iNOS转基因在血管平滑肌细胞的表达

目的 研究逆转录病毒介导诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因在体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞（VSMC）中的表达。方法 通过脂质体介导的DNA转染法将PLXSNiNOS导入PA317细胞中；经G418筛选获得抗性克隆；用NIH3T3细胞测定病毒上清滴度；将病毒上清转染体外培养的VSMC；采用RT-PCR、Western blot检测VSMC内iNOS mRNA和蛋白的表达。结果 PLXSNiNOS转染体外培养的VSMC48h后，在VSMC内可检测到外源性iNOS mRNA和蛋白；而用PLXSN转染体外培养的VSMC48h后未能检测到外源性iNOS mRNA和蛋白表达。结论 逆转录病毒介导iN0s基因可高效转染体外培养的VSMC，并在细胞内表达iNOS蛋白。     

去C末端JAK3基因重组逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 :构建去C末端Jak3重组逆转录病毒载体 ,获得能稳定产生去C末端Jak3基因的重组逆转录病毒的细胞株 ,为利用去C 末端Jak3对白血病进行基因治疗的实验研究打基础。方法 :用限制性内切酶从质粒PcJak3(ΔC)中切出目的基因并从凝胶中回收该目的基因片段 ,连接到逆转录病毒载体PLXSN多克隆位点上构建重组逆转录病毒载体PLJak3(ΔC) ,通过转化感受态细菌后氨卞青霉素筛选、酶切及DNA测序鉴定 ;用脂质体LIPOFECTAMINE转染包装细胞PA317细胞并用G4 18筛选抗性细胞 ,转染的包装细胞包装出病毒粒子 ,同时用PCR方法检测PA317阳性细胞中是否插入目的基因片段 ;用该病毒感染靶细胞NIH3T3,G4 18筛选抗性克隆 ,检测出病毒滴度 ;经免疫沉淀 (IP)、SDS PAGE电泳、Westernblotting检测NIH3T3细胞中Jak3(ΔC)的表达情况。结果 :①重组逆转录病毒载体PLJak3(ΔC)酶切和DNA检序均表明已含有 2 796bp的Jak3(ΔC)基因 ;②转染的PA317阳性细胞经PCR扩增后得到与目的基因一致的片段 ;③病毒滴度为 1.2～ 2 .0× 10 4CFU/ml;④转染的NIH3T3细胞中表达出了Jak3(ΔC)蛋白 ,其分子量为 10 7KD。结论 :我们已成功构建了去C 末端Jak3重组逆转录病毒载体PLJak3(ΔC) ,并得到稳定产生病毒粒子的PA317细胞克隆 ,为利用Jak3(ΔC)对白血病     

重组载体pLNCX/iNOS的构建及其在NIH3T3细胞中滴度的测定

目的 :构建重组质粒pLNCX/iNOS。方法 :用PCR技术从pCMV/iNOS质粒中扩增出iNOS全长cDNA ,与逆转录病毒pLNCX构建重组质粒pLNCX/iNOS ;通过脂质体介导把重组质粒转染入包装细胞PA3 17中 ,经G418筛选出抗性克隆。通过NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果 :经过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定重组质粒构建正确。G418筛选出 16个抗性克隆 ,能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒。NIH3T3细胞测定病毒滴度为 2 .1×10 4CFU·ml-1。结论 :逆转录病毒载体pLNCX可有效地介导iNOS的转染     

携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达

目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清.     

葡萄糖激酶基因逆转录病毒表达载体及包装细胞系的构建及鉴定

目的构建葡萄糖激酶(glucokinase,GK)基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系,为将GK基因应用于糖尿病的基因治疗打下基础.方法质粒pCMV4-GKZ1经EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体PLX-GK,采用酶切及测序对重组体进行鉴定.而后脂质体转染PLX-GK至包装细胞PA317,检测培养上清病毒滴度,挑选滴度较高的稳定产毒细胞系并对其行PCR及免疫组化鉴定.结果构建了GK基因逆转录病毒表达载体PLX-GK,经酶切及序列分析证实目的基因插入位点和读码框架正确、无突变;建立了稳定产毒细胞系PA317/GK,其培养上清平均病毒滴度为6.8×105cfu/ml,最高为1.8×106cfu/ml,PCR及免疫组化证实GK基因整合入PA317/GK细胞基因组并有GK的表达.结论成功构建了携GK基因的逆转录病毒表达载体及高滴度的稳定产毒细胞系.     

表达mFasL的新型双顺反子逆转录病毒基因转移体系的建立

为建立表达小鼠 Fas配体 (m Fas L)的内部核糖体进入位点 (IRES)串联的双顺反子新型逆转录病毒基因转移体系 ,用基因重组技术将 m Fas L c DNA基因构建到 IRES双顺反子逆转录病毒载体 (PL XIN)中 ,脂质体法将此重组质粒 PL FIN和空载体 PL XIN分别转染包装细胞 (PA317) ,经 G418筛选出抗性包装细胞克隆 ,基因组 DNA PCR测定基因整合情况。并将抗性 PA317克隆培养上清感染小鼠成纤维细胞系 (NIH3T3) ,筛选出高滴度的 PA317细胞系 ;用流式细胞术测定筛选的 NIH3T3细胞目的基因表达状况 ;以抗性 NIH3T3和 Fas+Yac- 1细胞共培养法检测目的基因的生物学活性。筛选出 12个 PL FIN转染的 PA317细胞克隆中 ,最高产毒效价为 8.5× 10 5CFU(colony- form ing- unit) ;经此上清感染、筛选出的 NIH3T3细胞 ,高表达 m Fas L (阳性率高于对照组 5 2 .5 4% ) ;且能显著诱导 Fas+Yac- 1细胞凋亡 (凋亡率高于对照组 49% )。说明成功建立了表达 m Fas L 的双顺反子逆转录病毒基因转移体系     

带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体的构建

目的构建带有SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体.方法采用体外重组技术构建带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体,酶切、测序进行鉴定,脂质体介导转染PA317包装细胞,经G418筛选出抗性克隆,通过NIH3T3细胞测定病毒滴度.结果酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV40LT抗原基因,且为正向插入.NIH3T3细胞测定病毒滴度为1.3×106CFU/ml.结论成功构建了含SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体并包装出了高滴度的假病毒颗粒.     

葡萄糖转运蛋白-2逆转录病毒表达载体构建/包装及其鉴定

目的 构建葡萄糖转运蛋白-2(glucose transporter-2,GLUT-2)基因逆转录病毒表达载体及其稳定产毒细胞系,为新型"人工胰岛β细胞"的构建奠定基础.方法 质粒pCB7/GLUT2经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切,克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建成重组逆转录病毒表达载体pL-GLUT2-SN,经酶切及测序鉴定;转pL-GLUT2-SN至包装细胞系PA317,G418抗性筛选,检测上清病毒滴度,挑选滴度较高的稳定产毒细胞克隆行PCR及RT-PCR鉴定.结果 建立GLUT-2基因逆转录病毒表达载体pL-GLUT2-SN,经酶切及测序证实目的基因插入位点及读码框架正确;所建稳定产毒细胞克隆PA317/GLUT2,其最高病毒滴度达7.1×105 CFU/ml,PCR及RT-PCR证实GLUT-2基因整合入其中并稳定表达.结论 成功构建GLUT-2基因逆转录病毒表达载体及其稳定产毒细胞系,为"人工胰岛β细胞"的构建奠定了基础.     

TH基因逆转录病毒表达载体的构建及产病毒细胞系的建立

目的　构建含有鼠酪氨酸羟化酶 (TH)基因的重组逆转录病毒表达载体 p N2 ATH,建立 PA317产病毒细胞系。方法　将质粒 p GEM- 2上酶切下的 THc DNA片段与线性化的逆转录病毒表达载体 N2 A连接 ,克隆出重组逆转录病毒表达载体 p N2 ATH。把 p N2 ATH质粒转入 PA317包装细胞 ,通过 G4 18抗性筛选 ,NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,得到高滴度产毒 PA317/p N2 ATH细胞株 ,免疫组化测定细胞 TH表达。结果　重组质粒 p N2 ATH经酶切鉴定证明 THc DNA正向插入 N2 A表达载体中 ,PA317/p N2 ATH产毒细胞高效表达 TH。结论　成功地构建了重组逆转录病毒表达载体p N2 ATH,建立了 PA317/p N2 A产毒细胞株     

携EGFP基因的逆转录病毒包装细胞的分选和滴度测定

目的 探讨利用荧光激活细胞分选技术获得有效重组逆转录病毒包装细胞系的方法。方法 用脂质体介导pLEGFP转染PA317细胞,用荧光显微镜观察转染结果;依据EGFP荧光利用流式细胞仪的分选技术获得多克隆和单克隆源性的包装细胞,并利用PCR、RT-PCR对其鉴定;以NIH3T3为靶细胞,对其滴度进行测定。结果 荧光显微镜显示用脂质体介导的方法成功的转染PA317细胞,在4次连续流式细胞仪分选后得到了稳定表达的多克隆和单克隆源性的包装细胞。PCR和RT-PCR分别从多克隆和单克隆源性的包装细胞细胞基因组DNA以及多克隆和部分(6/8)单克隆源性的包装细胞培养上清中的重组逆转录病毒RNA中扩增出了插入的EGFP片段。滴度测定显示得到的包装细胞能够产生有效的病毒滴度。结论 荧光激活细胞分选技术是获得有效病毒滴度的包装细胞的有效方法。     

c-myb反义RNA重组载体构建及其包装细胞株的建立

【目的】构建反义c-myb重组逆转录病毒载体并建立其包装细胞株。【方法】采用RT-PCR方法,获取目的基因,通过TA克隆方法克隆入pUC19,再反向亚克隆入逆转录病毒载体pDOR中。采用DOTAP法将重组逆转录病毒载体转入包装细胞,以NIH3T3细胞为靶细胞测定产病毒滴度。【结果】序列测定结果与GenBank中序列一致。c-myb基因片段已定向克隆入pDOR。细胞转染表明,已形成稳定的包装细胞株PA317/pDOR-myb,产病毒滴度达5.2×104～9.5×104CFU/mL。【结论】成功构建了含有反义c-myb的重组逆转录病毒质粒,并建立其包装细胞株。     

含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK的建立

目的 :研究肿瘤的自杀基因疗法 ,建立含单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSVtk)基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK。　方法 :应用脂质体转移方法将逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,经G4 18筛选阳性克隆细胞后分别用PCR和扫描电镜检测HSVtk基因整合和病毒颗粒分泌情况。　结果 :逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,G4 18后筛选得到阳性克隆细胞 ,命名为PA317/TK。PCR检测PA317/TK细胞出现一特异性 4 0 4bp阳性条带 ,而PA317细胞没有扩增出相应条带。PA317/TK细胞经扫描电镜检测见其表面有颗粒状突起 ,其周围有许多呈团状的病毒颗粒。证实含HSVtk基因重组逆转录病毒存在于包装细胞中。　结论 :成功建立含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞     

NucleofectorTM与脂质体转染PA317细胞效率的比较

目的比较传统的脂质体转染技术与NucleofectorTM转染技术将pLXSN-CTLA4Ig-TRES2-EGFP重组质粒转染入PA317细胞的效率.方法分别用脂质体技术与NucleofectorTM转染技术将pLXSN-CTLA4Ig-IRES2-EGFP重组质粒转染PA317细胞,应用倒置荧光显微镜、流式细胞仪检测转染后PA317细胞绿色荧光蛋白表达情况及阳性细胞率,比较两种方法的转染效率.结果脂质体转染后4、8 h未观察到阳性细胞,转染后12 h阳性率为(0.59±0.2)%,转染后24 h阳性率为(4.39±2.43)%;NucleofectorTM转染技术转染后约4 h观察到阳性细胞,转染后12 h阳性率为(12.27±3.38)%,转染后24 h阳性率为(50.16±2.41)%.两者比较,在转染后12、24 h,后者阴性率显著高于前者(P<0.01).结论 NucleofectorTM技术与传统的脂质体技术比较,是一种具有转染速度快、效率高的新的转染技术.     

抗肝癌单链双功能抗体基因逆转录病毒表达载体的构建及包装

0　引言　人类基因治疗技术的迅速发展使越来越多针对先天性和获得性疾病的基因治疗方案进入临床试验 ,同时 ,逆转录病毒作为介导基因转染的载体也是目前基础和临床应用研究中最广泛使用的基因转移方法 [1 ] .迄今所掌握的研究资料表明 ,接受逆转录病毒介导基因治疗的患者中尚未发现因病毒感染导致的不良反应 .因此 ,我们选择改造的缺陷型逆转录病毒载体 p L XSN,将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因(s Fv- TNF-α)克隆至该载体 ,进行病毒包装并筛选具有高滴度感染性重组病毒产生细胞系的研究 .1　材料和方法1.1　材料　分泌型抗肝癌单链…     

317例华支睾吸虫病流行特征分析

目的探讨华支睾吸虫病的临床流行病学特征变化，为制定进一步的防治策略提供理论基础。方法于2010年收集哈尔滨医科大学人体寄生虫病研究所就诊的疑似患者875人．采用Kato—Katz方法和酶联免疫方法分别对受检者的1950份粪便样本和875份血清样本进行检测，同时收集患者的基本信息。结果受检者中华支睾吸虫感染患者317例，感染率为36．23％，该病的流行多为散发病例。男性感染率为39．94％．明显高于女性的26．36％，差异有统计学意义（P〈0．001）。感染率随年龄增长而上升，20—69岁人群感染率较高，其中40—49岁人群感染率最高（42．71％）。农村患者感染率（42．27％）高于城市（20．33％），反复感染患者常见，吃生鱼（虾）习惯具有最高的感染风险（0R=28．507）。结论华支睾吸虫感染率较高，揭示该病流行病学特征和风险因素，将为加速控制和消灭华支睾吸虫病提供依据。     

3 317名大学新生心理健康状况的调查分析

目的 了解中原工学院大一新生的心理健康状况.方法 采用大学生人格问卷(UPI)对3 317名大一学生进行测试.结果 ①大学生Ⅰ类学生的检出率是2.4%.②男生的心理健康状况明显差于女生.③理科学生的心理健康状况相对较好,工科学生的心理健康状况相对较差.结论 ①该校大学生的心理健康状况良好,但应加强对Ⅰ、Ⅱ类学生进行心理健康教育.②男生及工科学生应该是心理健康教育的重点.     

317株金黄色葡萄球菌耐药性分析

目的 分析金黄色葡萄球菌的临床分布及耐药现状,为临床抗感染治疗提供理论依据.方法 API系统鉴定细菌,采用纸片扩散法对金黄色葡萄球菌进行药敏试验,用头孢西丁纸片扩散法筛选耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA).结果 共检出金黄色葡萄球菌317株,其中MRSA有178株,甲氧西林敏感金黄色葡萄球茵(MSSA)139株.除青霉素、红霉素及克林霉素外,MSSA对其它抗生素均有较好的敏感性,而MRSA除对万古霉素、利奈唑胺、替考拉宁、呋喃妥因、氯霉素及复方新诺明敏感外,对其它抗生素均耐药.没有发现对万古霉素及利奈唑胺耐药的菌株.结论 MRSA多重耐药,应加强对其耐药率监测,有效地预防及控制其感染.     

绝经后阴道出血317例临床分析

绝经后阴道出血是妇科常见病 ,笔者对我院1990年 1月至 2 0 0 1年 1月门诊及住院的 317例绝经后阴道出血患者进行分析 ,总结报道如下。1　临床资料自 1990年 1月至 2 0 0 1年 1月 ,我院门诊及病房收治的全部绝经后阴道出血患者 317例 ,年龄 4 6～81岁 ,平均 6 3.4岁 ,绝经年限 1～ 36年 ,平均 14.6年。全部患者均经妇科临床、Ｂ超、宫颈刮片及阴道分泌物检查 ,部分患者行宫颈活检、分段诊刮或手术标本病理检查。2　结果2 .1　病因分析　 317例绝经后阴道出血检查结果见表 1。表 1　绝经后阴道出血原因分布原因例数 ( % )生殖器炎症 15 4( 4 …