幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组载体的构建及鉴定

目的以幽门螺杆菌外膜脂蛋白Lpp20为目的基因,构建H.pylori Lpp20基因的真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20,为H.pylori核酸疫苗的研制奠定实验基础。方法用Pri mer5.0软件分析GenBank中H.pylori外膜脂蛋白Lpp20基因序列,设计合成相应特异性引物,引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,以H.pylori26695株基因组为模板,PCR扩增Lpp20目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1( )多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1( )-Lpp20;通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体。结果以H.pylori26695株基因组DNA为模板扩增出特异的Lpp20基因片段,大小约为528bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcD-NA3.1( )-Lpp20。结论PCR扩增得到了大小约为528bp的H.pylori Lpp20目的基因片段;并成功构建了pcD-NA3.1( )-Lpp20真核表达重组载体。     

幽门螺杆菌Lpp20真核表达重组体的构建及其表达鉴定

目的构建含幽门螺杆菌（Hp）Lpp20基因的真核表达重组体,并鉴定其在Hela细胞中能否有效表达,为进一步开展Lpp20核酸疫苗与该蛋白的生物学功能的研究打下基础。方法抽提Hp标准菌株26695基因组DNA,应用聚合酶链式反应（PCR）技术从基因组DNA扩增Lpp20基因,经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pcD-NA3.1（＋）,转入大肠杆菌,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应鉴定;用脂质体法将构建好的重组载体pcDNA3.1（＋）-Lpp20转染Hela细胞,通过免疫细胞化学法及Western印迹法检测其在Hela细胞中表达的Lpp20蛋白。结果成功扩增出长约528 bp的Lpp20基因,测序结果表明扩增出的Lpp20基因与Hp Lpp20序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实Lpp20基因正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,并经免疫细胞化学法和Western印迹法检测到重组体可在Hela细胞中有效表达。结论成功构建了Lpp20基因的Hp真核表达重组体,并检测到其在Hela细胞中可表达出免疫反应性良好的蛋白,为进一步探索其免疫作用及生物学功能奠定了基础。     

幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体构建及鉴定

目的 构建幽门螺杆菌热休克蛋白GroEL基因的真核表达载体pcDNA3.0-GroEL,为幽门螺杆菌的基因疫苗研制提供参考依据.方法 提取幽门螺杆菌基因组DNA,PCR扩增GroEL基因,克隆至pMD19-T载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将GroEL基因片段用限制性内切酶切下,克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-GroEL重组质粒;采用PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-GroEL进行鉴定.结果 扩增出幽门螺杆菌GroEL基因片段约1 640 bp;pcDNA3.0-GroEL重组质粒经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,产生1个与GroEL基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-GroEL重组质粒的大片段,表明GroEL基因已成功插入pcDNA3.0质粒中.结论 成功构建幽门螺杆菌GroEL基因真核表达载体pcDNA3.0-GroEL.     

利用生物信息学分析幽门螺杆菌Lpp20蛋的化学和免疫学分子特征

目的分析幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)郑州分离株MEL-HP27Lpp20蛋白的主要化学和免疫学分子特征,为Hp基因工程疫苗和诊断抗原的研究奠定基础。方法根据本研究室克隆的HpMEL-HP27lpp20基因的核苷酸序列推导出该基因表达产物(Lpp20)的氨基酸序列,应用生物信息学软件Omiga2.0、Anthepro4.5和GenBank数据库对Lpp20分子的主要化学特征和抗原活性进行分析。结果MEL-HP27Lpp20蛋白的氨基酸序列长度为175aa,Lpp20蛋白的分子量为19.122kDa,等电点为9.950,pH7.0时带电荷为9.035,280nm摩尔消光系数为12210,280nm吸光度为0.639,具有2个有抗原活性的结构域。结论MEL-HP27Lpp20蛋白分子具有典型抗原分子的结构特征,有希望成为新的Hp疫苗候选抗原。     

幽门螺杆菌HspA乳酸菌疫苗构建及免疫反应性鉴定

目的探讨幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A(HspA)在食品级乳酸乳球菌NZ3900菌株中的克隆表达及免疫反应性。方法利用基因重组技术构建乳酸乳球菌重组子NZ3900/pNZ8110-hspA;绘制生长曲线,观察hspA插入对乳酸乳球菌重组子生长影响及乳酸链球菌素(Nisin)对重组子生长影响;采用钠十二烷基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)检测HspA在乳酸乳球菌中的表达;应用western-blot鉴定重组子表达HspA的免疫反应性。结果 成功扩增出幽门螺杆菌河南分离株(MEL-Hp27)的hspA基因,构建了hspA基因的乳酸乳球菌原核表达系统(NICE);细菌生长曲线显示hspA的插入未对乳酸乳球菌重组子的生长产生影响,除10 ng/mL Nisin对重组子生长影响较小外,20~100 ng/mL nisin对重组子的生长均有明显抑制;SDS-PAGE和Tricine SDS-PAGE检测均未观察到HspA条带;western-blot鉴定结果显示乳酸乳球菌表达的HspA抗原蛋白具有良好免疫反应性。结论 HspA在乳酸乳球菌中的少量表达影响重组菌生长。     

幽门螺杆菌尿素酶B在乳酸乳球菌中表达与优化

目的探讨幽门螺杆菌尿素酶B(UreB)在食品级乳酸乳球菌NZ3900菌株中的优化表达条件。方法利用基因重组技术构建乳酸乳球菌NZ3900(pNZ8110/ureB);采用L₂₅(5⁶)正交表设计,选定诱导剂浓度、诱导时机、诱导时间3个因素各5个水平;采用乳酸链球菌素诱导表达后,检测不同组合的UreB在乳酸乳球菌中的表达,凝胶扫描后用Genetools分析软件进行目的蛋白占细菌总蛋白比例分析;应用极差分析法比较影响蛋白表达的因素主次关系及目的蛋白优化表达条件;应用正交试验方差分析法进行方差分析。结果乳酸乳球菌重组子NZ3900(pNZ8110/ureB)表达的可溶性UreB蛋白最高可达27.26μg/mL,占上清总蛋白比例最高可达20.19%;3个因素对UreB蛋白表达量的影响大小依次为诱导时间、诱导时机和诱导剂浓度,方差分析结果显示,诱导时间对UreB蛋白表达的影响具有统计学意义(P<0.05)。结论应用正交试验法获得UreB蛋白在乳酸乳球菌中的优化表达条件,为进一步评价免疫预防抗幽门螺杆菌感染的效果奠定基础。     

载体介导的幽门螺杆菌疫苗的研制现状

幽门螺杆菌感染可引起胃炎、胃及十二指肠溃疡、胃黏膜相关淋巴瘤以及胃癌等疾病,采用疫苗防治该菌是当前研究的热点领域之一。尿素酶、热休克蛋白、胃幽门螺杆菌黏附素A、过氧化物酶、细胞毒素相关蛋白A、空泡毒素A和中性粒细胞激活蛋白等重组蛋白是几种有效的疫苗候选分子,本文综述了鼠伤寒沙门氏菌、双歧杆菌、耻垢分枝杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸乳球菌、根癌农杆菌、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、杆状病毒和腺病毒等载体介导的幽门螺杆菌疫苗的研制现状。     

胃癌组织Fascin蛋白和趋化因子L20表达与幽门螺杆菌感染相关性研究

目的近年来,胃癌在我国部分地区已经呈高发趋势,对人民群众的生命健康造成严重威胁。本研究旨在探讨胃癌组织中Fascin蛋白和趋化因子L20(chemokine L20,CCL20)表达与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)感染的相关性。方法选取2015-02-04-2018-01-09阳谷县人民医院病理科收集的90例胃癌组织标本及其癌旁组织标本,采用免疫组化染色技术检测Fascin和CCL20蛋白表达,分析不同TNM分期、肿瘤病灶大小、淋巴结转移、不同分化程度和是否发生HP感染的胃癌组织中Fascin与CCL20蛋白表达差异。结果胃癌组织CCL20蛋白阳性表达率为68.89%,高于癌旁组织的26.67%,差异有统计学意义,χ2=32.152,P0.001;Fasci蛋白阳性表达率为73.33%,高于癌旁组织的33.33%,差异有统计学意义,χ2=28.929,P0.001。不同TNM分期(χ2=6.192,P=0.013)Fasci蛋白阳性表达率差异有统计学意义;不同TNM分期(χ2=5.637,P=0.018)和是否发生淋巴结转移(χ2=7.677,P=0.006)胃癌组织CCL20蛋白阳性表达率差异有统计学意义;胃癌组织中CCL20蛋白表达(r=0.450,P0.05)和Fasci蛋白表达(r=0.600,P0.05)与HP感染呈正相关。结论胃癌组织中的Fascin、CCL20蛋白表达上调,并且与HP感染有相关性。     

幽门螺杆菌外膜36kDa蛋白重组表达、纯化及初步鉴定

[目的]构建幽门螺杆菌（H．pylori）NCTC11637菌株36kDa（OMP36）外膜蛋白基因原核表达系统，探索研制H．pylorl疫苗的新途径。[方法]培养和收集H．pylori NCTC11637菌株，提取基因组DNA，PCR扩增目的基因片断。将其克隆到T载体并测序，再将目的基因克隆入PET32a（＋），构建重组表达载体PET32a—OMP36。转化E．coli BL21后舢诱导表达，经SDS-PAGE鉴定、镍亲和层析纯化、Western blot检测表达蛋白。[结果]测序分析表明。插入的基因片断为987bp，表达的蛋白的相对分子质量（Mr）约为36kDa。并显示具有良好的抗原性。SDS—PAGE检测表明，表达量占细菌总蛋白的37％。镍亲和层析纯化率约92％。Western blot检测表达蛋白具有良好的抗原活性。[结论]成功克隆了外膜蛋白OMP36kDa的编码基因，其表达产物0MP36有望成为新的Hp疫苗候选分子，为H．pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

P22 VLPs载体多表位幽门螺杆菌疫苗的构建及表征分析

目的 利用生物信息学软件分析幽门螺杆菌主要抗原蛋白的T/B淋巴细胞表位,评估不同表位组合的抗原性与致敏性,预测优势表位组合与P22噬菌体病毒样颗粒（ VLPs）融合后的三级结构,构建基于P22 VLPs的多表位幽门螺杆菌疫苗。方法 利用IEDB数据库、NetMHCIIpan-3.2 和BepiPred 2.0在线工具对抗原蛋白的T/B淋巴细胞表位进行搜索和预测;利用VaxiJen v2.0、AllerTOP v2.0和ProtParam在线服务器分别对随机串联组成的不同表位组合进行抗原性、致敏性和理化性质进行分析;采用AlphaFold2、ProSA-web、RAMPAGE及ERRAT等软件对融合蛋白的三级结构进行预测、评估;构建P22 VLPs载体多表位幽门螺杆菌疫苗P22-C3,通过诱导表达及纯化获得疫苗实体;运用SDS-PAGE、透射电子显微镜和动态光散射技术对疫苗实体进行表征分析。结果 将筛选得到的高保守、非致敏优势抗原表位进行随机串联,获得了20个表位组合（C1-C20）,这20个表位组合均具有良好的抗原性和非致敏性。其中,表位组合C3不仅抗原评分高、理化性质稳定且预测的结构模型符合天然构象。将C3序列融合至P22 VLPs衣壳蛋白（Gp5）的C端,获得了基于P22 VLPs的幽门螺杆菌疫苗P22-C3。表征分析显示P22-C3较野生型的P22 VLPs,衣壳更厚,直径更大。结论 本研究通过多维生物信息学软件分析了不同Hp表位组合的理化特性和三维结构,成功构建了基于P22 VLPs的幽门螺杆菌疫苗,为疫苗后期的动物试验和I期临床试验奠定了基础。     

淮南地区矿工幽门螺杆菌vacA、cagA基因分布特征

[目的]研究淮南地区煤矿工人幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)vacA、cagA基因分布特征。[方法]选择经胃镜及病理组织检查诊断证实有相关胃、十二指肠疾病的349名矿工为研究对象,取其胃窦部活检黏膜作H.pylori的分离培养,利用聚合酶链反应技术(PCR)测定分离培养出H.pylori菌株的vacA、cagA基因,并进行分型。[结果]349份样本中共分离培养出244株H.pylori菌株,其中慢性胃炎、萎缩性胃炎、胃溃疡及十二指肠溃疡幽门螺杆菌培养阳性率分别为61.61%(69/112)、61.54%(48/78)、75%(72/96)及87.30%(55/63);基因测定结果显示,244株H.pylori菌株临床分离株中,84.84%(207/244)含vacA基因,73.36%(179/244)含cagA基因;其中慢性胃炎、萎缩性胃炎、胃溃疡及十二指肠溃疡cagA、vacA基因检出率分别为66.67%(46/69)、50.72%(35/69)、85.42%(41/48)和70.83%(34/48)与93.06%(67/72)、84.72%(61/72)、96.36%(53/55)和89.09%(49/55),4种疾病间差异均具显著性(P<0.01)。进一步分型发现,慢性胃炎、萎缩性胃炎,胃溃疡及十二指肠溃疡患者中vacA 、cagA 分别为44.93%(31/69)、66.67%(32/48)、79.17%(57/72)、87.27%(48/55),差异具显著性(χ2=30.80,P<0.01)。vacA 、cagA 菌株主要多见于损害较严重的胃黏膜表面,如萎缩性炎症、炎性坏死等,23例腺体不典型增生的胃黏膜表面均为vacA 、cagA 菌株。[结论]淮南地区矿工H.pylori感染多为vacA 、cagA 菌株,vacA 、cagA H.pylori菌株为高毒力菌株,且与较严重的胃黏膜病理改变有关,可能是导致矿工慢性胃炎、消化性溃疡的重要因素,临床应充分重视H.pylori菌株毒力因子的监测。     

幽门螺杆菌感染与胃癌组织nm23表达及其临床意义

为探讨胃癌组织幽门螺杆菌（Ｈｐ） 感染和ｎｍ２３ 表达及胃癌根治术后再发癌之间的关系,用Ｗａｒｒｔｈｉｎ－ Ｓｔａｒｒｙ方法检测胃组织Ｈｐ 感染,采用免疫组化Ｓ－ Ｐ法检测６４ 例胃癌组织ｎｍ２３ 表达,并结合内镜及随访资料进行分析。胃癌Ｈｐ 感染率、ｎｍ２３ 低表达率在淋巴结转移组及术后３ 年内有再发癌组明显增高。而且ｎｍ２３ 低表达与肿瘤浸润程度有关,浸及浆膜及周围脏器组ｎｍ２３ 低表达率为７８－６％ ,浸及粘膜及粘膜下者为４０－０ ％ （ Ｐ ＜０－０５） 。Ｈｐ 感染者ｎｍ２３ 低表达率明显高于Ｈｐ 阴性组。Ｈｐ 在胃癌发生、发展过程中起着重要作用。它可能通过影响癌基因蛋白的表达起促癌作用。胃癌ｎｍ２３ 低表达者具有较强的浸润转移能力,且术后易发生再发癌,ｎｍ２３ 表达变化对判断胃癌术后再发癌的发生及预后有重要意义。     

Expression of Helicobacter pylori urease subunit B gene in Lactococcus lactis MG1363 and its use as a vaccine delivery system against H. pylori infection in mice

The use of Lactococcus lactis as an antigen delivery vehicle for mucosal immunisation has been proposed. To determine whether L. lactis could effectively deliver Helicobacter pylori antigens to the immune system, a recombinant L. lactis expressing H. pylori urease subunit B (UreB) was constructed. Constitutive expression of UreB by a pTREX1 vector resulted in the intracellular accumulation of UreB to approximately 6.25% of soluble cellular protein. Five different oral regimens were used to vaccinate C57BL/6 mice and the immune response measured. One regimen, which consisted of four weekly doses of 10(10) bacteria, followed after an interval of approximately 4 weeks by three successive daily doses, was able to elicit a systemic antibody response to UreB in the mice, although subsequently, a similar regimen produced a significant antibody response in only one out of six mice. The other three regimes, in which mice were vaccinated with two or three sets of three consecutive daily doses of recombinant bacteria over 30 days, failed to elicit significant anti-UreB serum antibody responses. In three regimens, the immunised mice were then challenged by H. pylori strain SS1 and no protective effect was observed. These findings suggest that any adjuvant effects of L. lactis are unlikely to be sufficient to produce an effective immune response and to protect against H. pylori challenge, when used to deliver a weak immunogen, such as UreB.     

小鼠Calb2基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:为了体外研究Calretinin(Calb2)基因在生殖系统、神经系统、视觉传导中的作用,构建小鼠Calb2基因表达重组腺病毒载体.方法:用反转录聚合酶链反应( RT-PCR)方法,以小鼠Calb2 cDNA为模板,扩增Calb2基因.亚克隆后,将Calb2基因片段克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,...     

改进方案构建人糖皮质激素受体α基因正、反义重组逆病毒载体

目的构建人糖皮质激素α(hGRα)cDNA的表达重组体，为较大DNA片段的克隆提供借鉴，并为利用反义核酸技术探讨hGRα功能及其作用机制提供实验材料。方法L—PCR扩增hGRα cDNA，克隆至T载体；随后通过改进的连接方案进行亚克隆。结果限制性酶增和序列分析表明克隆及亚克隆成功。结论成功构建于hGRα cDNA的逆转录病毒载体pLXSN正义及反义重组子。     

胃幽门螺杆菌感染诊疗进展

1982年,澳大利亚学者首先从人胃黏膜中培养出幽门螺杆菌（Helicobacterpylori,HP）,并确定它与胃十二指肠疾病的发病有关。有关HP感染的诊断和治疗取得了很大的进展。HP是一种呈螺旋状或S形、微需氧的革兰阴性杆菌,专一性定居于人胃,是人类慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌和胃黏膜相关淋巴样组织（MALT）淋巴瘤的主要病因。HP在人群中的感染率非常高,而且一经感染,若不根除治疗,将终生携带,携带者是HP的传染源。HP感染的诊断方法分为两大类,侵入性和非侵入性。侵入性方法通过胃镜活检胃黏膜组织做细菌培养、组织病理学和快速尿素酶试验。非侵入性方法有血清学检查,13C、14C尿素呼气试验,聚合酶链反应（PCR）粪便HP抗原试验和尿液HP抗体试验等。HP相关疾病的治疗普遍采用2003年安徽桐城共识意见及2005年第4次全国HP学术会议上推荐的治疗方案。     

幽门螺杆菌的培养检测及药物敏感性测定结果分析

目的：探讨幽门螺杆菌培养检测法的适宜条件及其对常用药物的敏感性,为临床用药提供参考。方法：用改良Skirrow培养基对胃粘膜切除物行微氧培乔分离幽门螺杆菌;用K—B法进行7种常用药物的敏感性检测。结果：326份标本共分离出120株幽门螺杆菌,培养阳性率为36．8％;对左氧氟沙星、庆大霉素、克拉霉素、氨苄西林的敏感率分别为96．67％、95．00％、91．67％、87．50％,其他药物的抑菌活性较差,而甲硝唑的抑菌率最低,仅为51．67％。结论：左氧氟沙星、庆大霉素、克拉霉素、氨苄西林等抗生素可作为根除幽门螺杆菌的首选药物,但最好是联合用药。