mGITRL真核表达质粒的构建及其在Lewis细胞中的表达

目的:构建含小鼠GITRL基因的真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,体外转染小鼠肺癌细胞株Lewis细胞。方法:利用PCR方法扩增mGITRL基因,克隆至pIRES2-eGFP载体,选择阳性克隆并进行序列测定。以电穿孔法转染Lewis细胞,通过G418筛选,获得稳定表达细胞株。结果:构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,基因测序与GenBank中发表的序列完全一致,体外转染Lewis细胞,经G418筛选,体外传代30代以上,RT-PCR及流式细胞仪检测该细胞株稳定表达mGITRL。结论:成功构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,并在小鼠Lewis细胞中稳定表达,为进一步研究GITRL的生物学功能提供研究基础。     

人TLT-2真核表达载体的构建及其在L929细胞株中的稳定转染

目的构建含有人TLT-2基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达TLT-2分子的L929转基因细胞株。方法运用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从健康人外周血单个核细胞（PBMC）的cDNA文库获得全长TLT-2基因,经过双酶切（XhoI和EcoRI）装入逆转录病毒表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染L929细胞,经G418抗性筛选,流式细胞术、RT-PCR及Western blot鉴定TLT-2分子的表达。结果构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/hTLT-2,建立了稳定转染TLT-2目的基因的L929细胞株。结论成功构建了TLT-2真核表达载体并获得了稳定转染该分子的转基因细胞,为进一步研究人TLT-2分子的生物学功能提供了物质基础。     

LyGDI真核表达载体构建及稳定转染A549细胞株的建立

目的构建Rho蛋白鸟苷解离抑制因子（LyGDI）真核表达载体并建立稳定转染A549细胞株。方法PCR扩增LyGDI基因片段,构建pEGFP-C1-LyGDI真核表达载体,经酶切、PCR、测序验证其正确性。脂质体法转染真核细胞A549,G418筛选建立稳定转染的细胞株,RT-PCR、免疫印迹检测稳定转染的细胞株。结果构建了真核表达载体并建立了稳定转染的A549细胞株,成功表达LyGDI蛋白。结论LyGDI真核表达载体成功构建及稳定转染A549细胞株的建立,为研究LyGDI过度表达对肿瘤侵袭性和转移的影响奠定了实验基础。     

鸟苷酸解离抑制因子-2 真核表达载体构建及稳定转染A549 细胞株 的建立

目的构建Rab蛋白鸟苷酸解离抑制因子-2(GDI2)真核表达载体并建立稳定转染A549细胞株。方法聚合酶链反应(PCR)扩增GDI2基因片段,构建pcDNA3.1-GDI2真核表达载体,经酶切、PCR、测序验证其正确性,脂质体法转染真核细胞A549,G418筛选建立稳定转染的细胞株。免疫印迹法检测稳定转染的细胞株。结果构建了真核表达载体并建立了稳定转染的A549细胞株,成功表达GDI2蛋白。结论 GDI2真核表达载体成功构建及稳定转染A549细胞株的建立,为研究GDI2过度表达对肿瘤侵袭和转移的影响奠定了实验基础。     

Rap2c基因真核表达质粒的构建与表达

目的：为了探讨Rap2c基因与肺癌发生的关系,克隆人Ras家族小G蛋白Rap2c的cDNA,构建其真核表达质粒并在人肺癌细胞株A549和H1299中表达。方法人骨肉瘤细胞株U2OS提取细胞总RNA,经逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）逆转录成cDNA,PCR扩增Rap2c,酶切后插入pcDNA3．1（＋）构建真核表达质粒 pcD-NA3．1（＋）-Rap2c,采用酶切及测序鉴定。重组质粒转染A 549和H 1299细胞,Western blot 检测其目的基因表达。结果双酶切及测序结果显示重组质粒pcDNA3．1（＋）-Rap2c成功构建,Werstern blot 检测到 A549和H 1299细胞有相应蛋白表达。结论成功构建人Rap2c基因真核表达质粒,为后续研究奠定了基础。     

辐射诱导表达载体pEgr-hTRAIL的构建及其对肿瘤细胞的体外诱导凋亡作用

目的：构建携带人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（hTRAIL）基因的辐射诱导表达载体pEgr-hTRAIL,并研究其在人肺腺癌细胞株A549中的表达及促凋亡作用。 方法：采用常规分子生物学方法构建表达质粒pEgr-hTRAIL,体外通过脂质体转染A549细胞,经G418筛选稳定转染细胞A549-shTRAIL,利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测目的基因的表达,采用Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒检测细胞早期凋亡。 结果：经限制性内切酶酶切鉴定pEgr-hTRAIL表达质粒构建正确;稳定转染细胞A549-shTRAIL的hTRAIL mRNA表达量明显增加;稳定转染细胞A549-shTRAIL的凋亡细胞百分数明显增加,是A549细胞的1.8倍（P<0.05）。 结论：成功构建pEgr-hTRAIL表达质粒,体外稳定转染细胞A549-shTRAIL具有明显诱导凋亡作用。     

利用RNAi技术抑制Bcl 2基因表达增强肺腺癌A549细胞放射敏感性

目的利用RNAi技术抑制Bcl 2基因的表达,观察其对肺腺癌A549细胞凋亡和放射敏感性变化的影响。方法构建Bcl 2基因的干扰质粒pBcl 2 siRNA,稳定转染人肺腺癌A549细胞,同时设立转染无意义链组、空载体组和未转染组。采用Real time RT PCR和Western blot方法, 观察Bcl 2基因在mRNA和蛋白水平表达的变化。采用流式细胞术和克隆形成方法,检测RNA干扰对A549细胞放射敏感性的影响。结果成功构建bcl 2 siRNA质粒,转染A549细胞,获得稳定转染细胞株A549/Bcl2 Ins;Bcl 2mRNA、 Bcl 2蛋白表达明显降低;A549/Bcl2 Ins凋亡率［（10.11±0.92）%］明显高于对照组,6Gy X线照射后凋亡率［（28.81±1.10）%］明显高于对照组及未照射组;A549/Bcl2 Ins的D0和Dq值分别为1.399和1.298,明显低于转染无意义序列细胞株A549/Bcl2 Neg(1.695和2.480)、转染空载体细胞株A549/SD (1.706和2.227)和空白对照细胞A549(1.816和2.777)。结论RNAi技术可以有效抑制肺腺癌A549细胞Bcl 2基因的表达,增强A549细胞对X线的放射敏感性。     

人生发中心激酶基因克隆及其转基因细胞的构建

目的克隆人生发中心激酶（GCK）基因,并构建含有该目的基因的pIRES2-EGFP重组质粒载体,获得稳定表达GCK分子的基因转染细胞。方法采用RT-PCR法从pCMV5-GCK质粒载体上克隆GCK基因,通过双酶切（BglⅡ,SalI）装入pIRES2-EGFP质粒载体中,脂质体法共转染HEK293细胞,24 h后加入G418进行筛选,挑选出能稳定表达GCK蛋白的HEK293细胞株。结果构建了用于表达的含GCK基因的pIRES2-EGFP质粒载体,继而经RT-PCR、Western blot检测筛选出稳定表达人GCK蛋白的HEK293转基因细胞。结论构建了含人GCK基因重组pIRES2-EGFP质粒载体和稳定表达人GCK蛋白的细胞株,为该基因功能的后续研究奠定了基础。     

人结核杆菌热休克蛋白65和Ag85A基因真核双表达质粒的构建和体外表达

目的构建人结核杆菌热休克蛋白65（Hsp65）与Ag85A基因的共表达载体pIRES-Hsp65-Ag85A,并检测其在体外的表达。方法利用聚合酶链反应（PCR）法及基因重组技术,以人结核杆菌基因组DNA为模板,扩增获得Hsp65与Ag85A的全长基因,并将其构建到真核表达质粒pIRES中获得共表达质粒pIRES-Hsp65-Ag85A。将该质粒转染Hela细胞,通过RT-PCR的方法检测目的基因的表达。结果经过测序证实重组质粒构建成功,该质粒在体外转染Hela细胞后可表达Hsp65与Ag85A两者的mRNA。结论成功构建了共表达质粒pIRES-Hsp65-Ag85A,该质粒能在人子宫颈癌细胞中表达。     

人骨形成蛋白-7真核表达质粒的构建及其在骨髓基质细胞的表达

目的 利用基因工程原理构建pIRES2-EGFP-hBMP-7真核表达质粒并检测其在Beagle犬骨髓基质细胞(BMSC)的表达.方法 利用DNA重组技术,将hBMP-7片段克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,EcoRⅠ单酶切、PCR及序列分析鉴定获得的重组质粒;脂质体介导的方法转染Beagle犬BMSC;免疫组织化学染色检测hBMP-7基因的表达.结果 hBMP-7被定向插入到真核表达载体pIRES2-EGFP中,转染BMSC 24h后可观察到转染的BMSC表达绿色荧光蛋白,48h后转染效率达到31%.免疫组织化学染色证实重组pIRES2-EGFP-hBMP-7在BMSC中的表达.结论 利用基因工程原理成功构建真核表达质粒pIRES2-EGFP-hBMP-7,并可在BMSC中表达.     

Construction of Eukaryotic Expression Vector of Human CC10 Gene and Expression of CC10 Protein in Lung Adenocarcinoma A549 Cell Line

Summary： A mammalian expression plasmid pcDNA3. 1-hCC10 was constructed and identified, then CC10 protein expression in A549 lung cancer cell line was detected. A 273 bp cDNA fragment was amplified from the total RNA of normal lung tissue by using RT-PCR and cloned into expression plasmid cDNA3. 1, and the recombinant plasmid was identified by employing double digestion restriction enzymes HindⅢ and BanH 1 and the cDNA sequence was assayed by the Sanger dideoxymediated chain termination method. The segment was then transfected into the A549 lung cancer cell line. The protein expression of CC10 was detected by immunofluorescence and Western blot. Our results showed that the cDNA fragment included the entire coding region （273 bp）. The re combinant eukaryotic cell expression vector of pcDNA3. 1-hCC10 was successfully constructed, and the sequence of the insert was identical to the published sequence. A549 cells line transfected with the pcDNA3. 1-hCC10 expressed high level of CC10 protein. The recombinant plasmid cDNA3. 1- hCC10 may serve as an effecnve tool for the study of tumorogenesis and tumor treatment.     

Rb94联合放疗对裸鼠肺腺癌皮下移植瘤的抑制作用

目的  观察人视网膜母细胞瘤基因（Rb94）对裸鼠肺腺癌皮下移植瘤的放射增敏作用及其机制。方法  将40只裸鼠分别皮下接种5×106个A549细胞,当肿瘤长至180mm3时随机分为8组,每组5只,即空白对照组、空白对照+射线组、脂质体组、脂质体+射线组、空载体组、空载体+射线组,每两组分别于肿瘤内注射PBS、脂质体、pIRES。另有转染Rb94基因组、转染Rb94基因+射线组,分别注射pIRES-Rb94。空白对照+射线组、脂质体+射线组、空载体+射线组、转染Rb94基因+射线组裸鼠瘤体内注射后加照一定剂量X线。观察肿瘤生长情况并计算抑瘤率,采用实时RT-PCR和Western bolt法检测瘤组织中Rb94基因的表达,Hoechst染色观察细胞凋亡情况,实时RT-PCR检测hTERT、Bcl-2mRNA的表达,免疫组织化学SP法检测细胞周期阻滞。结果  转染Rb94基因+射线组抑瘤率为95.84%,与转染Rb94基因组和空白对照+射线组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。结论  Rb94基因对裸鼠皮下移植瘤具有明显的抑制作用,联合射线抑瘤效果更好,其作用机制可能与Rb94基因引起细胞凋亡、G2/M期周期阻滞以及下调hTERT、Bcl 2 mRNA的表达有关。     

小干扰RNA特异性抑制肺肿瘤细胞A549中绿色荧光蛋白基因表达

目的：探讨绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)特异的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)对肺肿瘤细胞A549中的GFP基因表达的抑制作用，建立以真核表达载体释放生成特异基因siRNA的方法。方法：构建mU6启动子驱动的含有GFP特异siRNA的真核表达质粒，转染A549肺肿瘤细胞，观察共转染时不同剂量siRNA对GFP的抑制效应。结果：针对GFP核酸序列设计的特异性siRNA GFP-siRNA可有效抑制其表达，并当比例为1：1时效果最佳，而空质粒载体及无关RNAi无此效应。结论：以mU6为启动子的含特异RNAi的质粒可作为抑制特异基因表达的一种新的技术手段，并且为研究基因功能的一条有效途径。     

利用CRISPR/Cas9 系统构建稳定敲除CBX2基因的A549细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除CBX2基因的A549细胞系。方法:设计针对敲除CBX2的short guide RNA（sgRNA）,并克隆到载体PX459中。将测序正确的重组质粒转染到A549细胞中,利用嘌呤霉素筛选转染阳性细胞并分离得到5个单克隆细胞系,通过Western blot方法检测构建的细胞系中CBX2蛋白表达情况。结果:成功构建了靶向CBX2的CRISPR/Cas9重组质粒,筛选出的5个单克隆细胞系中CBX2蛋白表达水平均显著下降。结论:成功利用CRISPR/Cas9 系统构建了稳定敲除CBX2基因的A549细胞系。     

microRNA-21对肺癌A549细胞增殖和Smad7表达的影响

目的 探讨微小RNA-21 ( miR-21 )对肺癌A549细胞中Smad7表达的调控和对肺癌A549 细胞增殖的影响. 方法 常规培养肺癌细胞系A549,经脂质体转染miR-21模拟物和抑制物及阴性对照片段48 h后,采用Western blot、qRT-PCR法检测 Smad7 基因及蛋白的表达水平, MTT 法检测A549细胞增殖情况. 结果 转染miR-21 模拟物后Smad7的mRNA和蛋白表达量降低( P<0. 05 ) ,而转染miR-21 抑制物后Smad7的mRNA和蛋白表达量升高( P<0. 05 );MTT结果显示转染 miR-21 模拟物后细胞的增殖能力明显增强(P<0. 05),而转染miR-21 抑制物后细胞增殖能力明显减弱( P<0. 05 ). 结论 通过下调 miR-21 可提高 Smad7 的mRNA和蛋白表达,进而抑制A549细胞的增殖.     

RBM5 基因表达载体构建、稳定转染A549 细胞系的建立及功能的初步研究

目的：通过构建表达载体、建立稳定转染RNA结合基序5(RNA binding motif 5,RBM5)的A549细胞系, 初步研究RBM5基因过表达对A549 细胞增殖以及天冬-谷-丙-组氨酸盒多肽15[DEAH box polypeptide 15,DHX15]表 达的影响。方法：应用分段克隆法构建pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体;将测序验证后的重组质粒pcDNA3.1(+)/ RBM5转染肺腺癌A549细胞并以G418进行筛选,采用Western印迹鉴定RBM5基因过表达阳性细胞,流式细胞仪分别 检测经pcDNA3.1(+)/RBM5稳定转染的A549细胞[pcDNA3.1(+)/RBM5-A549]及pcDNA3.1(+)空白质粒转染的A549细胞 [pcDNA3.1(+)-A549]的周期分布;运用RT-PCR技术分别检测pcDNA3.1(+)/RBM5-A549和pcDNA3.1(+)-A549细胞中剪 接相关因子DHX15的表达情况。结果：成功构建出pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体,筛选出RBM5基因稳定转染过 表达阳性细胞株;pcDNA3.1(+)/RBM5-A549较pcDNA3.1(+)-A549细胞处于G1期细胞比例增大、S期细胞比例减小(均 P<0.01);cDNA3.1(+)/RBM5-A549较pcDNA3.1(+)-A549细胞的DHX15表达上调(P<0.01)。结论：成功构建重组质粒 pcDNA3.1(+)/RBM5,并建立了RBM5稳定转染的A549细胞系;初步证实RBM5基因过表达可抑制肺腺癌A549细胞的细 胞周期,并使DHX15表达上调。     

F10基因真核细胞稳定表达系统的构建与鉴定

目的 检测葡萄胎发病新基因F10在人多种细胞系中转录水平的表达,从中选取F10低表达的细胞株,构建F10稳定转染的表达系统,研究F10的功能.方法 荧光定量PCR检测F10在人A549、16HBE、Bel7402、HIC、HepG2、293、PC、MGC细胞株中的表达差异.采用电穿孔介导基因转染技术将已构建的pRc-CMV2-F10、pRc-CMV2转染A549细胞系.经G418筛选获得阳性单克隆细胞.细胞扩大培养后,荧光定量PCR技术鉴定F10基因在阳性克隆细胞中的表达.结果 新基因F10在人的8种细胞系中呈不同程度的表达,其中在Bel7402、PC、MGC中呈高表达,在HepG2、HIC中表达次之,293中表达量较低,16HBE、A549中表达量最低;稳定转染细胞株A549具有F10基因的整合和相应mRNA的高表达.结论 成功构建了稳定表达外源新基因F10的肺癌细胞系,为进一步研究F10基因的生物学功能提供了实验材料.     

HSV1-TK逆转录病毒载体构建及表达

目的　构建含ＴＫ基因逆转录病毒载体并检测其在转染细胞中的表达,为肺癌基因治疗积累实验资料。方法从 ＰＨＳＶ１０６质粒中切下约２．４ｋｂ ＴＫ基因片段,插入逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ多克隆位点,酶切筛选正、反向连接质粒。正 向连接子电穿孔法转化肺癌细胞Ａ５４９,用ＰＣＲ、细胞原位杂交法分别检测ＴＫ基因整合和表达。结果　经酶切鉴定得到 正向连接子,电穿孔法转导Ａ５４９细胞,经Ｇ４１８筛选出了转基因细胞,ＴＫ基因已整合在转染细胞中并阳性表达。结论 成功构建了含ＴＫ基因逆转录病毒载体,转导该载体的肺癌细胞可表达ＴＫ基因。