以包涵体形式表达的6B11卵巢癌抗独特型单链抗体的复性,？…

目的：探讨以细胞胞浆内包涵体形式表达的６Ｂ１１卵巢癌抗独特型单链抗体（６Ｂ１１ｓｃＦｖ）的复性，纯化及其活性，方法：重组质粒ｐＬ－６Ｂ１１ｓｃＦｖ转化大肠杆菌ｐｏｐ２１３６，温度诱导，以包涵体形式获高效表达。超声破碎细菌细胞得包涵体，用８ｍｏｌ．Ｌ＾－１尿素溶解包涵体后直接稀释复性，探讨复性条件并采用了ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层纯化复合蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析蛋白纯度     

卵巢癌抗独特型单链抗体6B11scFv/hGM-CSF融合蛋白质的表达及活性测定

目的：为提高卵巢癌抗独特型抗体的免疫原性，构建表达６Ｂ１１ｓｃＦｖ／ｈＧＭＣＳＦ融合蛋白质，并对其活性进行测定。方法：用ＤＮＡ重组技术，将以前构建的６Ｂ１１ｓｃＦｖＬｉｎｋｅｒｈＧＭＣＳＦ融合基因克隆至ｐＥＴ１６（ａ＋）表达载体，表达可溶蛋白质。用ＥＬＩＳＡ分析技术和细胞增殖试验测定融合蛋白质的抗体和细胞因子活性。结果：融合蛋白质实现可溶表达，能与ＣＯＣ１６６９单抗和小鼠抗人ＧＭＣＳＦ单抗特异结合，并能刺激ＧＭＣＳＦ依赖株增殖。结论：融合蛋白质保留了２种蛋白质的活性，为进一步研究其功能和临床应用提供基础     

卵巢癌抗独特型单链抗体6B11基因在大肠杆菌中的高效表达

目的制备在大肠杆菌中高效表达６Ｂ１１卵巢癌抗独特型单链抗体。方法采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）克隆技术,将６Ｂ１１ｓｃＦｖ基因克隆到原核高效表达载体ｐＫＰＬ３ａ上,重组子转化大肠杆菌ｐｏｐ２１３６,温度诱导表达;复性蛋白经二乙氨乙基琼脂糖快速离子交换层析纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶鉴定蛋白纯度;直接法和竞争抑制法ＥＬＩＳＡ检测其活性。结果６Ｂ１１ｓｃＦｖ以包涵体形式表达获高效表达;包涵体经溶解复性纯化,纯度达９５％以上;表达蛋白能与卵巢癌单抗ＣＯＣ１６６－９特异结合并能有效抑制卵巢癌抗原ＯＣ１６６－９与卵巢癌单抗ＣＯＣ１６６－９的特异结合。结论６Ｂ１１ｓｃＦｖ基因可在原核细胞中高效表达,表达产物经复性纯化后具有较好的免疫活性。     

包含体中单链抗体3H11的复性条件对抗体活性的影响

研究包含体中单链抗体的最佳复性条件，并探讨复性后单链抗体的保存条件。方法：将含抗胃癌单链抗体3H11（ScFv3H11）的包含体纯化后在不同温度、分批加入、不同的变性液和复性液体积比的条件下进行复性，用ELISA法检测活性。结果：在10℃复性的抗体活性是4℃条件下的3倍；变性蛋白的分批加入及变性液和复性液的体积比为1：50时，均可分别获得相对最佳活性；复性液是复性抗体的理想保存条件。结论：此复性条件可以应用于其他原核表达的重组蛋白的复性。     

6B11卵巢癌抗独特型单链抗体表达及序列分析

目的：克隆和表达６Ｂ１１卵巢癌抗独特型抗体单链可变区基因，并进行序列分析。方法：采用逆转录ＰＣＲ和基因重组技术，扩增并构建６Ｂ１１鼠抗独特型抗体单链可变区基因，重组至噬菌体表面表达载体，在大肠杆菌表达，并利用双脱氧末端终止法进行核苷酸序列分析。结果：阳性克隆表达产物与卵巢癌单克隆抗体ＣＯＣ１６６－９特异结合；ＤＮＡ序列分析表明重链和轻链可变区分属小鼠免疫球蛋白重链第Ｉ亚群和轻链第Ⅱ亚群。结论：自６Ｂ１１小鼠杂交瘤细胞成功地克隆表达了该抗独特型单链抗体基因，为进一步人源化改造，推进卵巢癌的免疫治疗奠定了良好基础。     

卵巢癌抗独特性单链抗体6B11基因在大肠杆菌中的高效表达

目的 制备在大肠杆菌中高效表达６Ｂ１１卵巢癌抗独特型单链抗体。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）克隆技术,将６Ｂ１１ｓｃＦｖ基因克隆到原核高效表达载体ｐｋＰＬ－３ａ上,重组子转化大肠杆菌ｐｏｐ２１３６,温度诱导表达,复性蛋白经二乙氨乙基琼脂糖快离子交换层析纯化,十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝腕鉴定蛋白纯度,直接法和竞争抑制法ＥＬＩＳＡ检测其活性,结果 ６Ｂ１１ｓｃＦｖ以包涵体形式表达获高效表达,包涵体     

卵巢癌抗独特型单链抗体6B11scFv／hGM—CSF融合蛋白质 …

目的：为提高卵巢癌抗独特型抗体的免疫原性，构建表达６Ｂ１１ｓｃＦｖ／ｈＧＭ－ＣＳＦ融合蛋白质，并对其活性进行测定。方法：用ＤＮＡ重组技术，将以前构建的６Ｂ１１ｓｃＦｖ－Ｌｉｎｋｅｒ－ｈＧＭ－ＣＳＦ融合基因克隆至ｐＥＴ１６（ａ＋）表达载体，表达可溶蛋白质，用ＥＬＩＳＡ分析技术和细胞增殖试验测定融合蛋白质的抗体和细胞因子活性，结果：融合蛋白质可实溶表达，能与ＣＯＣ１６６－９单抗和小鼠抗人ＧＭ－ＣＳＦ单     

卵巢癌抗独特型单链抗体诱导特异性体液免疫应答的动物实验研究

目的：用卵巢癌抗独特型单链抗体６Ｂ１１ｓｃＦｖ代替肿瘤抗原免疫动物，观察是否诱导动物产生特异性体液免疫反应。方法：将６Ｂ１１ｓｃＦｖ交联钥孔虫戚虫血蓝素，辅以弗氏佐剂反复免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，制备抗血清。采用间接法ＥＬＩＳＡ，竞争抑制ＥＬＩＳＡ及免疫流式细胞法分析抗血清特性。结果：经ＥＬＩＳＡ检测显示，由６Ｂ１１ｓｃＦｖ刺激产生的抗抗独特型单链抗体（Ａｂ３）能与６Ｂ１１ｓｃＦｖ和卵巢癌组织抗原ＯＣ１６６９特异性结合。竞争抑制ＥＬＩＳＡ表明，Ａｂ３能有效抑制卵巢癌单抗ＣＯＣ１６６９（Ａｂ１）与ＯＣ１６６９的特异性结合。免疫流式分析结果可见，Ａｂ３能与表达卵巢癌抗原的人卵巢癌细胞系ＯＶ１细胞表面结合而不能与无卵巢癌抗原表达的人宫颈癌细胞系ＨｅＬａ细胞表面结合。从以上结果可以证明Ａｂ３与Ａｂ１的抗原结合特性相同。结论：６Ｂ１１ｓｃＦｖ能代替卵巢癌抗原诱导动物产生特异性体液免疫反应，具有模拟抗原的作用，为６Ｂ１１ｓｃＦｖ作为卵巢癌抗独特型单链抗体疫苗的实际应用提供依据     

包含体中单链抗体3H11的复性条件对抗体活性的影响

目的：研究包含体中单链抗体的最佳复性条件，并探讨复性后单链抗体的保存条件。方法：将含抗胃癌单链抗体３Ｈ１１（ＳｃＦｖ３Ｈ１１）的包含体纯化后在不同温度、分批加入、不同的变性液和复性液体积比的条件下进行复性，用ＥＬＩＳＡ法检测活性。结果：在１０℃复性的抗体活性是４℃条件下的３倍；变性蛋白的分批加入及变性液和复性液的体积比为１：５０时，均可分别获得相对最佳活性；复性液是复性抗体的理想保存条件。结论：此     

卵巢癌抗独特型单链抗体诱导特异性体液免疫应答的动物实 …

目的：用卵巢癌抗独特型单链抗体６Ｂ１１ ｓｃＦｖ代替肿瘤抗原免疫动物，观察是否诱导动物产生特异性体液免疫反应。方法：将６Ｂ１１ｓｃＦｖ交联钥孔虫血蓝素，辅以弗氏佐剂反复免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，制备抗血清。     

抗人卵巢癌单克隆抗体COC183-B2重链可变区基因的体外扩增、克隆及序列分析

目的：分离抗人卵巢癌单克隆抗体ＣＯＣ１８３Ｂ２重链可变区（ＶＨ）基因并测定其序列。方法：用反转录ＰＣＲ扩增抗人卵巢癌单抗ＣＯＣ１８３Ｂ２ＶＨ基因，将其克隆入ＰＵＣ１９载体，重组子用Ｓａｎｇｅｒ’ｓ双脱氧链终止法测定序列，将序列与ＧｅｎｅＢａｎｋ及已发表的抗体序列比较。结果：ＶＨ基因全长３５４ｂｐ，属鼠免疫球蛋白重链混杂亚类（ｓｕｂｇｒｏｕｐｍｉｓｃｅｌａｎｅｏｕｓ），由种系基因的ＶＨ，Ｄｓｐ２．５及ＭＵＳＪＨ４重排而来。该ＶＨ基因序列已被ＧｅｎｅＢａｎｋ收录（ａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏＡＦ０４５０２３）。结论：该ＶＨ基因为抗人卵巢癌单抗ＣＯＣ１８３Ｂ２功能性重链可变区基因。     

大肠杆菌表达人IL-21融合蛋白的纯化和抗原性分析

目的 在大肠杆菌中表达人IL-21编码基因,并进行蛋白纯化和抗原性分析.方法 以经PHA刺激的人扁桃体细胞cDNA 文库为模板,经PCR获得IL-21全基因片段.测序确认后,分别设计含BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,经PCR获得IL-21成熟肽的编码基因.将此IL-21基因插入表达载体pGEX-4T-2,重组克隆经酶切与测序确认后转化大肠杆菌DH5α,进行IPTG诱导表达.经琼脂糖珠结合的纯化方法所得产物用Western Blotting作抗原性分析.结果 SDS-PAGE显示经IPTG诱导后的大肠杆菌DH5α表达与理论相符的条带,并获得了与理论值相符的纯化条带,在进一步的Western Blotting分析中发现表达的蛋白能与IL-2的单抗产生结合反应.结论 人IL-21编码基因克隆载体在大肠杆菌中成功表达,同时建立了该蛋白的琼脂糖珠纯化方法,通过免疫印迹实验揭示了原核表达的IL-21蛋白与IL-2之间结构的相似性.     

卵巢癌抗独特型抗体/hGM-CSF融合蛋白质对体外免疫细胞的刺激作用

目的：探讨卵巢癌抗独特型单链抗体６Ｂ１１ｓｃＦｖ／ｈＧＭＣＳＦ融合蛋白质（６Ｂ１１ＧＭ）作为肿瘤疫苗的可能性。方法：采用体外Ｔ细胞增殖试验,对６Ｂ１１ＧＭ刺激Ｔ细胞的能力进行测定,并用流式细胞仪对Ｔ细胞表型及ＡＰＣＭＨＣⅡ表达情况进行测定,测定了外周血单个核细胞经６Ｂ１１ＧＭ激活后对卵巢癌细胞系的非ＭＨＣ限制的杀伤活性。结果：６Ｂ１１ＧＭ及６Ｂ１１均能引起特异的Ｔ细胞增殖,但６Ｂ１１ＧＭ组的增殖明显高于６Ｂ１１组,以ＣＤ４＋增殖为主。６Ｂ１１ＧＭ能明显增加抗原提呈细胞（ａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｃｅｌ,ＡＰＣ）的ＭＨＣⅡ表达,使ＡＰＣ更有效地摄取抗原,激活非ＭＨＣ限制的杀伤活性。结论：６Ｂ１１ＧＭ能引起细胞免疫反应,作为疫苗具有良好的前景