biological changes of NIH3T3 cells incubated with secretive BMP2 that was induced by gene transfection through transwell. Methods Eukaryonic expression vector (pcDNA3.1-B2) was transfered into NIH3T3 cells with Sofast™,a positive compound transfection agent. The positive cell clones were selected with G418. The cytoplasmic and extracellular expressions of BMP2 were determined by immunohistochemical stain and enzyme-linked immunosorbent assay. NIH3T3 cells were co-cultured with hBMP2 gene transfecting cells through transwell, and the ultrastructure, alkaline phosphatase activity and the expression of osteocalcin (the marker of osteogenetic differentiation) changes were observed. Results There were cytoplasmic and extracellular expressions of BMP2 in transfecting NIH3T3 cells. The ultrastructural changes, the high activity of alkaline phosphatase and the positive stain of osteocalcin suggested the osteogenetic differentiation tendency of NIH3T3 cells co-cultured with transfecting NIH3T3 cells. Conclusion Secretive BMP2 that is induced by gene transfection could promote the osteogenetic differentiation of fibroblast cells.     

稳定表达肝癌相关抗原HAb18G/CD147成纤维细胞株的建立及其意义

目的:探讨将HAb18G全长cDNA转染成纤维细胞NIH/3T3的可行性及其意义.方法:将含有肝癌相关抗原HAb18G全长cDNA的真核表达载体pcDNA3.0/HAb18G利用脂质体介导法转染小鼠成纤维细胞NIH/3T3,G418筛选建立稳定表达阳性克隆细胞株t3T3;利用流式细胞仪、间接免疫荧光染色方法鉴定目的蛋白转染情况;RT-PCR琼脂糖电泳、明胶酶谱分别从mRNA和蛋白水平检测转染前后HAb18G刺激3T3细胞分泌基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的情况.结果:利用脂质体介导法将HAb18G全长cDNA转染入成纤维细胞NIH/3T3,G418筛选,流式细胞仪分析、间接免疫荧光染色证实成功建立了稳定表达HAb18G的阳性克隆株;RT-PCR琼脂糖电泳证实t3T3细胞MMP-2、MMP-9 mRNA转录水平较未转染前增多;明胶酶谱表明t3T3分泌MMPs能力较未转染前增强.结论:HAb18G全长cDNA可以稳定转染成纤维细胞,并能从核酸和蛋白水平诱导基质金属蛋白酶高表达,具有其独特的生物学意义.     

hIGF-1基因转染对成纤维细胞增殖的影响

目的：探讨人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)基因转染对成纤维细胞增殖的影响。方法：用脂质体转染法将pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染鼠成纤维细胞NIH3T3,经G418筛选抗性NIH3T3细胞并继续培养4周,进行原位杂交和免疫细胞化学检测hIGF-1的表达,MTT方法和流式细胞仪检测NIH3T3细胞增殖能力。结果：转染pcDNA3.1-hIGF-1后的NIH3T3细胞内有大量hIGF-1 mRNA和蛋白质的表达;MTT检测显示转染pcDNA3.1-hIGF-1的NIH3T3细胞光吸收值增大,与未转染的NIH3T3细胞组比较,差异具有显著性(P<0.01);流式细胞仪检测显示转染组细胞,S期比例增加（59.3%）,G₁期比例减少（27.2%）。结论：pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染成纤维细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进成纤维细胞的增殖。