巨噬细胞移动抑制因子及其受体CD74在宫颈癌组织中的表达及意义

目的探讨巨噬细胞移动抑制因子(MIF)及其受体CD74在宫颈癌组织中的表达及意义。方法采用免疫组织化学SABC法和半定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测86例宫颈癌组织(63例无淋巴结转移,23例淋巴结转移)和21例正常宫颈组织中MIF、CD74蛋白及mRNA的表达并分析。结果 MIF、CD74mRNA在宫颈癌中的表达显著高于在正常宫颈组织中的表达(P<0.01),且在有转移的宫颈癌中的表达高于无转移的宫颈癌组织(P<0.01)。MIF及CD74在宫颈癌组织中的表达高于其在正常宫颈组织中的表达(P<0.01),且在宫颈癌转移组中的表达更高(P<0.01)。结论 MIF、CD74在宫颈癌的发生发展中起重要作用,且在促进宫颈癌转移中发挥及其重要的作用。     

重组人组织因子在毕赤酵母中的高效分泌表达的研究

目的构建含有人组织因子(h TF)基因的毕赤酵母高效表达系统,实现胞外高效分泌表达。方法全基因合成h TF胞外区序列,PCR扩增该基因片段,经Xho I和Xba I双酶切后,和表达载体p GAPZa A相连,并电转化毕赤酵母SMD1168H。在YPD培养基中进行表达,取培养基上清进行SDS-PAGE检测,并利用Western进行确证,通过BCA法检测胞外蛋白表达量。结果在毕赤酵母中成功表达人组织因子,通过Western确证目的蛋白分子量大小正确,BCA法检测摇瓶表达胞外总蛋白达1 g/L,Bandscan软件分析目的蛋白占胞外总蛋白80%以上。结论本研究实现了截短型人组织因子在毕赤酵母中的高效分泌表达,获得了具有与完整因子相同凝血活性的截短型组织因子。     

人可溶性血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体Flt-1基因在甲醇酵母中的克隆表达

应用RT－PCR技术，从人脐静脉内皮细胞中扩增出编码Flt-1，胞外区前四个结构域的基因片段，将Flt-1基因片段连接到表达载体PIC9K上，获得重组质粒pPIC9K-F，将重组质粒转化到甲醇酵母Pichia pastoris GS115中，得到基因工程菌株P.pastoris(pPIC9K-F)，对培养上清进行SDS－PAGE和Western blot分析。结果显示在74.2ku处有阳性条带出现，表明sFLT-1在甲醇酵母中获得了成功表达。受体配基结合实际显示表达产物与VEGF可特异性结合，表明其具有配基结合生物活性。     

C端截短的乙型肝炎病毒核心抗原的原核表达及免疫原性

 目的   原核表达C端截短的乙型肝炎病毒核心抗原（hepatitis B virus core antigen,HBcAg）〔HBcAg(aa 1-149）〕,并研究其在小鼠中的免疫原性。方法   用聚合酶链反应扩增C端截去34个氨基酸的HBcAg基因片段,构建含HBcAg（aa 1-149）基因的克隆质粒及表达质粒,在大肠杆菌Rossatta2中以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白的表达。表达产物经Ni²⁺亲和层析柱纯化后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白质印迹法鉴定。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,用ELISA法检测血清抗-HBc水平。结果   重组原核表达质粒pET15b HBcAg(aa 1-149)经双酶切和SDS-PAGE鉴定证明构建正确。重组HBcAg（aa 1-149）在大肠杆菌中获得高效表达,表达形式主要为可溶性蛋白。蛋白质印迹法显示在预期位置（相对分子质量约17 000位置）出现特异性条带。纯化后的重组蛋白纯度较高（＞90%）,并可在小鼠中诱生较高水平的抗-HBc。结论   重组HBcAg（aa 1-149）在原核系统中获得成功表达,并可在小鼠中诱导抗体应答。     

基于重组PCR法构建人骨保护素N端的酵母表达载体

目的：构建骨保护素（OPG）N端片段的酵母表达载体。方法：OPGN端D1—D4域仅由2个外显子编码。以人基因组DNA为模板．PCR分别扩增外显子2和外显子3，并使外显子2的3’引物和外显子3的5’引物具有相互重叠的一段序列。以2种PCR产物混合物为模板，采用重组PCR扩增OPGN端编码序列，拟插入酵母分泌型表达载体pPIC9K。为使未来分泌表达产物具有完全正确的N末端，再次采用重组PCR策略，将pPIC9K信号肽裂解位点前的一段序列（含单一限制酶位点BamHⅠ）与OPGN端编码序列拼接在一起，从BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ位点插入pPIC9K。结果：得到了OPGN端酵母表达载体，测序证实插入序列正确。结论：重组载体的获得为基因工程研制具有生物活性的OPGN端片段奠定了基础。     

适合菌苗研制的重组破伤风毒素衍生物的鉴定

破伤风毒素（TT）是由破伤风杆菌产生的一种神经毒素,其分子量为150kDa,含有一条50kDa的轻链和一条100kDa的重链,轻链在氨基端以二硫键与重链相连。重链的羧基端有一个50kDa的C片段,该片段具有神经节苷脂及蛋白结合活性。轻链为锌依赖性蛋白酶,能通过蛋白酶解小突触泡蛋白而阻断神经元释放抑制物。用大肠杆菌、酵母细胞或培养的昆虫细胞表达的重组C片段,纯化     

人类疱疹病毒7型糖蛋白(gL)的研究

克隆人类疱疹病毒7型（HHV-7）糖蛋白gL，分别连接入酵母双杂交载体pAS2—1、pACT2。通过双杂交技术，分析gL基因表达蛋白与gH、CD4的相互作用。发现含gL、gH基因的重组酵母菌Y190具有β-半乳糖苷酶活性，而含gL、CD4基因的重组Y190未检测到相应活性。结果表明，gL表达蛋白在酵母双杂交系统中能够与另一HHV-7糖蛋白gH结合，而与HHV-7已知受体CD4无相互作用。     

天然大麦α-淀粉酶／枯草杆菌蛋白酶抑制剂在毕赤酵母中的高水平表达

利用甲醇诱导的醇氧化酶1（AOX1）启动子，构建了天然大麦α-淀粉酶／枯草杆菌蛋白酶抑制剂在毕赤酵母中的高水平表达系统。为了提高表达水平，在紧邻野生型编码区处设计了两种密码子优化的编码区并使之表达。利用来源于酿酒酵母的截短的α交配因子分泌信号，以保证天然成熟蛋白的分泌。利用PCR方法筛选AOX1基因被替换的单拷贝插入转化子，比较不同克隆的表达水平。经甲醇诱导后，野生型的表达水平为125mg／L，两种含有密码子优化编码区的突变株分别为65和125mg／L。纯化的重组蛋白通过埃德曼降解、液相色谱、质谱以及不溶性蓝色淀粉测定等方法显示重组蛋白与大麦中的野生型蛋白具有相同特征。     

β-内酰胺酶抑制短肽SIPIS04-01的表达、纯化与抑制作用测定

通过酵母双杂交系统从一个随机DNA片段文库中筛选到一个编码能与β-内酰胺酶结合的短肽SIPIS04—01的DNA序列，将它克隆到pGEX-4T-1的多克隆位点中，得到重组质粒pYG205。当用适量的IPTG诱导后，携带pYG205的E．coli DH5α能表达短肽SIPIS04-01-GST融合蛋白。利用谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析介质分离纯化短肽SIPIS04-01-GST融合蛋白，经凝血酶切割并分离纯化后，体外试验表明短肽SIPIS04-01具有抑制β-内酰胺酶的作用。     

双拷贝截短型人胰岛素样生长因子I基因的构建、表达和鉴定

目的：增加重组截短型胰岛素样生长因子I[des(1-3)IGF-I]的表达产量,初步纯化表达产物后并与标准IGF－I比较其生物活性。方法：将第二个des(1-3)IGF-I基因插入先前构建好的pExSecl/IGF-I表达质粒中,形成pExSecl/2(IGF-I)的表达质粒。将质粒转化人蛋白酶缺陷的大肠杆菌BL21（DE3）中,培养工程菌并用IPTG于12℃低温诱导des(1-3)IGF-表达。超滤膜过滤和Sephadex G-50凝胶过滤纯化表达产物。用MTT法测定纯化的IGF－I的生物活性,并与标准IGF－I比较。结果：双拷贝IGF－I的表达量达可溶性菌体蛋白的20％,高于单拷贝IGF－I的表达产量912％）;超滤和凝胶过滤后des(1-3)IGF-I纯度分别达49％和82％;经凝胶过滤后的IGF－I相对生物活性达标准IGF－I的77％。结论：pExSet1/2(IGF-I)可增加IGF－I表达产量约8％;纯化后的des(1-3)IGF-I生物活性为标准IGF－I的77％。     

利用反义RNA技术抑制酿酒酵母羊毛甾醇合酶基因的表达

羊毛甾醇合酶催化的2,3-氧化鲨烯环化是麦角甾醇和三萜类化合物生物合成分支形成的关键位点,下调2,3-氧化鲨烯流向麦角甾醇的代谢途径可促进其流向三萜类化合物的代谢途径。有鉴于此,本研究根据酿酒酵母羊毛甾醇合酶基因(lanosterol synthase gene,erg7)序列设计引物,扩增5’长片段(包括erg7基因5’非编码区启动子序列和部分编码区序列)、5’短片段(包括erg7基因5’非编码区部分启动子序列和部分编码区序列)和erg7基因编码区片段,分别将其反向克隆到表达载体p ESC-URA上,构建反义表达质粒。用反义表达质粒转化酿酒酵母INVSc1,在营养缺陷型培养基SD-URA上筛选重组菌株。通过半定量PCR进行检测,结果表明:与INVSc1相比,转入erg7基因编码区反义片段的重组菌株内羊毛甾醇合酶基因表达量没有显著变化,而转入5’长反义片段和5’短反义片段的重组菌株内羊毛甾醇合酶基因表达量明显降低。通过TLC和HPLC方法比较麦角甾醇含量,结果表明:与INVSc1相比,转入5’短反义片段和erg7基因编码区反义片段的重组菌株内麦角甾醇含量没有显著变化,而转入5’长反义片段的重组菌株内麦角甾醇含量明显降低。本研究利用反义RNA技术抑制酿酒酵母中羊毛甾醇合酶基因的表达,为应用合成生物学技术在酿酒酵母中组建三萜类化合物代谢途径奠定了基础。     

阿司匹林对基质金属蛋白酶9启动子活性的影响

目的：通过研究基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)启动子片段的活性以及阿司匹林(aspirin)对启动子活性的调控，了解阿司匹林在前列腺癌的防治方面的机制。方法：DU145细胞体外培养，分别在24、48、72h采用MTF法检测不同浓度的阿司匹林对Du145的毒性。构建含人MMP-9基因5侧翼序列-1．28、-0．67、0．54、0．52kb与报告基因氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的重组体，用Lipofetamine 2000转染试剂瞬时转染DU145细胞，CAT-ELISA测定各重组体的CAT值，及在乙酸肉豆蔻佛波酯(PMA)和／或阿司匹林作用下各重组体的CAT值。结果：低浓度的阿司匹林(≤1mmol·L~(-1))对DU145细胞毒性无明显差别。在无乙酸肉豆蔻佛波酯刺激的作用下，pCAT 1．28和pCAT 0．65的CAT表达量分别为对照组的2倍和1．6倍，而在乙酸肉豆蔻佛波酯的刺激下，pCAT 1．28、pCAT0．65和pCAT 0．54的CAT表达量分别为对照组的2．5、2．2和1．3倍。阿司匹林对pCAT 1．28、pCAT 0．65活性具有抑制作用且这种抑制作用可以被乙酸肉豆蔻佛波酯所抵消。结论：MMP9启动子的活性区域主要集中于-1285～-523之间的区域；阿司匹林可以在转录水平上下调MMP-9的表达，从而可能抑制前列腺癌的发生发展。     

芍药总苷调控巨噬细胞核因子-κBp65蛋白核转移作用的研究

目的：研究芍药总苷调控巨噬细胞核因子-κB（NF—κB）p65蛋白核的转移作用，探讨芍药总苷对NF—κB活化的影响。方法：原代培养大鼠腹腔巨噬细胞，经脂多糖和芍药总苷作用后，用Western blot方法观察NF—κB亚基p65蛋白在胞浆和胞核的表达。结果：经脂多糖刺激后，p65蛋白在胞浆中表达显著减少，在胞核中表达显著增多；芍药总苷显著增加了脂多糖刺激后p65蛋白在胞浆中的表达，并减少了其在胞核内的表达。结论：芍药总苷可抑制NF—κB p65蛋白从胞浆向胞核的转移，提示其具有抑制NF—κB活化的作用。     

双拷贝截短型人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的构建、表达和鉴定

目的:增加重组截短型胰岛素样生长因子Ⅰ[des(1-3)IGF-Ⅰ]的表达产量,初步纯化表达产物后并与标准IGF-Ⅰ比较其生物活性。方法:将第二个des(1-3)IGF-Ⅰ基因插入先前构建好的pExSecl/IGF-Ⅰ表达质粒中,形成pExSecl/2(IGF-Ⅰ)的表达质粒。将质粒转化入蛋白酶缺陷的大肠杆菌BL21(DE3)中,培养工程菌并用IPTG于12℃低温诱导des(1-3)IGF-表达。超滤膜过滤和Sephadex G-50凝胶过滤纯化表达产物。用MTT法测定纯化的IGF-Ⅰ的生物活性,并与标准IGF-Ⅰ比较。结果:双拷贝IGF-Ⅰ的表达量达可溶性菌体蛋白的20％,高于单拷贝IGF-Ⅰ的表达产量(12％);超滤和凝胶过滤后des(1-3)IGF-Ⅰ纯度分别达49％和82％;经凝胶过滤后的IGF-Ⅰ相对生物活性达标准IGF-Ⅰ的77％。结论:pExSecl/2(IGF-Ⅰ)可增加IGF-Ⅰ表达产量约8％;纯化后的des(1-3)IGF-Ⅰ生物活性为标准IGF-Ⅰ的77％。     

人源抗HBsAg单链抗体与白细胞介素2融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的表达

目的：探讨抗HBsAg单链抗体与白细胞介素2融合蛋白在巴氏毕赤酵母(P．Pastoris)中的表达以及初步的纯化、活性鉴定方法。方法：用PCR将目的蛋白基因从质粒PGEM7Zf( )-HBScFv-IL-2上扩增出来，再亚克隆到酵母表达载体pPICZaA中，转化P．Pastoris宿主菌GS 115，菌落：PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定转化子，重组酵母经甲醇诱导后，通过SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定表达产物；再通过亲和层析法纯化目的蛋白；用间接ELISA实验鉴定其活性。结果：表达的重组蛋白分子质量约为44ku，表达量可达12％；纯化后凝胶成像分析目的蛋白的纯度达到95％；重组融合蛋白能与HBsAg、鼠抗IL-2单克隆抗体特异性结合。结论：成功构建了抗HBsAg单链抗体与IL-2融合蛋白酵母表达工程菌，并初步建立了对目的蛋白的纯化及活性鉴定方法。     

米非司酮通过抑制Rab27a和Rab27b的表达对子宫内膜癌细胞增殖的抑制作用

目的 研究米非司酮在子宫内膜癌中的功能和潜在分子机制。方法 通过细胞增殖实验研究不同质量浓度（10、50、100 μg/mL）米非司酮以及随着时间变化米非司酮对子宫内膜癌细胞的影响;蛋白免疫印记实验及免疫荧光实验研究米非司酮（50 μg/mL）对子宫内膜癌细胞内外泌体分泌、外泌体调控关键蛋白的表达、外泌体关键调控蛋白对外泌体分泌的影响。结果 随着加入子宫内膜癌细胞内的米非司酮质量浓度升高和时间推移,子宫内膜癌细胞增殖速率显著减慢,同时细胞状态变差,数目显著减少;米非司酮显著降低外泌体蛋白胞外分泌,包括外泌体总蛋白以及标志蛋白CD63和Gp96等,使其滞留在胞内;米非司酮显著降低外泌体分泌调控蛋白Rab27a和Rab27b的表达;敲低外泌体分泌调控蛋白Rab27a和Rab27b的表达显著降低外泌体总蛋白以及标志蛋白CD63的胞外分泌。结论 米非司酮通过抑制外泌体分泌调控蛋白Rab27a和Rab27b的表达,从而抑制外泌体分泌,最终导致子宫内膜癌细胞增殖显著减慢。     

环九肽与人乳腺癌MDA-MB-231细胞特异性结合的研究

目的探讨99Tc^m标记分子探针与人乳腺癌MDA-MB-231细胞的特异结合及生物分布。方法：Westernblot分析MDA-MB-231细胞和正常乳腺上皮细胞MCF-10A IL-11受体（IL-11R）蛋白的表达;荧光检测99Tc^m-DTPA-c（CG-RRAGGSC）与乳腺癌细胞的特异性结合及结合位点。18只荷瘤裸鼠随机分为6组（挖-3）,经尾静脉注入0．74MBq（0．1mL）分子探针,不同时间测量其在荷瘤鼠体内生物分布。结果：West-ernblot检测MDA-M13-231细胞IL-11R是MCF-10A细胞的6．7倍;荧光染色证实99Tc^m-DTPA-c（CGRRAGGSC）-FITC特异结合在MDA-MB-231细胞的胞质和胞膜中;乳腺癌细胞IL-11R结合分子探针具饱和性;分子探针在荷瘤鼠体内迅速、持续聚集在瘤体内,4h达峰值（17．63±1．73）％ID／g,其他脏器分布极少,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：MDA-MB-231细胞呈IL-11R高表达,与环九肽具有高亲和力,99Tc^m标记环九肽放射性分子探针体内外能与之靶向特异结合。     

DAB389(Gly4Ser)2-αMSH重组蛋白的构建表达及特异性细胞毒性研究*

目的构建重组毒素DAB389(Gly4Ser)2-αMSH,探讨其对过度表达αMSH受体的几种癌细胞的特异杀伤作用.方法利用含有His·Tag和白喉毒素的基因序列作上游引物、含有αMSH全序列和(Gly4Ser)2的互补序列基因作下游引物,以pET28a-DAB389(Gly4Ser)2-EGF为模板,PCR扩增得到DAB389(Gly4Ser)2-αMSH片段,插入原核表达载体pET28a的相应位点,构建重组表达载体并在大肠杆菌中表达重组融合蛋白DAB389(Gly4Ser)2-αMSH.用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达的重组蛋白,用结晶紫法检测重组蛋白对几种癌细胞和正常细胞的毒性作用.结果构建了含有His·Tag重组表达质粒pET28a-DAB389(Gly4Ser)2-αMSH;SDS-PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为45.32×103,其表达量占菌体蛋白总量的29.2%;Western blot分析显示,重组蛋白能特异地与抗白喉抗体结合;细胞活性检测表明重组蛋白对SP2/0,HeLa,A549,A375这4种癌细胞有明显的杀伤作用,4种癌细胞的IC50值分别是3.138,2.736,7.243和4.672 μg·mL-1.结论成功构建了具有生物学活性的重组蛋白DAB389(Gly4Ser)2-αMSH,为进一步的靶向性药物研究奠定了基础.     

肝癌细胞特异性结合双价抗体的构建表达与鉴定

目的 构建和表达与肝癌细胞特异结合的双价单链抗体（bivalent single-chain Fv，BsFv），并鉴定该双价抗体的生物活性。方法 以与肝癌细胞特异结合的单链抗体（scFv）为模板，设计引物引入中间连接肽（G4s）及酶切位点AscI，通过聚合酶链反应（PCR）方法扩增出两个scFv片段，将其连入原核表达载体pAB1；构建的表达载体转化大肠埃希菌TG1，挑取单克隆细菌进行扩增，提取质粒酶切、测序鉴定。阳性菌经IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE，Western blot鉴定，间接免疫荧光流式细胞术（FACS）测定与肝癌细胞特异结合的特性。结果 经酶切鉴定以及DNA测序结果表明该BsFv构建成功，SDS．PAGE、Western blot鉴定表明表达蛋白相对分子量与BsFv理论值一致，且表达产物同亲本scFv比较，与肝癌细胞特异结合活性增强。结论 BsFv构建成功，BsFv较scFv具有明显优势，为其用于临床肿瘤的诊断和治疗奠定了基础。     

利用甘油醛—3—磷酸脱氢酶启动子分泌表达猪胰岛素前体

甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子（GPDp)是酵母最强的启动子之一。我们利用PCR扩增了GPDp，即甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因起始密码ATG前约680bp的片段，并克隆到猪胰岛素前体（PIP）的表达框架中，取代原来的磷酸甘油酸激酶启动子（PGKp)或插入到它前面，构建了质粒pGPD/PIP(只有GPDp)和pPGK-GPD/PIP(PGKp和GPDp顺向串联）。用同不启动子的表达质粒转化酵母（Saccharomyces cercvisiae)并比较了醇脱氢酶1启动子（ADH1p)，PGKp,GPDp,和双启动子PGKp-GPDp分泌表达PIP水平的差异，从双启动子表达质粒转化的酵母中筛选到一个高产株，其分泌表达水平为平均值的两倍。