RhoA/SRF信号通路介导Nelin诱导人血管平滑肌细胞表型转化

目的 探讨Nelin基因对人血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)表型转化的调控机制.方法 应用过表达慢病毒载体[Nelin-VSMC]及干扰慢病毒载体[LV-Nelin-SiRNA-VSMC]制备稳定转染的VSMC细胞模型,通过荧光定量PCR以及蛋白质印迹分析(Western blotanalysis,WB)等技术手段,观察Nelin蛋白过表达及表达抑制对人VSMC表型转化的影响及其调控机制.结果 Nelin-VSMC组细胞呈收缩表型,细胞细长,成“谷-峰”样生长,Nelin mRNA、Nelin蛋白和平滑肌分化标志蛋白平滑肌α-肌动蛋白(SMoα-actin)表达显著增加,同时SMα-actin相关调控因子-血清反应因子(SRF)入核转位,RhoA总蛋白表达上调,经Rho激酶特异性抑制剂Y-27632作用后,SRF在细胞核中表达显著减少,同时SMα-actin表达下调;LV-Nelin-SiRNA-VSMC组细胞呈合成表型,细胞体积变大,细胞极性消失,生长状态无序,Nelin mRNA、Nelin蛋白和SMα-actin蛋白表达显著降低,同时伴有SRF出核转位及RhoA总蛋白表达下调.结论 在体外培养的人VSMC中,Nelin依次激活SMα-actin蛋白相关调控因子RhoA和SRF引起SMα-actin表达增加,促进VSMC向收缩表型转换.     

Wnt信号通路调控细胞癌变的分子开关:T细胞因子

Wnt信号通路在调控胚胎发育和决定细胞命运方面具有重要作用。T细胞因子 (TCF)是Wnt信号通路中的关键信号分子 ,最初是作为淋巴转录因子被克隆发现 ,近来研究表明 ,T细胞因子家族成员在多种发育和分化过程中起关键的转录调节作用 (转录激活或转录抑制 ) [1] 。当缺乏Wnt信号时 ,TCF与转录抑制因子如Groucho蛋白、cAMP效应元件 (CREB)结合蛋白 (CBP)及C末端结合蛋白 (CtBP)结合 ,抑制靶基因的转录表达 ;然而 ,Wnt信号激活后 ,TCF与Wnt通路信号分子 β 连环蛋白 (β catenin)结合则发挥其转录激活功能。随着研究的深入 ,T细胞因…     

转录因子LAP反式激活α1(I)胶原基因在肝脏星状细胞中的表达

目的　了解激活的肝脏星状细胞 (hepaticstellatecell,HSC)中一种肝脏组织特异的转录因子 肝脏激活蛋白 (liveractivatorprotein ,LAP)在α1(I)基因表达调控中的作用。方法　采用链霉蛋白酶、胶原酶原位灌注、Nycodenz密度梯度离心分离大鼠HSC ,并进行体外培养使之活化。构建含人α1(I)胶原基因启动子片段 ( -80 4～ 14 5 2或 -80 4～ 2 2 2碱基 )的荧光素酶报告基因质粒。用构建的报告基因质粒与LAP表达质粒一起 ,用阳离子脂质体介导的方法 ,瞬时共转染激活的HSC细胞。α1(I)基因启动子的活性通过测定荧光素酶活性来确定。结果　构建的含α1(I)基因第一内含子片段的荧光素酶报告基因 (PGL3 col)比不含α1(I)基因第一内含子的报告基因〔PGL3 col( △intron)〕在HSC中有较强的表达 (荧光素酶活性为 3 15± 45U/mg蛋白与 2 2 0± 70U /mg蛋白 ,P <0 .0 5 )。瞬时共转染LAP表达质粒可明显增强PGL3 col及PGL3 col( △intron)报告基因在HSC中的表达 (荧光素酶活性分别为 5 87± 62U /mg蛋白与3 15± 45U /mg蛋白及 3 2 6± 5 2U/mg蛋白与 2 2 0± 70U /mg蛋白 ,两者比较 ,P <0 .0 5 )。 结论　LAP可以反式激活 (诱导 )α1(I)基因在活化的HSC中表达 ,在其转录调控中起重要作用     

Klotho基因超甲基化在硫酸吲哚酚诱导的血管平滑肌细胞成骨转化中的作用机制

目的从细胞层面探讨Klotho基因超甲基化在硫酸吲哚酚(IS)诱导的血管平滑肌细胞成骨转化中的作用和相关机制。方法体外培养人主动脉血管平滑肌细胞(HASMC),以IS按0、200、500、1 000μmol/L的浓度梯度干预6 d,采用茜素红染色观察钙盐沉积,Real-time聚合酶链式反应(PCR)和Western印迹检测平滑肌细胞肌动蛋白α(α-SMA)、smoothin、骨桥蛋白(OPN)、碱性磷酸酶(ALP)、核结合因子α1(Cbfα1)、Klotho和不同DNA甲基化转移酶(DNMT)的m RNA和蛋白表达水平,同时利用焦磷酸测序方法检测HASMC的Klotho基因甲基化率;在IS 1 000μmol/L组培养基中加入不同浓度梯度的5-氮杂脱氧胞苷(5Aza-2dc)进行干预,观察茜素红染色、各基因表达水平和Klotho基因甲基化率的改变。组间均数比较采用独立样本t检验,组间率的比较采用卡方检验。结果IS 1 000μmol/L组HASMC细胞外基质呈红色,细胞结节处浓染,为钙盐沉积染色阳性。IS可以下调HASMC的α-SMAm RNA和蛋白及smoothin表达水平,上调OPN、ALP的m RNA和蛋白表达水平,使HASMC逐渐丧失平滑肌细胞表型而发生成骨转化。与对照组比较,IS 200、500、1 000μmol/L刺激6 d可显著升高HASMC的Klotho基因甲基化率(9±1%与4±0.7%,t=5.38,P0.01;18±1.3与4±0.7%,t=6.92,P0.01;41±2%与4±0.7%,t=9.26,P0.001)。IS 500、1 000μmol/L可显著下调HASMC的Klotho m RNA和蛋白表达水平。同时IS 1 000μmol/L可显著上调HASMC的DNMT1 m RNA和蛋白表达水平。5Aza-2dc 10μmol/L干预可减轻IS诱导的细胞外钙盐沉积,上调α-SMA蛋白、smoothin表达水平并下调Cbfα1蛋白表达水平,同时减低HASMC的Klotho基因甲基化率(20±1%与41±2%,t=6.98,P0.01)、上调HASMC的Klotho蛋白表达水平。结论 IS可通过上调血管平滑肌细胞DNMT表达,启动Klotho基因超甲基化,进而下调Klotho基因转录和表达,诱导血管平滑肌细胞成骨转化。     

前列腺特异性膜抗原启动子增强子调控重组质粒的构建及鉴定

目的探讨前列腺特异性膜抗原(PSMA)启动子和增强子调控目的基因表达的前列腺细胞特异性，了解增强子增强转录效率的能力。方法采用PCR方法从前列腺癌细胞DNA中分别扩增PSMA启动子和增强子序列，先后克隆到含有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒载体，脂质体介导基因转染不同癌细胞并观察GFP在不同细胞的表达情况。结果成功构建质粒pEGFP—PS—MAPro和pEGFP-PSMAEP，转染结果显示PSMA表达阳性的LNCaP细胞中存在GFP的有效表达，且pEGFP—PSMAEP的调控转录能力较pEGFP—PSMAPro强20倍。结论PSMA启动子增强子调控GFP表达的重组质粒的构建证明该调控序列具有前列腺细胞特异性，增强子能够明显增强启动子的转录效率，增加了目的基因的表达水平。PSMA启动子和增强子的共调控可以保证基因表达的强度和细胞特异性，为前列腺癌基因靶向性治疗研究提供实验依据。     

人arresten基因的真核表达及其对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 真核表达人arresten蛋白,并观察其对血管平滑肌细胞体外增殖的影响.方法 用脂质体介导,将含有人arresten基因的重组质粒pSecTag2-AT转染COS-7细胞;应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染细胞目的 基因mRNA表达;收集浓缩转染48 h细胞上清液,Western blot检测目的 蛋白的表达.离体培养大鼠血管平滑肌细胞,用CCK-8法检测转染细胞上清液对平滑肌细胞体外增殖的影响.结果 重组质粒pSecTag2-AT转染的COS-7细胞有目的 基因mRNA的表达;转染细胞上清液中有arresten蛋白的表达.细胞体外增殖分析显示转染细胞上清液可显著抑制血管平滑肌细胞的体外增殖(F=40.154,P＜0.01).结论 真核表达的人arresten蛋白能有效抑制血管平滑肌细胞的体外增殖,为日后开展抑制血管新生内膜增生的基因治疗奠定了基础.     

端粒酶逆转录酶基因启动子调控FADD表达载体诱导人结肠细胞凋亡的研究

目的 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子调控Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)肿瘤细胞特异性表达载体,观察其对人结肠癌细胞凋亡的作用.方法 利用hTERT基因核心启动子和FADD基因片段,构建hTERT基因启动子调控FADD 的肿瘤细胞特异性表达载体.用脂质体转染法,将其分别转染人结肠癌细胞和正常细胞,观察人结肠癌细胞和正常细胞的端粒酶活性、细胞周期及凋亡.结果 hTERT基因核心启动子调控FADD 表达载体,在所检测的肿瘤细胞中具有明显的转录活性;而在正常细胞中则无明显的转录活性.Colon320细胞、LoVo细胞、SW480细胞与WI-38细胞凋亡率在不同转染时间比较,差异有统计学意义(P均<0.01).WI-38转染pLNCX-hTERT-FADD与pLNCX-hTERT-GFP在24、48、72、96、120h凋亡率比较,差异均无统计学意义(P均>0.05).结论 hTRET基因核心启动子具有肿瘤特异性,构建hTERT基因核心启动子调控FADD 表达载体可能是一种新的肿瘤治疗途径.     

核酶基因抑制肝癌细胞低氧诱导因子-1α表达的实验研究

目的 探讨靶向低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)核酶基因对肝癌细胞HIF-1α表达的调控.方法 采用脂质体介导的方法,将靶向HIF-1α核酶基因真核表达载体转染肝癌细胞Hep3B2,并予低氧条件诱导.于转染后48 h采用Western Blotting检测Hep3B2细胞中HIF-1α蛋白的表达水平;荧光报告基因方法检测HIF-1转录活性.结果 Hep3B2细胞低氧诱导后,HIF-1α蛋白表达水平、HIF-1转录活性增高(1.0±0.02),转染核酶基因400 μmol/L后48 h,Hep3B2细胞低氧诱导的HIF-1α蛋白表达水平明显下降,HIF-1转录活性下调(0.12±0.025,P＜0.05).结论 核酶基因可特异性抑制低氧诱导的肝癌细胞HIF-1α的表达,降低其转录活性.     

5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷联合吉西他滨对胰腺癌细胞株原钙黏蛋白8基因表达的影响

目的 研究5-杂氮脱氧胞嘧啶核苷(5-Aza-CdR)对胰腺癌细胞株Capan-2原钙黏蛋白8(protocadherin 8,PCDH8)基因DNA启动子甲基化的转录调控,以及联合吉西他滨对癌细胞生长抑制与凋亡的影响.方法 采用MTT法、流式细胞术检测5-Aza-CdR及联合吉西他滨对Capan-2细胞的抑制率与凋亡率.应用甲基化特异性PCR(MSP)、RT-PCR和Western blot的方法检测不同浓度5-Aza-CdR处理细胞前后PCDH8基因的甲基化状态、mRNA表达水平和蛋白表达水平.结果 5-Aza-CdR能使胰腺癌细胞Capan-2增长速度减慢,呈浓度依赖性,联合吉西他滨显著抑制细胞生长;5-Aza-CdR联合吉西他滨与单药组、对照组相比,可显著诱导细胞凋亡.不同浓度的5-Aza-CdR可逆转PCDH8基因在胰腺癌细胞Capan-2的甲基化,恢复mRNA表达水平和蛋白表达水平,并呈一定的浓度正相关.结论 5-Aza-CdR可有效逆转PCDH8基因在胰腺癌细胞株Capan-2的高甲基化状态,解除DNA高甲基化导致的基因沉默,重新诱导基因mRNA转录和蛋白表达,同时可抑制胰腺癌细胞生长,与吉西他滨有协同抗肿瘤作用.     

mitofusin-2对乳腺癌细胞RECK基因表达及MMPs活性的影响

目的 探讨线粒体融合素基因-2(mitofusin-2)对乳腺癌MCF-7细胞株中RECK表达及MMP-9,MMP-2活性的影响.方法 利用脂质体lipofectamine2000将构建的重组真核表达质粒pEGFPmfn2转染MCF-7细胞.RT-PCR检测细胞mfn2和RECK基因mRNA的转录水平;Weastem Blot法检测mfn2及RECK蛋白的表达;明胶酶谱试验检测转染前后MMP-9及MMP-2的活性.结果 转染pEGFP-mfn2质粒的MCF-7细胞可以稳定高表达Mfn2;RECK基因在转染空质粒组和未转染组细胞中无表达;转染mfn2基因后RECK基因mRNA转录及蛋白的表达显著升高,且MMP-9及MMP-2的活性显著降-低(P＜0.05).结论 mfn2基因可激活MCF-7细胞中RECK基因的表达,并显著抑制其MMP-9及MMP2的活性.该途径可能是mfn2基因抗肿瘤作用的新机制.     

丙型肝炎核心蛋白活化肝门部胆管癌细胞中NF-κB介导的信号转导途径

目的　研究丙型肝炎核心蛋白 (HCVC蛋白 )致癌作用的细胞内信号转导途径(STPs)。方法　将构建成功的HCVC基因重组真核表达载体pcDNAHCV C ,分别与环AMP反应分子 (CRE)、血清反应因子 (SRF)、血清反应分子 (SRE)、活化蛋白 1(AP 1)及核转录因子 κB(NF κB)重组表达质粒共转染肝门部胆管癌细胞株 (QBC939) ,通过检测转染后细胞内荧光素酶活性确定与HCVC蛋白作用的信号转导分子。结果　HCVC蛋白通过NF κB介导的STPs ,使荧光素酶比活性较正常对照增高 7倍 ;而HCVC蛋白并不能激活QBC939细胞中与 pAP 1、pCRE、pSRF和pSRE相关信号转导途径。随着 pcDNAHCV C转染量的增多 ,NF κB被活化的程度也升高 ,两者呈剂量依存关系。结论　HCVC蛋白活化肝门部胆管癌细胞中NF κB介导的细胞内信号传导途径。     

c-myc原癌基因与心肌损伤

c-myc原癌基因属早期表达基因,其转录和翻译产物作为第三信使调节靶基因的表达,调控细胞的生长、分化和 凋亡。c-myc基因表达与心肌损伤有密切关系,并在心肌损伤过程中表现出细胞类型特异性、刺激信号特异性和时间依赖性的 特点。     

转录因子NF-E2相关因子2-氧化反应元件通路在抗心肌再灌注损伤中的作用

背景 转录因子NF-E2相关因子2(Nf-E2 related factor-2,Nrf2)抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)通路广泛分布于机体心血管系统中,激活后可上调内源性抗氧化系统减轻心肌的氧化损伤. 目的 阐述Nrf2-ARE通路作为抗心肌缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,I/RI)的潜在靶点,并探讨其可能的保护机制.内容 Nrf2-ARE通路处于氧化应激、炎症反应的中心地位,介导编码抗氧化蛋白和二项解毒酶基因的基础表达和诱导表达;多种外源性化合物可以激活Nrf2-ARE通路,在转录水平上调节抗氧化蛋白及二项解毒酶基因的表达,增强内源性抗氧化系统的能力从而在减少氧自由基产生、抗炎症反应、减轻钙超载、抗心肌细胞凋亡等方面减轻心肌I/RI.趋向 激活Nrf2-A RE通路可为临床抗I/RI提供新的策略.     

c—myc原癌基因与心肌损伤

c-myc原癌基因属早期表达基因，其转录和翻译产物作为第三信使调节靶基因的表达，调控细胞的生长、分化和凋亡。c-myc基因表达与心肌损伤有密切关系，并在心肌损伤过程中表现出细胞类型特异性、刺激信号特异性和时间依赖性的特点。     

血管内皮生长因子重组腺病毒转染鼠骨髓基质细胞及其产物促内皮细胞增殖的研究

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子165(VEGF165)基因转染骨髓基质细胞(BMSCs)后对VEGF基因的转录、表达及其产物生物活性的影响。方法体外培养4只大鼠骨髓基质细胞,用携带VEGF165基因的重组腺病毒转染培养细胞;通过逆转录聚合酶链反应、免疫印记法和酶联免疫吸附法检测VEGF在转染细胞内的转录、表达和细胞外分泌情况;通过血管内皮细胞增殖实验测定转染VEGF165基因后的BMSCs培养上清中VEGF蛋白的生物活性。结果腺病毒介导VEGF165基因转染BMSCs后可以获得有效的转录及表达,其分泌于培养上清中的表达产物可明显促进大鼠主动脉血管内皮细胞的增殖(P<001),具有很强的生物学活性。结论腺病毒可安全、有效地转染BMSCs,VEGF165基因转染的鼠BMSCs可有效表达具有生物活性的VEGF蛋白。     

门静脉高压症患者肝外血管平滑肌细胞增生与c-myc基因表达的相关性研究

目的　研究门静脉高压症患者肝外血管平滑肌细胞增生与c mycmRNA表达的关系。方法　应用RT PCR和免疫组化法对 2 8例门静脉高压症患者的脾静脉、12例正常血管分别进行c mycmRNA和增殖细胞核抗原 (PCNA)的检测。结果　门静脉高压症患者脾静脉PCNA蛋白表达阳性指数为 (2 9 8± 4 2 ) % ;c mycmRNA在PCNA蛋白表达阳性组和阴性组分别为 (7.6 1± 1 0 4 ) %和(3 82± 0 92 ) % ,正常对照组血管中PCNA蛋白无表达、c mycmRNA表达为 (1 0 4± 0 2 1) % ,两者同时与对照组比较 ,差异有显著意义 (P <0 0 1)。结论　c myc基因是门静脉高压症患者肝外血管平滑肌细胞增殖的起动基因 ,门静脉血流动力学紊乱激活脾静脉壁平滑肌细胞中原癌基因 ,促使血管平滑肌细胞增殖、迁移和表型改变 ,导致脾静脉血管重塑 ,使血管对缩血管物质反应降低。     

PKD1基因对主动脉平滑肌细胞自噬的影响

目的阐明多囊肾病基因1(PKD1)对小鼠主动脉平滑肌细胞自噬的影响。方法构建PKD1基因的shRNA慢病毒干扰及PKD1基因促进剂ETS-1慢病毒过表达载体,转染小鼠主动脉平滑肌细胞,采用实时荧光定量核酸扩增(qPCR)检验干扰及过表达效率。同时通过qPCR及Western blotting检测对照组、shPKD1组及ETS-1组小鼠主动脉平滑肌细胞自噬标志分子Atg5、Beclin1和LC3的表达水平。结果与正常对照组相比,shPKD1组PKD1 mRNA表达量下降(P<0.05),而ETS-1组ETS-1 mRNA及PKD1 mRNA表达量明显升高(P<0.05)。与对照组相比,shPKD1组自噬标志物Atg5和Beclin1 mRNA表达水平明显降低(P<0.05),ETS-1组Atg5和Beclin1 mRNA表达水平明显升高(P<0.001)。与对照组相比,shPKD1组Atg5、Beclin1和LC3蛋白表达水平明显降低(P<0.05),ETS-1组Atg5、Beclin1和LC3蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论PKD1基因的表达能够影响小鼠主动脉平滑肌细胞自噬,即PKD1基因表达下调可抑制主动脉平滑肌细胞自噬,而PKD1基因过表达能够促进小鼠主动脉平滑肌细胞自噬。     

胃癌细胞中转录因子激活增强子结合蛋白4调控LINC01235的表达

目的:探讨转录因子激活增强子结合蛋白4(TFAP4)在胃癌中对LINC01235表达的调控作用。方法:通过生物信息学分析,获取TFAP4可在胃癌中调控的LINC01235。采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测在胃癌细胞中敲低TFAP4后LINC01235的表达变化。应用染色质免疫共沉淀(ChI...     

Kallistatin基因在大鼠阴茎海绵体中的表达研究

目的:探讨人组织激肽释放酶结合蛋白(kallistatin)在阴茎海绵体中的表达情况,为勃起功能调控和ED治疗寻找新的分子靶点。方法:采用qRT-PCR、Western印迹和免疫荧光技术检测kallistatin在大鼠阴茎海绵体组织的表达情况,同时检测主动脉中的表达水平进行对照。结果:qRT-PCR和Western印迹检测结果显示,Kallistatin mRNA和蛋白在大鼠阴茎海绵体组织中均有表达,且其表达水平与主动脉相比均无统计学差异(P>0.05);免疫荧光检测显示,Kallistatin表达于阴茎海绵体内皮细胞和平滑肌细胞,且定位于细胞胞质,与主动脉相比,两者间表达亦无明显差异(P>0.05)。结论:Kallistatin基因高表达于阴茎海绵体且定位于海绵体内皮细胞和平滑肌细胞内,提示kallistatin可能在海绵体内皮细胞和平滑肌细胞的细胞功能中发挥作用,从而参与阴茎勃起功能调控。     

p21saRNA真核表达质粒的构建及其在泌尿系肿瘤细胞中的功能

目的 构建可表达具有RNA激活功能的小分子双链RNA(dsRNA)真核表达质粒,并探讨其调控前列腺癌细胞株PC-3和膀胱癌细胞株T-24中抑癌基因p21 WAF1/CIP1表达的功能.方法 构建真核表达质粒dsRNAP21-pGenesil-1,并分别转染至PC-3和T-24细胞株,通过实时定量聚合酶链反应( Real-time qPCR)和Western blot检测p21mRNA转录水平和蛋白表达的变化.结果 测序结果证实目的表达质粒dsRNAP21-pGenesil-1构建成功,将其转染入PC-3细胞和T-24细胞中,Real-time qPCR检测p21基因分别被上调4.35倍和2.83倍,Western blot进一步证明在两种细胞株中p21蛋白表达水平的增加与p21mRNA水平的上调一致,且与对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 构建的dsRNAP21-pGenesil-1质粒具备在泌尿系肿瘤中上调抑癌基因p21表达的能力.