人羊膜上皮细胞的分离、纯化及其生物学特性研究

目的 体外分离人羊膜上皮细胞并纯化,对体外培养的人羊膜上皮细胞的生物学特性进行相关研究.方法 取足月剖宫产的人羊膜组织,经胰蛋白酶、胶原酶和Dnase酶消化后,采用差异黏附法获得纯度高的羊膜上皮细胞,接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用HE染色法对培养细胞进行形态学观察,并采用免疫组化法检测细胞角蛋白CK7、CK8、CK18在体外培养的人羊膜上皮细胞中的表达.结果 经不同的消化酶消化和差异黏附法筛选后能获得纯度较高的人羊膜上皮细胞,在体外培养条件下人羊膜上皮细胞呈上皮细胞特有的铺路石样外观,并能连续传代8～10次,细胞角蛋白CK7、CK8、CK18在其胞浆中呈阳性表达.结论 人羊膜上皮细胞能在体外成功分离、纯化、培养并增殖,为人羊膜上皮细胞的进一步研究及其在细胞移植和组织工程中的应用奠定了实验基础.     

人羊膜上皮细胞的原代及传代培养

目的 建立体外培养人羊膜上皮细胞的方法,观察体外培养的羊膜上皮细胞的生物学特性.方法 取足月剖宫产术后羊膜,经胶原酶和胰蛋白酶消化后,获取的羊膜上皮细胞接种于含10%胎牛血清培养基中进行原代和传代培养,探索其合适的培养条件,用倒置显微镜观察培养的人羊膜上皮细胞体外生长的特征.用苏木精-伊红染色、扫描电镜和细胞角蛋白免疫组织化学染色的方法对培养细胞进行形态学观察和鉴定.结果 人羊膜上皮细胞可以在体外成功的培养传代,体外可连续传8～10代.体外培养细胞呈多角形,长满后呈上皮细胞特有的铺路石样外观.扫描电镜观察细胞表面有丰富的微绒毛.细胞角蛋白keratin单克隆抗体染色阳性.结论 人羊膜上皮细胞在体外可成功进行原代和传代培养,体外培养的人羊膜上皮细胞在一定时间内可维持增殖能力.     

人羊膜上皮细胞的分离、培养及鉴定

目的建立人羊膜上皮细胞分离、培养及鉴定方法。方法从足月分娩人胎盘剥离羊膜,采用胰蛋白酶消化法分离人羊膜上皮细胞（hAECs）,采用免疫细胞化学、免疫荧光染色及流式细胞术分析其表型特征,使用含表皮生长因子LG—DMEM培养基培养。结果采用低速旋转胰蛋白酶消化法从羊膜分离的hAECs数为（6．13±1．42）×10^7,份（n=12）,所分离的hAECs明显表达上皮细胞标志物角蛋白CK19,不表达间充质细胞标志物波形蛋白,不同程度地表达CD29、CD44和CD71。在表皮生长因子存在的条件下,hAECs生长增殖较快,培养至第6天细胞总数可增殖171倍。结论建立了人羊膜上皮细胞分离、培养及鉴定方法,hAECs具有上皮细胞的特异标志和间充质干细胞的某些表型特征。     

兔角膜缘和口腔粘膜上皮细胞羊膜种植及生物学特性研究

目的:研究兔角膜缘和口腔粘膜上皮细胞在羊膜上种植的方法及生物学特征.方法:将兔角膜缘上皮细胞分别种植于去上皮羊膜和完整羊膜、口腔粘膜上皮细胞种植于去上皮羊膜进行体外培养,对获得的复合组织进行组织学、超微结构观察和免疫组化检测.结果:两种上皮细胞在去上皮羊膜基底膜面都能黏附生长、增殖、汇合成片并分层,细胞表达角蛋白3.结论:兔角膜缘和口腔粘膜上皮细胞种植于去上皮羊膜获得的复合物具有分层的类角膜上皮结构,为解决眼表重建供体来源不足的矛盾带来了新的希望.     

人羊膜上皮细胞在纤维蛋白支架和细胞生长因子作用下的研究

目的：以纤维蛋白凝块为支架构建人羊膜上皮细胞（HAEC）生长模型,观察表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子β1（TGF-b1）对HAEC生长的影响.方法：在体外构建的纤维蛋白支架上培养HAEC,采用倒置显微镜、Giemsa染色和扫描电子显微镜观察HAEC的生长情况.采用TUNEL法检测EGF、bFGF和TGF-β1对纤维蛋白支架上HAEC凋亡的影响.结果：HAEC在构建的纤维蛋白支架上生长.EGF组和bFGF组HAEC凋亡较对照组明显减少（P＜0.05）,TGF-β1组HAEC凋亡较对照组明显增加（P＜0.05）.结论：HAEC能在构建的纤维蛋白支架上良好生长,EGF、bFGF可抑制HAEC凋亡,TGF-β1则促进HAEC凋亡.     

人羊膜上皮细胞干细胞特性及向胰岛素分泌细胞分化的研究

目的建立人羊膜上皮细胞(hAECs)的分离及培养方法,探讨其向胰岛素分泌细胞分化的能力。方法观察不同培养方法对hAECs生长倍增时间的影响以优化其培养体系;通过细胞免疫荧光法检测不同培养代数细胞多能干细胞的表面标记;通过体外添加诱导因子的方法,探讨诱导hAECs向胰岛素分泌细胞分化的潜能。结果在10 ng表皮生长因子培养下,hAECs可长期传代。hAECs表达胚胎干细胞表面标记如阶段特异性胚胎抗原4等;采用悬浮培养法诱导分化,可检测到胰岛发育、胰岛功能基因如胰腺十二指肠同源盒、神经源素3、同源异形盒转录因子6、胰岛素、胰高糖素的表达,免疫组化检测细胞可以表达胰岛素,并且随着外界葡萄糖浓度升高,胰岛素分泌显著增加。结论建立了人羊膜上皮细胞的分离和培养方法(不添加动物血清);在体外可诱导分化为胰岛素分泌细胞。     

人羊膜上皮细胞减轻肺损伤的研究进展

肺损伤可由多种因素引起,目前临床尚无特效的治疗方法改善患者的预后,运用细胞治疗疾病是目前各个医学领域研究的热点。间充质干细胞减轻肺损伤的作用在国内外许多研究中已得到证实,人羊膜上皮细胞(hAECs)是一类具有干细胞特性的细胞,与间充质干细胞相比具有来源丰富、低免疫原性、不涉及伦理问题等优点。该文就有关肺损伤治疗的现状及hAECs在减轻肺损伤的作用和机制的研究进展予以综述。     

人正常食管黏膜上皮细胞的纯化分离和传代培养

目的:探讨新的食管黏膜细胞的培养方法,以便能够获得大量细胞.方法:采用中性蛋白酶(Dispase)和胰酶先后消化从食管黏膜上分离上皮细胞,比较细胞在无血清培养基(K-SFM)和含100 ml/L胎牛血清的培养基中的细胞生长曲线和贴壁性;采用细胞角蛋白14、13(CK14,CK13)和波形丝蛋白抗体三者共同鉴定细胞.结果:细胞倍增时间在KSFM中为(51.5±11.5)h(n=3),而在含100 ml/L血清培养基中不能计算;在K-SFM中,贴壁细胞明显为高(P＜0.01);CK14阳性细胞百分率K-SFM组在不同时段均高,但两组内均随生长时间增加而减少;CK13阳性细胞则恰与其相反;两组中均未见波形丝蛋白阳性表达.结论:Dispase消化分离细胞,K-SFM作为培养基是食管鳞状上皮可靠的新培养方法.     

人羊膜上皮细胞对大鼠软骨损伤的修复作用

目的 探讨人羊膜上皮细胞(hAECs)对大鼠软骨损伤的修复作用及其调控机制。方法 采用酶解法消化分离hAECs,使用改良Hulth法建立大鼠骨性关节炎模型,将已造模成功的大鼠随机分为实验组和阴性对照组,另设空白对照组(健康大鼠)。实验组:注射100μlDMEM-F12(含1×10⁶个hAECs细胞);阴性对照组:注射100μl的DMEM-F12;空白对照组不做处理。治疗1个月后取膝关节软骨镜下观察,采用免疫组化染色检测Ⅱ型胶原蛋白(COL2)、金属基质蛋白酶抑制因子(TIMP)和金属基质蛋白酶(MMP)表达;采用Masson染色、番红固绿染色、ELISA检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、γ-干扰素(γ-IFN)、IL-6及IL-7含量;采用Western-bolt检测JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表达。结果 阴性对照组相比于空白对照组潮线模糊,软骨排列紊乱,软骨表面磨损严重;而实验组出现了明显的软骨增生,染色几乎完整着染,表层光整。阴性对照组血清及滑膜中TNF-α、IL-1β、γ-IFN、IL-6和IL-7含量均高于空白...     

人羊膜上皮细胞的体外培养及标记

目的 改良人羊膜上皮细胞的培养方法,检测生长特性,观察DAPI标记HAECs的效率。 方法 取足月剖宫产术后羊膜经胶原酶和胰蛋白酶消化获得上皮细胞。MTT法绘制细胞生长曲线、流式细胞仪检测细胞的生长周期,免疫组化对细胞角蛋白进行鉴定。并用DAPI标记,测1、2周荧光阳性率。 结果 培养的HAECs多角形,生长分为缓滞期、对数增长期和平台期,约80%处于细胞周期的静止期G0。细胞角蛋白keratin阳性表达。DAPI标记1周标记率为100%;2周细胞形态好,标记率不变,荧光强度减弱。 结论 本实验方法成功培养人羊膜上皮细胞。DAPI短期标记效果理想。     

胸腺素α1二聚体蛋白的克隆、表达、纯化及其生物学活性检测

目的：获得具有生物学活性的重组人胸腺素α1二聚体蛋白.方法：人工合成胸腺素α1二聚体基因,并将该基因克隆入原核表达载体pET-22b（＋）中.转化宿主细胞大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达重组Tα1②蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western Blot检测分析以及生物学活性检测.结果：Tα1②Mr约为6.3×10^3,与理论值一致.成功纯化了Tα1②蛋白,该蛋白具有与T1抗体特异性的结合能力并能刺激小鼠T淋巴细胞增殖.结论：成功地克隆、表达和纯化Tα1②蛋白;重组Tα1②具有与化学合成Tα1相同的功能并有更高的生物学活性.     

诱导人羊膜上皮细胞横向分化为肝细胞样细胞

目的:通过体外诱导分化实验,评价人羊膜上皮细胞(hAECs)向肝细胞样细胞分化的能力.方法:采用地塞米松(Dex),HGF,IGF等细胞因子联合诱导hAECs向肝细胞样细胞分化,诱导周期为2周,诱导过程中采用RT-PCR鉴定albumin(ALB),CYP1A1,CYP1A2,IGFR,c-met等肝细胞相关关键功能基...     

人子宫内膜腺上皮细胞的体外分离培养及纯化

[目的]优化子宫内膜腺上皮细胞的分离培养及纯化技术,以获得经济、数量多、活性好、纯度高的子宫内膜腺上皮细胞,为子宫内膜异位症的研究提供可靠的体外模型。[方法]采用复合酶重复消化、80目筛网单次过滤、低速离心、差时贴壁法处理。[结果]经诊断性刮宫获取的19例标本中,18例腺上皮细胞培养成活,1例失败;腺上皮细胞纯度高达94.2%。[结论]复合酶多次消化、80目筛网单次过滤、低速离心、差时贴壁法培养子宫内膜腺上皮细胞,可以获得经济、数量多、活性好、纯度高的细胞。     

重组人PD-1IgV融合蛋白的克隆、表达、纯化及生物学活性检测

目的:获得具有生物学活性的重组人PD-1IgV(rhPD-1IgV)蛋白.方法:人工合成PD-1IgV基因,并将该基因克隆入原核表达载体pQE-30中.转化宿主细胞大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达重组融合rhPD-1IgV蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析.结果:rhPD-1IgV的Mr约为15×103,与根据其氨基酸组成计算的理论值一致.成功纯化了rhPD-1IgV蛋白,并对其进行了复性和浓缩,且复性后的蛋白可与其配体B7-H1结合,显示出良好的结合活性.结论:成功地克隆、表达和纯化了rhPD-1IgV蛋白.     

人羊膜上皮细胞原代培养及肝细胞特异性蛋白的表达

目的 完善人羊膜上皮细胞(AECs)的原代培养技术,检测肝细胞特异性蛋白在AECs中的表达.方法采用胶原酶胰蛋白酶联合消化法分离获取AECs并进行原代培养.分别向培养液中添加10、20、40 ng/mL表皮生长因子(EGF)和10 ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),倒置显微镜观察细胞生长和增殖情况,从中选择最适宜AECs原代培养的细胞培养液.以培养液中未添加生长因子的原代培养细胞作为对照.将羊膜组织石蜡切片和AECs细胞爬片进行免疫组化染色,检测4种肝细胞特异性蛋白的表达,分别为白蛋白(Alb)、细胞角蛋白-18 (CK-18)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)和α-1-甲胎蛋白(AFP).结果 经胶原酶-胰蛋白酶联合消化法获得大量较纯的AECs,间杂少数间充质细胞.当细胞培养液中添加10 ng/mL EGF时,AECs生长和增殖速度显著加快,故最终选择添加10 ng/mL EGF配制细胞培养液.免疫化学染色显示,羊膜组织和体外传代培养的AECs中均有Alb、CK-18、AAT和AFP表达.结论 胶原酶-胰蛋白酶联合消化及培养液中添加10 ng/mL的EGF是AECs较为适宜的原代培养方法.人羊膜组织及体外培养AECs能表达肝细胞特异性蛋白,提示AECs具有肝细胞的部分生物学特性.