反义技术及其抗病毒作用

反义技术(antisensetechnique)是指根据碱基互补的原理,用人工合成或生物体合成的特定互补的DNA或RNA片段(或其化学修饰产物)抑制或封闭基因表达的技术[1]。包括反义RNA(asRNA)、反义寡聚核苷酸(asON)和具有核酸特异性切割活性的核酶(ribozyme)等。近年来的研究表明,反义?..     

反义寡核苷酸技术研究进展

反义寡核酸技术，是应用反义寡核苷酸类药物通过Waston-Crick碱基配对与细胞内核酸（DNA或RNA）特异结合形成杂交分子，从而在转录和翻译水平抑制特定基因表达的基因治疗技术，是一种新的药物开发方法。其机制是：①反义寡核苷酸与靶mRNA结合形成DNA-RNA杂合分子，可以激活RNase H。该酶可以切割杂合分子中的RNA链，导致靶mRNA降解。②不能激活RNase H活性的反义寡核苷酸可以通过空间位阻效应阻止核糖体结合来抑制靶mRNA的翻译：另外还可以通过封闭剪接位点有选择的促进蛋白某个可变剪接体的表达，从而纠正错误的剪接。     

反义寡核苷酸在恶性肿瘤治疗中的作用及机制

反义（antisense）核酸技术的基本原理是根据Watson-Crick碱基互补配对规律和核酸杂交原理，设计出能与靶基因特定区域结合的互补寡核苷酸片段，与靶基因（DNA）或信使核糖核酸（mRN-A）的特定序列相结合，以影响靶基因的表达、抑制其功能，而其他基因的转录和表达则不受影响。封闭单个基因表达的反义的概念由Zamecnik和Stephenson首次描述，     

反义核苷酸抑制端粒酶活性与肿瘤的治疗

反义技术是根据碱基互补原则 ,用人工合成或生物体自身表达的特定序列的短片段核苷酸与靶基因或其ｍＲＮＡ配对结合 ,阻断靶基因表达的技术。自 1978年 ,Ｚａｍｅｃｎｉｃｋ等首次用反义技术抑制病毒基因表达获得成功后 ,其应用前景就日益广阔。现主要用于分子生物学基础研究 ,肿瘤、遗传病、病毒感染的基因治疗 ,动、植物品种的改良等。1　反义技术的基本作用机制[1]1 1　阻碍转录过程1 1 1　反义寡核苷酸渗入基因组特异区域 ,形成三股螺旋ＤＮＡ或环状ＤＮＡ。1 1 2　反义寡核苷酸对转录因子的圈套作用。1 2　阻碍翻译过程　反义寡核苷酸…     

mPLG—PGEM重组表达质粒构建及反义RNA探针的制备和标记

纤溶系统参与体内众多的与细胞外基质降解有关的生理及病理过程，如血栓形成／溶解，动脉粥样硬化、血管新内膜形成，排卵，组织重建，肿瘤转移等[1,2].PLG是纤溶系统的核心成分及功能分子[3]，因此研究PLG基因转录表达在某些生理及病理过程中的变化具有十分重要的意义。目前，用于基因转录表达的核酸探针主要分3种：DNA，反义RNA以及人工合成寡聚核苷酸[4,5]。反义RNA探针的特点是DNA－RNA、RNA－RNA杂交体的稳定性好，特异性强，灵敏度高，杂交信号强[6]，因而，在国外已得到广泛应用，国内则多采用人工合成的寡聚反义RNA探针…     

反义技术在体外净化中的应用

随着分子生物学的迅速发展 ,以基因治疗为主的新技术、新方法被广泛地引入自体造血干细胞移植物的体外净化。笔者介绍反义技术在体外净化中的一些研究进展。1　反义技术用于体外净化的作用原理大多数肿瘤是异常基因表达、正常基因表达下调或过度表达的结果。反义核酸的策略是将与癌基因或异常表达的正常基因互补的反义核苷酸 (DNA或 RNA)导入肿瘤细胞 ,与肿瘤细胞内相应的 DNA或 RNA结合 ,阻断癌基因转录和表达 ,从而阻止肿瘤细胞生长。例如 ,大多数慢性粒细胞白血病 (CML)患者存在有染色体易位 ,并表达为具有 CML 特异性的 bcr/abl…     

现代分子生物学技术系列讲座之四反义核酸技术

现代分子生物学技术系列讲座之四──反义核酸技术杜卫东（生物化学与分子生物学研究中心）反义核酸技术是利用人工合成的特异性反义寡核苷酸定向抑制或封闭同的基因（ＤＮＡ或ＲＮＡ）表达的技术。它包括三方面的内容：（１）反义及ＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡ），...     

细胞核内反义RNA和反义ribozyme——基因表达抑制新途径

近年来,新采用的反义技术已有细胞核内反义RNA和Antizyme。前者是指将反义RNA限制于细胞核内抑制靶基因原始转录子,以避免在细胞浆需抑制极其巨大数量的靶RNA,而起到把问题解决在萌芽状态的独特作用,这种模拟真核生物天然存在反义RNA封闭基因表达机制的高效方法,无疑开辟了一条抑制基因表达的新途径。后者是反义ribozyme,即ribozyme基因与反义RNA基因相连接,转录成具有ribozyme和反义RAN双重功能的一类RNA分子,实际上是基因剪刀和基因表达封条的联合体。目前,它在转基因植物研究方面,应用比较广泛。从研究进展、存在问题、发展对策和应用前景四方面评述细胞核内反义RNA和反义ribozyme是抑制基因表达的新途径。     

反义技术在心血管病方面的应用

反义核酸是指与体内某些ＲＮＡ或ＤＮＡ序列具有互补顺序，并能通过碱基配对与互补链杂交，从而影响其转录或翻译过程的ＲＮＡ或ＤＮＡ片段，通过反义核酸特异性抑制某些基因的表达，可能抑制由于癌基因的表达引起的血管平滑肌细胞增殖，抑制某些心血管病的发生与发展。近年来该领域的研究结果显示：应用反义核酸技术抑制血管平滑肌细胞的增殖将可能成为治疗心血管疾病的新途径之一。     

反义技术在造血系统疾病研究中的应用

<正> 反义技术是根据碱基互补的原理,用人工合成或生物体生成的与目标靶的DNA或RNA序列特定互补的短核苷酸片段,抑制或封闭基因表达的技术方法。反义技术能够较好地抑制和封闭目的基因的表达,干扰复制、转录和翻译,为肿瘤的基因治疗和基因功能的研究提供了强有力的工具。1978年,Zamecnik和Stephenson首次发现反义RNA能抑制Rous肉瘤病毒在培养细胞中的增殖,展示了反义核酸作为基因水平治疗药物的潜力。1990年美国的基因工程新闻将反义技术列为9O年代十大热点生物技术之一。反义技术在临床应用方面取得了重大进展,目前已有4种反义     

反义寡聚脱氧核苷酸抑制HL－60细胞中bcl－2基因表达的研究

目的：研究ＨＬ－６０细胞中ｂｃｌ－２基因的表达并探索ｂｃｌ－２基因ｍＲＮＡ特异的反义寡聚脱氧核苷酸（反义ＯＤＮ）对ＨＬ－６０细胞中ｂｃｌ－２基因表达的影响．方法：采用细胞原位杂交和免疫细胞化学染色技术检测ＨＬ－６０细胞中ｂｃｌ－２基因的表达，人工合成ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ特异性反义ＯＤＮ片段与ＨＬ－６０细胞共培养，在作用一定时间后分别测定细胞中ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ和Ｂｃｌ－２蛋白表达的变化．结果：ｂｃｌ－２基因在ＨＬ－６０细胞中既有转录水平的高表达，又有翻译水平的高表达，人工合成的反义ＯＤＮ片段在一定浓度范围内，作用一段时间后细胞内ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ表达无显著改变，而蛋白表达却呈现了显著下降，与浓度和作用时间呈正相关．结论：人工合成的反义ＯＤＮ片段可以抑制ＨＬ－６０细胞中ｂｃｌ－２的转录作用．在进行白血病基因治疗的实验研究中，ｂｃｌ－２基因可以作为基因治疗的一个有用的靶基因．     

血管内皮生长因子反义RNA对人脑垂体瘤细胞的作用

目的 :研究血管内皮生长因子 (VEGF)反义RNA对人脑垂体瘤细胞的抑制作用 ,探讨以VEGF反义RNA进行垂体瘤基因治疗的可行性。方法 :将VEGF反义cDNA、正义VEGFcDNA质粒转染垂体瘤细胞 ,通过Northern印迹杂交鉴定其表达 ,测定被转染细胞生长率 ,用原位杂交和免疫组化法检测VEGFmRNA及蛋白表达。结果 :经鉴定被转染的垂体瘤细胞有外源性VEGF反义基因的整合及表达 ,其VEGFmRNA及蛋白表达水平降低 ,但其生长速率无明显减慢。结论 :VEGF在垂体瘤血管形成及发生、发展中起重要作用 ,可能成为基因治疗垂体瘤的优选靶的之一。     

反义mTOR基因局部转染对移植静脉内膜增生的影响

目的:观察反义雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因转染对移植静脉内膜增生的影响。方法:聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)和聚乙烯醇(PVA)包载制备纳米级粒子混合物。建立自体静脉移植模型,随机分成转基因组、空载体组、对照组。转基因组转染纳米粒子包载的反义mTOR基因,空载体组转染纳米粒子包载的空载体,对照组不予特殊处理。分别于术后3、7、14、28d取材,常规HE、弹力纤维VG染色,RT-PCR、免疫组织化学染色、Western blot检测mTOR基因的mRNA及蛋白的变化,TUNEL法观察血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的动态变化。结果:转基因组内膜中mTOR蛋白产物表达较其他组明显减少(P<0.05);转基因组内膜增生程度在术后7、14、28d较其他组明显减少(P<0.01);转基因组凋亡细胞较其他组明显增高(P<0.05)。结论:反义mTOR基因的表达能够有效抑制自体移植静脉内膜的增生,促进VSMC的凋亡。     

Construction and transfection of sense／antisense eukaryotic expression vectors for human cathepsin L gene

Objective: To obtain sense/antisense eukaryotic expression vectors for human cathepsin L gene, and study the biological effects on human osteosarcoma cell line MG-63 after transfection. Methods:Cathepsin L gene sense/antisense eukaryotic expression vectors were constructed with recombinant technology and transfected into the human osteosarcoma cell line MG-63. The expression of cathepsin L gene mRNA was examined with RT-PCR and the expression of cathepsin L was examined with Western blot. Results: The sense/antisense recombinant eukaryotic expression vectors for cathepsin L were successfully constructed and transfected into MG-63 cell. Conclusion: Antisense cathepsin L gene can significantly inhibit the expression of cathepsin L mRNA and protein.     

Inhibitory effect of retroviral vector containing anti-sense Smad4 gene on Ito cell line, LI90

Background Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) exerts strong fibrogenic potential in culture-activated HSCs. Smad4 is a key intracellular mediator for the transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily of growth factors. The aim of this study was to assess the effects of the antisense Smad4 gene on Ito cell line, LI90.Methods The recombinant retroviral vector pLXSN-Smad4 was constructed by cloning the rat antisense Smad4 cDNA into the retroviral vector pLXSN. Retroviruses with or without the antisense gene were obtained by transfecting pLXSN-Smad4 and pLXSN vectors into PA317 cells. Human hepatic stellate cells (HSCs) LI90 were infected with these retroviruses followed by selection with G418. The expression of Smad4 was detected by Northern and Western blots. Cell biological characteristics, including cell growth curve, 3H-TdR and 3H-proline uptake by HSCs and the production of extracellular matrix were assessed.Results mRNA and protein expressions of Smad4 in LI90 cells transfected with retrovirus containing the antisense Smad4 gene were much lower than those in LI90 cells transfected with empty vector or parental LI90 cells. Cells hypoexpressing the Smad4 gene exhibited a slower rate of growth, a lower uptake of 3H-TdR and 3H-proline (P&lt;0.01), and smaller production of th extracellular matrix, compared with parental LI90 cells and cells transfected with empty retrovirus.Conclusions The antisense Smad4 gene can suppress the expression of the Smad4 gene, reduce endogenous production of Smad4 mRNA and protein, block TGF-β1 signaling pathway, inhibit activation of Ito cells, obstruct the growth of Ito cells, decrease the production of the extracellular matrix （ECM）. Our results may provide a basis for the development of antifibrotic gene therapy.     

表达反义N-myc逆转录病毒载体对神经生长因子诱导神经母细胞瘤细胞分化的影响

目的研究反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染后人神经母细胞瘤细胞在神经生长因子处理后的诱导分化情况,探讨Ｎ－ｍｙｃ在神经生长因子诱导分化中的意义。方法用基因重组技术构建表达反义Ｎ－ｍｙｃ的逆转录病毒载体。用ＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍＲｅａｇｅｎｔ等多种基因转染方法,转染已经基因转染恢复了神经生长因子受体表达的人神经母细胞瘤系,建成表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系。用神经生长因子处理转化细胞系,观察ＮＧＦ是否能诱导分化。同时用ＴＵＮＥＬ原位凋亡检测技术及超微结构技术研究表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系凋亡的情况。结果表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系经单链ＲＮＡ探针杂交,证实其Ｎ－ｍｙｃ的表达明显降低。用神经生长因子处理这些转化细胞系,细胞出现明显的形态学分化。ＴＵＮＥＬ技术及超微结构研究表明,经反义Ｎ－ｍｙｃ转染的细胞系细胞凋亡增多。结论反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染能有效抑制Ｎ－ｍｙｃ的表达,进而促进神经生长因子诱导人神经母细胞瘤细胞的分化。反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染能使神经母细胞瘤细胞凋亡增多。     

Application of EST Data of Sideroiphore Regulation Protein—like Gene of Aspergillus oryzae RIB40

目的 :通过反义 RNA技术获取稻属曲霉 ( Aspergillus oryzae)新的表现型。方法 :应用BLAST网络服务对稻属曲霉 EST数据进行同源性比较 ,PCR扩增与其它种属铁配体调节蛋白基因 ( SREP)具有高度同源性的 ac7336f片段并反向插入 p USA真核表达载体。结果 :测得铁配体调节蛋白类似基因的序列 ,完成反义表达载体构建。结论 :由铁配体调节蛋白类似基因的 DNA序列推出的氨基酸序列与 Penicillium chrysogenum,Neurospora crassa和 Schizosaccharomyces pombe等种属铁配体调节蛋白基因的氨基酸序列具有高度同源性     

携带反义热休克蛋白70抑制人喉癌细胞的生长

目的 构建携带反义热休克蛋白70(HSP70)的重组腺病毒载体以用于喉癌的基因治疗研究.方法 将HSP70基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒PAdTrack-CMV上,与骨架质粒在大肠杆菌Bj5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增后得到携带反义HSP70的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASHSP70.结果 成功的构建携带反义HSP70的重组腺病毒载体系统,经测病毒滴度可达8×109.HSP70反义RNA阻断了Hep-2细胞的HSP70的表达,经Western blotting和免疫组化证实,实验组瘤细胞不能表达或低表达HSP70,而对照和空载体组高表达HSP70.转染反义HSP70的腺病毒载体的Hep-2细胞比空载体组和对照组的细胞生长缓慢,细胞周期可见实验组出现亚二倍凋亡峰,而空载体组没有.结论 构建的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASHSP70可望有效地将反义HSP70导入人喉癌细胞株,为进一步研究喉癌基因治疗提供实验基础.     

Effect of Antisense MBD1 Gene Eukaryotic Expression Plasmid on Expression of MBD1 Gene in Human Biliary Tract Carcinoma Cells

DNAmethylationhasavarietyofimportantfunctionsintheregulationofgeneexpression[1].ManystudiesdemonstratedthatthepathogenesisofbiliarytractcarcinomawascloselyassociatedwiththeaberrantDNAmethylationstatusoftumorrelatedgenes.TheaberrantstatusofDNAmethylationincludedthehypomethylationofonco genesandthehypermethylationoftumorsuppres sorgenes(TSG).IncreasingtheexpressionofTSGandimprovingthefunctionofTSGbyelimi natingitshypermethylationstatusmaybeanewwaytotreatbiliarytractcarcinoma.Toexplorether…     

反义寡核苷酸阻遏血管平滑肌细胞c-myc, PCNA基因的表达

目的：利用反义寡核苷酸阻遏血管平滑肌细胞基因表达,为移植血管再狭窄的基因治疗提供理论依据。方法：人工合成正义,反义及错配反应ｃ－ｍｙｃ,ＰＣＮＡ基因片断,并转入体外培养的ＶＳＭＣ中,运用逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）测定细胞中相应基因表达的情况。结果：反义寡核苷酸能有效抑制ＶＳＭ中ｃ－ｍｙｃ,ＰＣ－ＮＡ基因的表达,而正义和错配反应寡核苷酸没有此效应。结论：反应寡核苷酸能阻遏ＶＳＭＣ中相应基因