HA-1树突状细胞核酸疫苗的构建及其特异性CTL的诱导

本研究以次要组织相容性抗原HA-1为靶点，构建HA-1树突状细胞核酸疫苗用于造血干细胞移植后抗白血病治疗。体外培养移植供者树突状细胞，用流式细胞术、混合淋巴细胞反应检测其免疫活性，通过电转法将HA-1基因转染树突状细胞，构建树突状细胞核酸疫苗。48小时后检测HA-1蛋白表达情况。将转染后的树突状细胞与同基因淋巴细胞共孵育诱导特异性CTL，应用LDH释放实验检测其体外杀伤活性。结果表明：经外周血单核细胞诱导的树突状细胞表达树突状细胞表型，能刺激同种淋巴细胞增殖。电转48小时后，Western blot可检测到HA-1蛋白表达。诱导的CTL体外杀伤活性高于对照组。结论：次要组织相容性抗原HA-1可作为造血干细胞移植后抗白血病治疗的靶点。     

肿瘤树突状细胞疫苗研究进展

肿瘤转变涉及肿瘤抑制基因、原癌基因和转录调节基因突变多步过程 ,从而导致细胞异常表达蛋白和增殖失调控。而在这一系列过程中肿瘤细胞又通过下列途径逃脱机体的免疫监视和清除 :(1 )肿瘤抗原缺陷 :肿瘤于克隆进化或初始阶段即下调表达或不表达其特异性抗原及MHC分子 ;肿瘤相关抗原(TAA)表达与机体正常细胞抗原交叉或肿瘤表达胚胎形成期抗原 ;抗原加工呈递过程缺陷 :弱表达TAA蛋白、淋巴细胞功能相关蛋白 (LFA 3)及细胞粘附分子 (ICAM 1 ) ;(2 )微环境异常 :肿瘤及周围细胞分泌免疫细胞抑制因子如IL 1 0、INF、前列腺素、NO、TG…     

树突状细胞疫苗诱导抗白血病免疫

白血病细胞可通过多种机制逃避机体免疫应答，树突状细胞(DC)作为功能最强的专职抗原递呈细胞，高表达MHC-Ⅰ类、Ⅱ类抗原以及B7-1／CD80、B7-2／CD86、ICAM-1等共刺激分子，能有效递呈白血病抗原，逆转机体对白血病抗原的耐受，启动特异抗白血病的T细胞应答。DC疫苗用于白血病传统化疗后的免疫治疗已成为清除微小残留病变和防止白血病复发的希望所在。     

白血病树突状细胞疫苗的研究进展

对于难治性、复发性和老年性的白血病来说,寻找新的治疗方法尤为迫切.免疫治疗的目的就是能够激活患者体内的免疫反应,从而特异性地识别和杀伤癌细胞.而树突状细胞(DC)为强有力的抗原提呈细胞.抗原与DC结合成为肿瘤主动特异性免疫治疗的重要手段之一.本文在DC来源、抗原加载、成熟、输入、佐剂以及此疫苗的前景和存在的局限性等方面进行综述.     

树突状细胞疫苗诱导抗白血病免疫

白血病细胞可通过多种机制逃避机体免疫应答,树突状细胞(DC)作为功能最强的专职抗原递呈细胞,高表达MHC-Ⅰ类、Ⅱ类抗原以及B7-1/CD80、B7-2/CD86、ICAM-1等共刺激分子,能有效递呈白血病抗原,逆转机体对白血病抗原的耐受,启动特异抗白血病的T细胞应答。DC疫苗用于白血病传统化疗后的免疫治疗已成为清除微小残留病变和防止白血病复发的希望所在。     

树突状细胞疫苗在胰腺癌免疫治疗中的应用研究

胰腺癌是具有高度恶性的肿瘤,早期诊断困难,传统治疗方法疗效差。由于手术切除率低,大多数病人就诊时已属晚期,根治性手术切除率仅为20%,术后5年生存率低于5%。肿瘤免疫治疗作为继手术、化、放疗等传统治疗后的新兴肿瘤治疗方法在现代肿瘤综合治疗中发挥愈来愈大的作用。肿瘤免疫治疗就是通过调动宿主的天然防卫机制或给予天然或基因工程产生的     

髓性白血病树突状细胞疫苗研究进展

树突状细胞（DC）是体内功能最强大的抗原提呈细胞,利用负载了白血病抗原的DC作为疫苗,将白血病抗原提呈给免疫效应细胞可以达到治疗白血病的目的。本文对近年在髓性白血病DC疫苗细胞来源、抗原负载方法、佐剂的使用、促进DC向淋巴结迁移及临床试验等方面研究进展做一综述。     

Survivin致敏的树突状细胞疫苗激活抗白血病T细胞的实验研究

为研究survivin致敏树突状细胞（DC）疫苗对特异性T细胞的激活影响及对白血病细胞生长抑制作用，采用共聚焦显微镜及免疫沉淀-Western印迹等方法检测急性白血病细胞survivin表达；外周血单个核细胞体外培养，诱导DC细胞的形成；体外进行survivin抗原负载，制备survivin DC疫苗；survivin DC激发同基因型T细胞，用流式细胞术进一步分析T细胞表型；^3H-TdR法测定刺激指数（SI）；并用^51Cr释放法测定特异性的抗白血病CTL细胞毒活性。结果表明，检测19例初治急性白血病患survivin的表达率为84.2％；其荧光分布均在细胞胞浆内；免疫沉淀-Western印迹进一步分析证实其survivin蛋白表达；外周血单个核细胞体外诱导形成的DC细胞具有典型的DC的形态学特征；survivinDC可显刺激T细胞的活化增殖；survivin激活的T细胞中，CD4^ TH比例显较DC组高，DC激发的T细胞则以表达CD8和CD56为主；同时survivinDC显抑制白血病细胞的生长。结论：急性白血病细胞表达survivin抗原，利用survivinDC疫苗可有效地抑制白血病细胞的生长，为DC治疗白血病开辟了一条新途径。     

树突状细胞疫苗治疗口腔鳞状细胞癌的研究进展

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinomas,OSCC)的治疗通常选择以手术治疗为主、放化疗相结合的综合治疗模式,使得肿瘤的局部控制率和生存率得到有效地提高.树突状细胞作为免疫系统递呈抗原能力最强的免疫细胞,利用肿瘤特异性抗原冲击树突状细胞制备的疫苗在治疗Ⅲ～Ⅳ期OSCC的研究和应用中取得...     

树突状细胞疫苗治疗恶性肿瘤病人的观察和护理

树突状细胞疫苗是目前国际上先进、有效的生物治疗技术，在临床应用中，针对其治疗过程的特殊性，总结出一套行之有效的护理方法，达到了既节约卫生资源、又达到较有效的护理效果和提高病人的生存质量的目的。     

存活蛋白重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞的表达

本研究旨在构建含有人存活蛋白(survivin)基因的重组腺病毒载体,并探讨其在转染树突状细胞中的表达。以质粒pcDNA3.0-survivin为模板,通过PCR扩增获得survivin基因全长序列。PCR产物回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒,获得重组质粒pShuttle-CMV-survivin。通过双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pShuttle-CMV-survivin转化E.coliBJ5183菌(含腺病毒骨架质粒)并进行同源重组,然后筛选阳性克隆,提取质粒,将此重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化,用脂质体LipofectamineTM2000介导转染293细胞。制备病毒上清并测定其滴度,将病毒上清转染树突状细胞,应用Westernblot方法分析survivin的表达。结果表明成功构建了含有人survivin基因的重组腺病毒,病毒滴度为2.65×109pfu/ml。Westernblot鉴定显示,经重组腺病毒转染的DC可有效表达survivin。结论含survivin基因的重组腺病毒载体的构建成功,为下一步开展抗白血病免疫研究奠定实验基础。     

突变的erbB-2基因在树突状细胞中的表达

树突状细胞属于白细胞系,其功能为捕捉抗原并将该抗原呈递给T淋巴细胞而引发免疫应答。本研究在包装细胞中克隆了一个突变的erbB-2基因,并将该基因导入到CD34~ 来源的树突状细胞中。经检测,该基因失去了致癌性,不能转化NIH3T3细胞,但能表达较高水平的突变蛋白,组化染色和流式细胞术都确证了这一点。经基因修饰的树突状细胞将在乳腺癌的免疫治疗中具有潜在的应用价值。     

用基因组DNA制备独特型抗淋巴瘤核酸疫苗的实验研究

本研究观察从人B细胞淋巴瘤细胞系基因组DNA及RNA分别构建的表达载体作为核酸疫苗诱导小鼠产生抗肿瘤免疫反应的情况。分别提取人B淋巴瘤细胞系Namalwa细胞的基因组DNA及RNA，将免疫球蛋白重链可变区（IgHV)基因片段克隆到pcDNA3.0真核表达载体中作为独特型核酸疫苗，其中DNA 核酸疫苗用LipofectAMINE转染COS细胞，多面手用RT－PCR观察转录及剪接的情况。两种不同来源的核酸疫苗分别肌内注射免疫小鼠后，用间接免疫荧光法检测抗独特型抗体的生成。结果发现，基因组DNA来源的核酸疫苗在COS细胞中能成功地转录，转录产物大小为477bp，其中86bp的内含子区域被剪接；两种疫苗免疫动物后均可诱导针对Namalwa细胞特异的抗独特型抗体，并于第6周达高峰。结论提示，淋巴瘤基因组DNA和RNA来源的IgHV基因片段均可制备核酸疫苗，能诱发小鼠产生抗淋巴瘤免疫反应。     

构建IL-2优化的免疫球蛋白抗淋巴瘤基因疫苗

本研究构建白介素2（IL-2）基因与免疫球蛋白重链可变区（IgHV）基因共表达的基因疫苗。从淋巴瘤患者外周血获得免疫球蛋白基因IgHV片段，将其与IL-2基因连接后形成的融合基因克隆到真核表达载体中。表达载体通过脂质体转染COS细胞，用ELISA法检测IL-2的表达。结果显示：本研究成功构建了IgHV基因与IL-2基因的融合基因表达载体。在IgHV-IL-2／pcDNA3．0中IL-2可以获得正确表达。结论：本研究构建的IL-2和IgHV的融合表达载体可以在COS细胞中分泌表达IL-2。     

树突状细胞肿瘤疫苗的制备及临床应用面临的问题

树突状细胞(DC)是目前发现的功能最强的抗原呈递细胞，其在肿瘤免疫临床治疗中的应用受到越来越多的关注。目前，通过各种方法提取肿瘤抗原来冲击致敏DC，再将已培养成熟的DC回输到病人体内，以激发机体产生明确的抗肿瘤免疫应答，已成为有效的临床抗肿瘤治疗手段，也为肿瘤临床继手术切除、放化疗及其它综合治疗后又开辟了一个新的治疗途径。本文就DC的生物学特性、体外培养及其临床应用作一综述。     

树突状细胞外泌体免疫作用机制的初步研究

为了研究外泌体（exosome）作为肿瘤疫苗刺激免疫应答作用的机制，从正常人外周血单个核细胞诱导树突状细胞（DC）制备负载肿瘤抗原的DC外泌体（Dex），研究其在DC有无或DC成熟状态不同的情况下刺激T细胞增殖的能力；通过实验阻断DC外泌体上一些分子（CD11a、CD11b、CD11c、CD54、MFG-E8及CD83）后检测外泌体免疫学功能的改变；采用共聚焦显微镜检测DC对外泌体的吞噬作用，用流式细胞仪检测阻断外泌体表面分子对DC吞噬外泌体作用的影响。结果表明：在无DC存在或未成熟DC存在的情况下未成熟DC外泌体（imDex）和成熟DC外泌体（mDex）均不能有效地激活T细胞；不同的促成熟因子（LPS、TNF-α、CpG、CD40L）诱导成熟的DC所分泌的外泌体在数量上无明显差别，但在功能上有显著差异；Dex表面分子CD11a、CD11b、CD11c、CD54、MFG-E8及CD83与其功能有关，阻断这些分子均能不同程度地抑制Dex对T细胞刺激的作用；共聚焦显微镜和流式细胞仪检测表明阻断CD11a、cD54抑制了Dex靶向DC及被DC吞噬。结论：外泌体可以通过其表面分子靶向DC进而引起T细胞免疫应答。     

人脐静脉内皮细胞抑制单核细胞源树突状细胞的产生

本研究旨在探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对树突状细胞(DC)发育的影响.首先,利用酶消化法从人脐带分离获得HUVEC,从细胞形态、表型和功能进行鉴定;进一步将获得的HUVEC结合细胞因子配伍与CD14+单核细胞共培养,检测HUVEC对CD14+细胞向DC分化的影响;流式细胞术检测分化细胞的表型,混合淋巴细胞反应检测分化细胞的免疫学功能;采用中和抗体实验和Western blot检测对细胞增殖和分化起重要调控作用的IL-6和VEGF以及ERK和p38MAPK通路的改变.结果表明,从脐静脉分离获得的细胞呈长梭形形态,细胞表型为vWF+ CD31+ CD73+CD45-HLA-DR-CD86-CD34low,Dil-Ac-LDL吸收实验为阳性,且细胞可诱导形成血管样结构,提示分离获得了HUVEC;进一步将HUVEC与CD14+单核细胞共培养,流式细胞仪检测结果表明HUVEC可抑制CD14+单核细胞向DC的分化,诱导获得的细胞CD1a表达显著降低,混合淋巴细胞检测结果显示,与HUVEC共培养获得的DC刺激T细胞增殖作用显著降低,且具有剂量依赖性;中和抗体实验分析其可能的作用机制表明,IL-6和VEGF在CD14+单核细胞向DC分化过程中具有重要调控作用,Western blot检测结果说明其主要通过ERK和p38通路完成调控作用.结论:人内皮细胞参与DC的发育,且起到抑制作用.

Abstract：

This study was aimed to investigate the effect of human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)on dendritic cell(DC)development.First,HUVEC were isolated from human umbilical cord by collagenase digestion,and then the morphology,immunophenotypes and functions were identified.Furthermore,the HUVEC were cocultured with CD14+ monocytes under the cytokine condition for detecting the influence of HUVEC on differentiation of CD14+ cells to DC.The phenotype of dendritic cells derived from CD14+ cells was analyzed by flow cytometry,the immunoregulatory function of DC was tested by mixed lymphocyte reaction(MLR).The change of IL-6 and VEGF as well as EPK and p38 signal pathway were analyzed by neutral antibody experiment and Western blot.The results showed that HUVEC isolated from human umbilical cord were characterized by spindle-shaped morphology,homogenous immunophenotypes (vWF+ CD31+ CD73+ CD45-HLA-DR-CD86-CD34(low),Dil-Ac-LDL incorporation ability and forming capillary-like structures.Following stimulation with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)plus interleukin-4 (IL-4),HUVEC cocultures could inhibit the initial differentiation of CD14+ monocyte to DC.Interestingly,IL-6 and VEGF enhanced the suppression effect of HUVEC on generation of DC via activation of the ERK or p38 mitogen activated protein kinase pathway.It is concluded that HUVEC are involved in DC development and can suppress the differentiation of monocyte to DC.     

全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化为树突状细胞的实验研究

全反式维甲酸（ATRA）诱导APL细胞分化为成熟树突状细胞（dendritic cell，DC），目前国内外鲜见报道。本研究探讨全反式维甲酸与经典细胞因子共同作用诱导急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞分化为DC的可能性，为研制APL-DC疫苗提供新的方法。对初治APL患者骨髓单个核细胞及HL-60细胞株分别在完全培养液中培养，用经典细胞因子组合（GM—CSF、IL-4、TNF-α）共处理，ATRA只在实验组加用。观测细胞形态，检测DC免疫表型，测定上清液IL-12水平，观察MLR反应及CTL效应。结果表明：实验组所得细胞有较明显树突状突起，有APL遗传学特征，其CD1a、CD83、CD80、CD86、HLA—DR和CD1d表达及IL-12分泌水平明显增高，并具有明显的MLR反应及CTL效应，但在HL60-DC中，CD1a增加无统计学差异。结论：利用ATRA可以成功诱导APL细胞为成熟功能性DC，其介导的MLR及CTL效应明显。经ATRA组合诱导的树突状细胞CD1d表达明显增高，推测可能参与NKT细胞激活，具体机制需进一步研究。     

体外诱导人脐血树突状细胞介导T细胞抗白血病的细胞毒性效应研究

为了研究脐血淋巴细胞能否在体外培养成为特异性杀伤白血病细胞的杀伤性T细胞(CTL),联合细胞因子体外诱导脐血单个核细胞分化为树突状细胞(DC),再吞噬凋亡白血病细胞并将其抗原呈递给相同脐血的T淋巴细胞,得到杀伤性T细胞。用形态学及流式细胞术检测DC。CTL细胞的杀伤功能用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定。结果表明:12份脐血标本均可培养出形态典型的DC,DC的表面标志CD1a 、HLA DR 、CD86 、CD83 表达水平显著升高(P<0.05)。CTL可以杀伤未经培养的白血病细胞(效∶靶=50∶1对AML细胞的平均杀伤率为44.76±17.42%,对ALL细胞的平均杀伤率为8.50±4.25%),对相同患者缓解期的骨髓细胞杀伤率极低。结论: 在外体应用多种细胞因子刺激可诱导脐血单个核细胞分化成典型的DC;负载有白血病抗原的DC可诱导同一脐血的淋巴细胞生成白血病特异的杀伤性T细胞(CTL),所得CTL可特异性杀伤未经培养的白血病细胞而不严重伤害相同患者缓解期的骨髓细胞。