骨髓间质干细胞向心肌样细胞分化的研究

目的：诱导骨髓间质干细胞（BMSCs）向心肌样细胞分化，为 BMSCs 心肌再生移植治疗提供基础。方法取第5代的 BMSCs，5-氮杂胞苷诱导24 h，显微镜下进行形态学观察，3周后通过 RT - PCR 检测心肌蛋白 desmin 和αMHC 的表达。结果 BMSCs 经5-氮杂胞苷诱导后，细胞形态发生变化，出现肌管结构，RT - PC R 检测结蛋白（desmin ）和αMHC 的表达阳性。结论在体外成功诱导 BMSCs 分化成为心肌样细胞。     

应用基因芯片研究高糖对内皮细胞基因谱表达的影响

目的：利用基因芯片检测内皮细胞在高浓度葡萄糖作用下基因谱的差异性表达。方法：用cy3和cy5两种荧光染料通过逆转录反应将人脐静脉内皮细胞株在两种糖浓度下培养6天（分别为5．0mmol/L和33．3mmol/L)和mRNA分别标记成两种探针，并与载有一组靶基因的基因芯片进行杂交，通过计算机扫描分别得出某些基因在高浓度葡萄糖作用下的表达差异，结果：筛选出包括与细胞周期蛋白，离子通道，细胞凋亡相关的蛋白，DNA合成，修复和DNA结合，转录和转录因子，蛋白翻译合成，代谢，细胞受体，细胞信号和传递蛋白等相关表达差异的基因91条，其中61条表达上调，30条表达下调，结论：高糖引起的皮细胞某些基因的异常表达可能是糖尿病性血管病变的基础。     

三氧化二砷诱导NB4细胞的基因表达谱改变

目的：研究三氧化二砷在诱导急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4分化过程中基因表达谱的改变．方法：通过逆转录方法将经过及未经过三氧化二砷处理的NB4细胞mRNA制备成两种探针,应用Cy3和Cy5两种荧光染料分别标记这两种探针,随后与包含1003条待研究人类基因的表达谱基因芯片杂交,通过扫描和计算机软件分析,寻找经三氧化二砷作用后表达有差异的基因．结果：NB4细胞在三氧化二砷(0．5μmol／L)作用后3条基因上调,18条基因下调．1条参与蛋白酶体降解途径的基因显著上调,多条与细胞信号传导、RNA加工及蛋白质合成相关基因下调．结论：PSMB6及ITGBI基因的表达改变可能与NB4细胞的凋亡和／或分化有密切关系．     

骨碎补含药血清经wnt/β-catenin信号通路对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的研究骨碎补含药血清经wnt/β-catenin信号通路对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的作用,探讨其可能的作用机制。方法用不同浓度含药血清干预BMSCs,CCK-8法分别检测血清干预BMSCs 3、5、7、9 d BMSCs的增殖能力,连续诱导7、10、14 d并进行ALP活性检测,诱导21 d后茜素红染色评价BMSCs的矿化能力,RT-PCR法检测β-catenin、LRP5、GSK-3β、RUNX-2及Osteriex mRNA表达;ELISA法检测细胞内β-catenin、LRP5蛋白表达量。结果骨碎补含药血清具有明显的促进BMSCs增殖的作用,在一定的时间段提高了ALP活性,促进钙化结节形成;上调wnt/β-catenin信号通路β-catenin、LRP5、RUNX-2及Osteriex mRNA表达;下调GSK-3βmRNA表达,上调β-catenin、LRP5蛋白表达。结论骨碎补含药血清可以促进BMSCs的增殖及成骨分化,其机制与激活wnt/β-catenin信号通路,上调β-catenin、LRP5、RUNX-2及Osteriex mRNA表达,下调GSK-3βmRNA表达及上调β-catenin、LRP5蛋白表达密切相关。     

脐血干细胞分化的巨核细胞信号转导基因表达的分析

目的研究脐血干细胞向巨核细胞分化后信号转导基因表达的改变。方法分别收集同一份脐血分化培养前CD34＋细胞和培养后CD41＋细胞,提取总RNA。用基因芯片技术比较两组之间的基因表达差异,并用RT-PCR技术验证芯片结果。结果芯片分析结果显示,共筛选出3522个差异基因,其中上调1705个,下调1817个。3522个差异基因中,与细胞信号相关的基因有343个,与转录调节相关的有150个,与分化相关的有21个。其中,CD61基因的表达增加了369.83倍,CD41基因的表达增加27.38倍,PF4基因的表达增加24.06倍;MAPKs、GPCRs（G蛋白偶联受体）、RAS家族相关的基因多数表达上调;与STAT通路相关的基因中,SOCS1、JAK2表达上调,STAT5A表达下调。结论TPO等造血生长因子可能主要通过GPCRs-Ras-MAPK途径,促进脐血干细胞向巨核细胞系增殖、分化。     

P19细胞向心肌细胞分化过程中FABP3基因表达的变化

目的 观察脂肪酸结合蛋白(FABP3)基因在胚胎癌细胞(P19细胞)向心肌细胞诱导分化过程中表达水平的变化,探讨FABP3基因与心肌细胞分化之间的关系.方法 P19细胞经1%二甲基亚砜(DMSO)诱导至第15天,用肌钙蛋白I(cTnI)抗体行蛋白质斑迹法(westem blot)鉴定心肌细胞分化,并采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测FABP3基因mRNA和蛋白的表达水平.结果 诱导的P19细胞于第8天出现自发性节律跳动,Western blot检测cTnI蛋白呈阳性.在P19细胞分化过程中,FABP3基因mRNA表达呈先下调(0～6d)后再逐渐上调(5～15d)的表达模式,每隔两个时间点均有显著差异(P<0.05);FABP3蛋白也呈现相同的表达模式,但其表达水平在0～4d间无显著差异(P>0.05).结论 FABP3基因可能参与心肌细胞的分化.     

复方丹参滴丸对急性心肌梗死大鼠基因表达谱的影响

目的：利用基因芯片技术对复方丹参滴丸对心肌梗死大鼠基因表达的影响进行评价和研究。方法：使用冠脉结扎法造成大鼠心肌缺血模型,并提取给药组和模型组大鼠心肌缺血区组织的总RNA,用大鼠全基因组芯片分析其基因组表达谱变化。结果：基因芯片结果显示,与模型组相比,给药组表达量发生变化的基因（Ratio〉2或〈0．5）有49条,其中表达下调的有39条,主要有Ppp3r1、Rhoa和Nppa,表达上调的有10条,包括H2,T24、RT1-CE15、Ptprb和Hcst等。结论：复方丹参滴丸可通过调节Wnt信号通路等多个基因和信号途径来减小心肌梗死模型大鼠心脏缺血区的心肌损伤。     

lncRNA IGF2-AS调控IGF2对骨髓间充质干细胞 心肌样分化的影响

目的 探讨长链非编码RNA胰岛素样生长因子2反义转录物（lncRNA IGF2-AS）调控胰岛素样生长因子2 （IGF2）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）心肌样分化的影响。方法 分离培养SD大鼠的BMSCs,倒置显微镜观察原代 细胞、第3代细胞的形态;流式细胞仪检测BMSCs表面抗原CD29、CD90、CD45的表达。将第3代生长良好的BMSCs 分为对照组、空载体组（转染pLVX-IRES-Zs Green1载体）、lncRNA IGF2-AS组（转染pLVX-IRES-Zs Green1-IGF2- AS）、5-氮杂胞嘧啶（5-AZA）组（8 μmol/L 5-AZA 处理）、si-NC 组、si-IGF2-AS 组、si-IGF2 组、lncRNA IGF2-AS+siNC 组及 lncRNA IGF2-AS+si-IGF2 组。实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测 IGF2-AS 表达;MTT 法检测细胞活力; Western blot检测IGF2、间隙连接蛋白43（Cx43）、心肌肌钙蛋白T（cTnT）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）蛋白表达;RNA下拉 和RNA免疫沉淀（RIP）检测IGF2-AS与IGF2蛋白结合情况。结果 原代细胞在培养初期呈悬浮状态,大多数呈圆 形,培养48 h后开始贴壁生长;第3代细胞呈长梭形,排列不整齐,相邻细胞间紧密连接,呈成纤维细胞样。第3代 BMSCs 高表达 CD29（98.21%）、CD90（92.54%）,低表达 CD45（3.67%）。过表达 IGF2-AS 或 5-AZA 处理均可促进 BMSCs 中 Cx43、cTnT、cTnI 蛋白表达,并降低细胞活力,且 5-AZA 组相应指标明显低于 lncRNA IGF2-AS 组（P＜ 0.05）。沉默IGF2-AS或抑制IGF2表达均可降低BMSCs中Cx43、cTnT、cTnI蛋白表达,并降低细胞活力（P＜0.05）; lncRNA IGF2-AS可靶向上调IGF2蛋白的表达（P＜0.05）;沉默IGF2逆转了过表达IGF2-AS对BMSCs心肌样分化的 促进作用。结论 过表达IGF2-AS通过上调IGF2促进BMSCs心肌样分化。     

bFGF和IGF-1对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化促进作用及相关机制探讨

目的 探讨成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)单独或联合使用对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)向心肌细胞(cardiomyocytes, CMs)分化的影响,以及IGF-1和bFGF促分化的作用机制。方法 IGF-1和bFGF单独或联合使用,以及IGF-1和bFGF分别与LY294002联用,诱导4周后,采用免疫细胞化学、免疫荧光检测心肌特异性蛋白表达水平;Western blot检测心肌特异性蛋白和通路相关蛋白表达水平;透射电镜观察细胞的超微结构。诱导1、2和4周后,采用RT-qPCR检测心肌转录因子表达水平。结果 IGF-1和bFGF单独或联合组,均提高心肌特异性蛋白和基因表达水平,且最高表达水平出现在IGF-1和bFGF联合组。IGF-1和bFGF联用组,透射电镜可观察到平行排列的肌丝,以及线粒体和内质网等丰富细胞器。IGF-1和bFGF分别与LY294002联用组,相较于I...     

丹参水煎液对BMSCs分化为神经元样细胞的诱导作用研究

目的：研究丹参水煎液诱导BMSCs分化为神经元样细胞的作用,探索提高MSCs向神经元样细胞分化的诱导条件。方法：全骨髓贴壁法分离大鼠BMSCs,倒置显微镜观察诱导后细胞形态学特征,流式细胞仪进行BMSCs表面抗原鉴定,对诱导后的细胞进行Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色鉴定。结果：培养的细胞经流式细胞仪检测,符合BMSCs表面标志特征。各对照组诱导后阳性细胞率均高于空白组,P〈0．01,其中丹参组Nestin阳性细胞率高于β-巯基乙醇组,P〈0．01,丹参组NSE阳性细胞率高于β-巯基乙醇组,P〈O．05;各诱导组GFAP表达为阴性。结论：丹参水煎液可以诱导BMSCs向神经元样细胞分化。     

抗坏血酸体外诱导人胚胎生殖细胞向心肌细胞分化

目的 探讨抗坏血酸作为诱导剂诱导人胚胎生殖细胞(hEGC)体外分化为心肌细胞.方法 取5～10周人胚胎生殖腺嵴,进行组织块体外培养,用直接悬浮法使hEGC形成拟胚体(EBs),用不同浓度抗坏血酸的培养基对其进行诱导分化.然后取不同时间的细胞做免疫细胞化学染色,鉴定细胞的心肌特异转录因子GATA-4和心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达情况.结果 抗坏血酸诱导hEGC分化为心肌细胞的最佳浓度为0.1 mg/ml,诱导第3周时分化率达(85.2±1.8)%,显著高于不添加任何诱导剂的对照组.诱导后细胞形态变成梭形,4周时细胞突起相互连接成条索状,且排列方向趋于一致;诱导后1周即开始出现GATA-4弱表达,第3周时表达最强;诱导后2周,细胞内开始表达cTnT,3周强阳性表达,4周表达明显增强.结论 抗坏血酸能够促进hEGC向心肌细胞分化,可用以建立体外诱导hEGC分化为心肌细胞的方法.     

PADI4基因与白血病细胞分化关系的实验研究

目的体外探讨PADI4基因与白血病细胞分化的关系。方法检测HL60、K562、U937等9株不同白血病细胞株中PADI4在mRNA水平的表达情况,建立ATRA诱导HL60细胞分化模型,然后分别利用RT-PCR及WB技术检测PADI4基因在转录和翻译水平的表达变化。结果不同类型的白血病细胞株中PADI4表达情况不同。ATRA诱导HL60细胞后,在药物作用的96h内,随着药物作用时间的增加,在转录和翻译水平PADI4表达水平逐渐下调,与对照组相比差异具有统计学意义(P0.01)。结论 PADI4与白血病细胞的分化有关,ATRA诱导HL60细胞分化后PADI4表达下调。     

shRNA沉默eIF4E基因表达对人喉癌细胞Hep-2生物学行为的影响

目的构建靶向真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）的shRNA表达载体，观察eIF4E表达抑制对喉癌细胞生物学行为的影响。方法根据人eIF4EmRNA序列设计并构建2个靶向人eIF4E基因的shRNA真核表达载体（pSilencer 4．1-sl和pSileneer4．1-s2）；然后以脂质体转染的方法将shRNA表达质粒转染至人喉癌细胞系Hep-2，经G418筛选出稳定转染的阳性细胞；分别通过反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blotting技术对构建成功的2个shRNA干扰质粒进行有效性筛选，分析其eIF4E mRNA及蛋白表达水平，并筛选出表达抑制最强的稳定转染喉癌细胞系（Hep-2-s2）。通过噻唑蓝（MTT）试验检测Hep-2-s2细胞的体外增殖活性，流式细胞仪技术（FCM）检测其细胞周期和凋亡变化情况。结果经双酶切证实转录shRNA的目的基因片段已成功克隆入pSileneer4.1-CMVneo真核表达载体中，经测序证明插入序列完全正确；eIF4E—shRNA2可以显著下调eIF4EmRNA及蛋白表达水平；eIF4E基因的表达下调明显抑制Hep-2细胞的体外增殖（P〈0．05）；Hep-2-s2细胞的G0／G1期细胞比例显著增加了（14．7±1、1）％，而S期细胞比例减少了（13.2±1．6）％（P〈0．05）；Hep-2-s2的细胞凋亡率显著增加到（18．3±1．7）％（P〈0．051。结论shRNA介导的eIF4E基因表达下调可显著降低喉癌细胞的增殖活性，同时诱导其细胞周期阻滞和凋亡率增加．为喉癌基因治疗筛选出了新的靶点。     

刀豆素蛋白引起免疫性肝损伤小鼠肝脏基因表达谱变化

目的：观察刀豆素蛋白引起免疫性肝损伤小鼠肝脏相关基因表达谱变化。方法：小鼠一次静脉注ConA 26．5mg／kg后提取肝脏总RNA，反转录后用Cy3-dUTP和Cy5-dUTP分别标记肝cDNA探针并与小鼠基因表达谱芯片杂交，经芯片扫描仪扫描后用GenePix Pro3．0软件分析。结果：在观察的4096个基因中，与正常对照组相比，ConA肝损伤组可见301条差异表达基因，占基因芯片总点数7．35％。在上述差异表达基因中，已知功能基因有154条。ConA免疫性肝损伤小鼠差异表达的功能基因主要与参与调控肝细胞免疫炎症（胸腺生成素、干扰素诱导蛋白、脉管细胞黏附因子、吸引素、聚腺苷分裂因子、T细胞激活蛋白）、细胞凋亡（谷胱甘肽转移酶、嗜酸粒细胞过氧化物酶、Bcl-2转录因子、细胞分裂周期及凋亡调控因子1、成纤维细胞生长因子受体）、肝脏糖及能量代谢（乙酰辅酶A合酶、琥珀酸脱氢酶复合体、脂肪酸脱饱和酶l、4-羟类固醇脱氢酶、硫腺苷甲硫氨酸合成酶、磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶等）等过程密切相关。此外，尚有部分不明功能基因的表达也发生变化。上述发现对深入了解ConA引起免疫性肝损伤过程中基因调控网络，探讨免疫性肝损伤的分子病理机制具有十分重要的意义，同时也为抗肝炎药保肝机制和作用靶点研究提供思路。     

蛋白酶体抑制剂MG132诱导人血管平滑肌细胞凋亡及其机制研究

目的：观察蛋白酶体抑制剂MG132对人脐静脉血管平滑肌细胞（vascular smooth musele cells,VSMC）的致凋亡作用及其对凋亡相关的天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3（caspase 3）表达的影响。方法：采用多个浓度（2．5、5、10μmol／L）的蛋白酶体抑制剂MG132处理人脐静脉VSMC 24h和48h;流式细胞术分析细胞凋亡率;RT-PCR检测泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway,UPP）相关基因泛素、泛素活化酶（E1）、泛素缀合酶（E2）、泛素连接酶（E3）、26S蛋白酶体和caspase 3基因转录水平;免疫细胞化学检测细胞caspase 3蛋白表达。结果：蛋白酶体抑制剂MG132处理48h后细胞凋亡率增加：细胞内UPP相关的基因rnRNA表达降低,而caspase 3 mRNA表达增高;免疫细胞化学检测细胞caspase 3蛋白表达水平升高。结论：蛋白酶体抑制剂MG132能够诱导人脐静脉VSMC凋亡,其作用呈量-效关系;MG132诱导vSMC凋亡与下调UPP相关基因和上调caspase 3基因及蛋白的表达有关。     

骨形态发生蛋白-2基因转染骨髓基质干细胞复合壳聚糖体外构建组织工程软骨的实验研究

目的观察转人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因的骨髓基质干细胞(BMSCs)向软骨细胞方向分化的能力,并种植于壳聚糖体外构建组织工程软骨。方法应用慢病毒介导把人BMP-2基因和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因转入大鼠BMSCs,通过荧光观察、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Westernblot、免疫组织化学等方法检测BMP-2、Ⅱ型胶原表达及软骨基质分泌情况;噻唑蓝(MTT)检测转基因后细胞的增殖活力。结果BMP-2基因和eGFP基因成功转染BMSCs,Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达均显著增强,细胞种植壳聚糖支架后生长、粘附良好。结论BMP-2可在BMSCs内表达,并诱导其向软骨方向分化;与壳聚糖复合培养可构建组织工程骨。     

克雷伯杆菌反复感染诱发大鼠肺内c-fos mRNA转录和蛋白表达

目的：探讨肺炎克雷伯杆菌反复感染在慢性阻塞性肺疾病（COPD）形成中的机制。方法：将大鼠随机分为对照组（C）和肺炎克雷伯杆菌感染组（K）。动态观察肺感染K组肺细胞损伤改变。以免疫组化和原位分子杂交方法分别检测肺内各细胞c-fos蛋白和mRNA表达的变化。结果：K组第8周少部分细支气管管壁有平滑肌细胞和纤维组织增生，第16周纤维组织明显增生（P〈0．01）。K组感染1周后，在不同时间内肺内各细胞均有c-fos蛋白和mRNA表达增加（Pl〈0．01）。并且各自c-fosmRNA转录水平和c-fos蛋白表达水平基本平行，其中巨噬细胞最早表达c-fos蛋白。从第l天持续到感染第16周。结论：肺炎克雷伯杆菌感染在体内能诱发肺内各细胞损伤和c-fos转录和表达上调，在加重COPD形成中有重要作用。     

低氧状态下红景天苷经HIF-1α信号通路调节人成骨样MG-63细胞表型表达的研究

目的研究低氧状态下红景天苷对成骨细胞表型表达的调控作用及其作用机制。方法 MTT法检测细胞增殖能力;采用Annexin V/PI双染法分析低氧诱导的细胞凋亡情况;磷酸苯二钠法检测成骨细胞分化的早期标志性基因碱性磷酸酶(ALP)活性;RT-PCR技术检测低氧诱导因子(HIF)-1α、血管内皮生长因子(VEGF)、抑癌基因VHL蛋白(p VHL)、骨钙素(OC)、成骨细胞特异性转录因子Runx2及Osterix mRNA表达水平;采用ELISA法检测VEGF及OC的蛋白表达水平和I型胶原的含量;Western blot技术检测HIF-1α、p VHL、Osterix、Runx2的蛋白表达水平;免疫荧光共聚焦显微镜技术观察HIF-1α的核转位情况;荧光素酶报告基因检测技术检测HIF-1α的转录活性。结果低氧状态下红景天苷促进MG-63细胞增殖,抑制由低氧诱导的MG-63细胞凋亡,促进Osterix、Runx2表达及通过增加ALP活性、Ⅰ型胶原和OC含量促进成骨细胞分化成熟。进一步研究发现,低氧状态红景天苷可下调HIF-1α的表达及核转位,而上调其转录活性及下游靶基因VEGF的表达。结论低氧状态下红景天苷通过调节HIF-1α/VEGF信号通路促进成骨细胞增殖和分化,同时抑制由低氧诱导的成骨细胞凋亡。     

体外"心肌样"环境下5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的探讨在体外"心肌样"环境下5-氮胞苷(5-Aza)诱导能否促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化。方法(1)分离、纯化大鼠BMSCs,分组后用5-Aza诱导部分BMSCs。(2)BMSCs标记后与乳鼠心肌细胞共培养。(3)免疫荧光法鉴定BMSCs的肌球蛋白重链(MHC)和心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)。结果免疫荧光结果显示5-Aza单次诱导组与未诱导组比较MHC、cTnI阳性率显著增加,且5-Aza双次诱导组较单次诱导组MHC、cTnI阳性率显著增加。结论(1)体外"心肌样"环境下5Aza能够促进BMSCs向心肌样细胞分化。(2)5-Aza双次诱导较单次诱导效果更好。     

瘦素诱导下乳腺癌组织中端粒酶反转录酶表达的机制研究

目的：研究瘦素诱导下端粒酶反转录酶与乳腺癌发生机制的关系。方法选取以乳腺癌MCF-7细胞系为处理对象，通过细胞培养传代得到足量乳腺癌细胞，以1×10^5个／孔种植于96孔板，数字表随机分为观察组（n＝48）和对照组（n＝48）。观察组以10 nmol／L瘦素处理细胞，对照组饥饿后不做任何处理。分别利用半定量RT-PCR和Western blot方法分析瘦素刺激前后两组端粒酶反转录酶mRNA、端粒酶反转录酶单表的表达情况的改变。设计针对信号转导和转录激活因子3（ STAT3）的特异性实验，下调乳腺癌细胞中STAT3的表达水平，用半定量RT-PCR法检测下调STAT3表达水平前后及瘦素刺激前后端粒酶反转录酶表达水平的变化。结果观察组经瘦素处理后，端粒酶反转录酶mRNA、端粒酶反转录酶蛋白都出现了倍数增加，其中端粒酶反转录酶mRNA比对照组增加了（3．2±0．5）倍（t＝2．675，P＝0．009），端粒酶反转录酶蛋白比对照组增加了（2．5±0．3）倍（t＝2．352，P＝0．032）。在人乳腺癌细胞MCF-7 STAT3表达水平下调的情况下，端粒酶反转录酶表达水平也随之下调（t＝2．019，P＝0．045），而且经瘦素处理后，瘦素对端粒酶反转录酶表达水平上调的现象也没有出现（t＝2．348，P＝0．037）。结论瘦素通过STAT3信号途径上调端粒酶反转录酶的表达参与乳腺癌的发生和发展。