造血干细胞衰老机制研究

造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)具有自我更新功能和生成多个系列免疫造血细胞的多分化功能,终生维持机体造血。证据显示HSC会出现衰老,并与机体老龄化及各种损伤情况下出现造血系统应激能力下降有关。DNA损伤反应在诱导HSC衰老的各种机制中起重要作用。HSC发生衰老的机制的研究将对降低放化疗毒副作用,保护辐射等环境因素的损伤,了解白血病的干细胞起源及治疗逃逸机制提供有价值的科研资料,为药物筛选的靶点提供试验依据。     

依托泊苷诱导的人小肠类器官衰老模型的构建及鉴定

目的 用依托泊苷(etoposide)诱导类器官发生DNA损伤构建人小肠类器官衰老模型。方法 临床活检小肠组织，体外无菌分离获得小肠隐窝，在培养基中培养成为类器官。类器官用依托泊苷10μmol·L^-1处理7 d，倒置相差显微镜观察类器官表面形态变化，Western印迹法检测DNA损伤标志物磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)水平；衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性染色检测类器官SA-β-gal阳性细胞面积百分率，Western印迹法检测衰老标志物p16^INK4A蛋白表达水平。结果 人小肠隐窝体外成功培养成球。依托泊苷诱导的人小肠类器官衰老模型表面皱缩，类器官部分死亡，整体表面积变小；类器官中γH2AX蛋白表达显著上调(P<0.01);SA-β-gal阳性细胞面积百分率显著增加(P<0.01)，约90%细胞呈SA-β-gal阳性；p16^INK4A蛋白表达显著增加(P<0.01)。结论 依托泊苷处理可诱导人小肠类器官发生DNA损伤，从而诱导人小肠类器官衰老。     

补肾填精方对D-半乳糖衰老模型大鼠脑细胞周期相关蛋白表达的影响

目的探讨抗衰老中药方剂补肾填精方对D-半乳糖衰老模型大鼠脑细胞周期相关p53、p21和p16蛋白表达的影响。方法采用D半乳糖法诱导衰老大鼠模型。随机分为正常组、模型组、天保宁组、补肾填精方（低剂量组、中剂量组、高剂量组）。免疫组化法检测各组大鼠脑海马CA1区细胞周期相关p53、p21和p16蛋白表达。结果补肾填精方能抑制海马CA1区细胞周期相关p53、p21和p16阳性蛋白的表达（P〈0．05）。结论补肾填精方可降低衰老大鼠海马CA1区p53、p21和p16蛋白表达,提示补肾填精方延缓脑细胞衰老可能与细胞周期相关蛋白表达相关。     

醛固酮诱导大鼠肾脏衰老机制研究

目的观察醛固酮是否诱导肾脏衰老。方法将大鼠右肾切除后随机分为4组:对照组(n=10)、模型组(n=8)、依普利酮组(100 mg.kg-1.d-1;n=8)及肼苯哒嗪组(80 mg.L-1,饮用;n=10);除对照组外,其余各组分别泵入醛固酮(0.75μg.h-1),观察5周后肾脏衰老改变。结果醛固酮可诱导5周龄的大鼠肾组织衰老标记物β-gal、p53和p21表达升高,SIRT1基因表达下降,伴高血压及蛋白尿、N-乙酰基-β-D氨基葡萄糖苷酶(NAG)的排泄率增加,这些变化可以被依普利酮阻断,但是肼苯哒嗪影响不大。结论醛固酮诱导肾小管上皮细胞损伤和衰老是通过醛固酮受体和p21依赖的途径。     

骨髓间充质干细胞生物学特性及其多向分化潜能的理论基础和机制

骨髓分为造血和基质两大系统，前者包括造血干细胞和各阶段血细胞；后者指骨髓腔内为造血系统提供结构和功能支持的结缔组织。因此，正常骨髓至少存在两种干细胞：骨髓造血干细胞（HSCs）和骨髓基质干细胞（MSCs）。后者以往被统称为骨髓基质细胞（BMSCs）。骨髓基质干细胞是近年才被确认的成体干细胞。长期以来，BMSCs一直被认为是骨髓中的造血结构性和功能性支持细胞，为造血干细胞的定居、自我更新和分化提供场所。后发现这些细胞易于在塑料瓶／皿表面贴壁生长，     

补肾活血方对大鼠血管内皮细胞p16基因表达的影响

目的：观察补肾活血方对大鼠血管内皮细胞p16基因表达的影响。方法将健康雄性SD大鼠24只随机分为中药组、黄芪组及0.9%氯化钠溶液组,每组8只,分别给予每组大鼠等量补肾活血方、黄芪、0.9%氯化钠溶液灌胃。提取含药血清培养人脐静脉内皮细胞,采用β-半乳糖苷酶（β-gal）染色鉴定细胞衰老;流式细胞术分析细胞周期变化,RT-PCR法检测p16基因的表达。结果中药组、黄芪组血清培养细胞与0.9%氯化钠溶液组比较, G0/G1期细胞比例均减少（P〈0.05）,且中药组G0/G1期细胞比例低于黄芪组（P〈0.05）。中药组、黄芪组血清培养细胞p16基因表达较0.9%氯化钠溶液组下调（ P〈0.05）,且中药组血清培养细胞p16基因的表达较黄芪组下调（P〈0.05）。结论补肾活血方具有延缓大鼠血管内皮细胞衰老的作用,其分子作用机制可能为通过调控血管内皮细胞p16的表达而使细胞周期停滞于G1期。     

p38 MAPK通路在造血系统调节中的作用

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族是介导细胞反应的重要信号系统。研究发现,该超家族亚族p38 MAPK通路在造血细胞调节过程中占据重要地位,抑制p38 MAPK通路可一定程度缓解衰老或者疾病引发的造血细胞功能下降。深入研究p38 MAPK通路在造血系统中的下游作用底物,将对临床造血干细胞的应用以及造血系统疾病发病机制研究提供新的思路。     

蛇床子素延缓叔丁基过氧化氢诱导的神经干细胞衰老

目的通过建立神经干细胞(NSC)体外衰老模型,探讨蛇床子素(Ost)延缓NSC衰老的作用,并探讨其可能调控机制。方法体外培养NSC,在增殖培养基中传代纯化培养至第3代,用于细胞实验。利用叔丁基过氧化氢(t-BHP)50,100和150μmol·L-1分别与NSC孵育1,2和3 h,CCK-8法检测细胞存活率,确定t-BHP 100μmol·L-1与NSC孵育2 h为制备细胞衰老模型的最佳条件。再加入Ost 50,100和150μmol·L-1作用1,2和3 h,CCK-8法检测细胞存活率,选择Ost促进细胞存活的最佳作用浓度和作用时间。实验分为细胞对照组、衰老模型组(NSC与t-BHP 100μmol·L-1作用2 h)和模型+Ost组(NSC与t-BHP 100μmol·L-1作用2 h后,再与Ost 100μmol·L-1作用2 h),用Ki67染色法检测NSC细胞增殖能力,免疫组化法检测NSC分化能力,衰老β-半乳糖苷酶(Sa-β-gal)法检测衰老细胞百分率,RT-PCR法检测p53,p21,p19和p16基因表达,Western蛋白印迹法检测P16、细胞周期蛋白依赖性激酶D1(CDKD1)和磷酸化成视网膜细胞瘤蛋白(p Rb)蛋白表达。结果 Ost 100μmol·L-1作用2 h可明显促进NSC存活(P<0.01)。与细胞对照组相比,模型组NSC增殖能力明显下降(P<0.05),分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的能力亦明显下降(P<0.05),Sa-β-gal阳性衰老细胞百分率升高(P<0.01)。与模型组相比,模型+Ost 100μmol·L-1组NSC增殖能力升高(P<0.05),分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的能力亦明显提高(P<0.05),Sa-β-gal阳性衰老细胞百分率下降(P<0.01)。RT-PCR结果显示,与模型组相比,模型+Ost100μmol·L-1组p16和p53 m RNA表达水平降低(P<0.05),p19和p21 m RNA表达无显著性变化;与模型组相比,模型+Ost 100μmol·L-1组P16蛋白表达降低,同时CDKD1和p Rb蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论 Ost具有延缓t-BHP造成NSC衰老的作用,其延缓NSC衰老作用机制可能与调控P16-p Rb信号通路有关。     

抗衰片对电离辐射损伤后小鼠骨髓造血作用的影响

摘要： 目的 探讨抗衰片对电离辐射损伤后小鼠造血重建的调控影响。方法 9~10 周龄雄性 C57BL/6 小鼠随机分为照射对照组、 低剂量组、 中剂量组和高剂量组, 每组 10 只。后 3 个剂量组分别按 0.75、 1.5、 3.0 g/kg 体质量灌服抗衰片水溶液, 照射对照组给予同体积生理盐水, 1 次/d, 连续给药 11 d。第 4 天对 4 组小鼠进行 6.0 Gy 137 Cs-γ射线单次全身照射。照射后第 8 天, 观察小鼠内源性脾结节 （即脾集落形成单位, CFU-S）、 小鼠骨髓粒-巨噬细胞集落形成单位 （CFU-GM） 和骨髓成纤维细胞集落形成单位 （CFU-F） 的生成情况。同时, 体外扩增的骨髓间充质干细胞（MSC） 与正常供体小鼠的造血干细胞 （HSC） 进行二维共培养 （2D CFU-GM）, 通过 2D CFU-GM 检测辐射损伤后药物作用的 MSC 促进 HSC 的增殖能力。结果 与照射对照组相比, 3 个剂量组的 CFU-GM 数目显著增多, 中剂量组及高剂量组 CFU-S、 CFU-F、 2D CFU-GM 增殖能力显著提高 （均 P＜0.05）。结论 抗衰片可以促进电离辐射损伤后小鼠造血系统重建。     

虫草素通过调控miR-524-5p表达抑制口腔鳞癌HSC3细胞的增殖、迁移及侵袭

摘要：目的:探讨虫草素通过调控微小RNA-524-5p（miR-524-5p）表达对口腔鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响。方法:体外培养口腔鳞癌细胞HSC3,分别使用不同浓度(10,20,40μmol·L-1)的虫草素处理;采用甲基噻唑基四唑（MTT）检测细胞增殖; Transwell小室实验检测细胞迁移及侵袭;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-524-5p的表达水平;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测细胞周期蛋白1（Cyclin D1）、p21、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）的表达量;分别将miR-524-5p mimics或anti-miR-524-5p转染至HSC3细胞后,采用上述方法检测细胞增殖、迁移及侵袭。结果:与对照组比较,虫草素各浓度组细胞增殖抑制率显著升高（P<0.05）,迁移细胞数及侵袭细胞数显著减少（P<0.05）,Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白水平显著降低（P<0.05）,p21、E-cadherin蛋白水平及miR-524-5p的表达水平显著升高（P<0.05）,且虫草素浓度组间的上述指标比较差异均有统计学意义（P<0.05）; miR-524-5p过表达可抑制HSC3细胞增殖、迁移及侵袭,而抑制miR-524-5p表达可减弱虫草素对HSC3细胞增殖、迁移及侵袭的作用。结论:虫草素可能通过上调miR-524-5p的表达从而抑制口腔鳞癌细胞增殖、迁移及侵袭。     

非小细胞肺癌组织中p16的表达及其与肿瘤细胞增殖的关系

目的 研究p16在人类非小细胞肺癌中的表达意义及与肿瘤细胞增殖的关系。方法应用免疫组织化学（S-P法）检测了80例非小细胞肺癌组织标本和40例肺良性病变组织中p16和细胞增殖核抗原（PCNA）的表达水平。结果（1）非小细胞肺癌组织中p16表达水平（57．5％）显著低于肺良性病变组织（90．0％）（P〈0．01）；（2）非小细胞肺癌组织中p16基因表达水平降低与肺癌组织学类型，细胞分化程度，患者P-TNM分期，是否有淋巴结转移存在相关性（P〈0．05）；（3）非小细胞肺癌组织中p16与PCNA表达呈负相关。结论p16基因表达下调与非小细胞肺癌细胞增殖有关，与肿瘤的发生、发展关系密切。     

太白楤木活性成分竹节参皂苷Ⅳa抗氧化及抗衰老作用研究

目的探讨太白楤木皂苷中的重要成分竹节参皂苷Ⅳa(CHS)抗氧化及抗衰老作用。方法取5~8代的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs),使用过氧化氢(H2O2)诱导细胞氧化应激以及细胞衰老模型。MTT法分别检测不同浓度CHS及H2O2对细胞活力的影响;DCFH-DA染色流式细胞仪检测细胞总活性氧(ROS)水平;Mito SOX染色流式细胞仪检测细胞线粒体ROS水平;衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测细胞衰老状态;Western blot法检测衰老标志蛋白p53、p21蛋白表达水平以及关键抗氧化应激Nrf2通路(Nrf2、HO-1、GCLC、GCLM)蛋白表达。结果浓度≤160μg·m L-1的CHS对MEFs细胞无明显毒性作用;H2O2能够显著提高细胞总ROS和线粒体ROS水平,诱导细胞衰老指标SA-β-gal活性增加,提高p53、p21表达水平,提高抗氧化信号通路Nrf2通路表达水平。CHS能够剂量依赖地降低H2O2诱导的细胞总ROS和线粒体ROS水平,减轻H2O2诱导的SA-β-gal活性升高,抑制p53、p21以及Nrf2、HO-1、GCLC、GCLM蛋白表达水平的升高。结论 CHS具有显著的抗氧化应激和抗衰老作用。     

p16基因缺失在成人ph阴性急性B淋巴细胞白血病中的临床意义

目的 探讨 p16基因缺失对成人 Ph阴性急性 B淋巴细胞白血病（B-ALL）患者的临床特征及预后的影响。方法 回顾性分析210例初发成人ph阴性B-ALL患者的临床资料,根据初发时检测的p16基因状态分为p16基因缺失组 61例和无缺失组 149例。比较 p16基因缺失与无缺失组患者的临床、免疫表型、细胞遗传学、分子学特征及预后。结果 p16基因缺失组中伴 CD20表达者所占比例明显高于无缺失组（47.5% vs. 30.8%,χ2=5.238,P＜0.05）,2组患者间其余免疫表型和细胞遗传学分布差异无统计学意义。p16基因缺失组造血干细胞移植率和完全缓解率与无缺失组差异均无统计学意义,复发率明显高于无缺失组（χ2=12.027,P＜0.05）。79例复发患者中,4例患者初发时未检测出 p16 基因缺失,而复发时检测出 p16 基因缺失。p16 基因缺失组患者的 OS 和 DFS 明显低于无缺失组（Logrank χ2分别为 16.715、21.237,均 P＜0.05）。p16基因缺失组中接受造血干细胞移植患者的 OS和 DFS均优于化疗患者（Log-rank χ2分别为25.316、20.637,均 P＜0.05）。p16基因缺失组CD20阳性患者OS和DFS均明显低于CD20阴性者（Log-rank χ2分别为 7.782、5.733,均 P＜0.05）。结论 p16基因缺失患者 CD20阳性表达率高且预后差,造血干细胞移植能够明显改善p16基因缺失患者的预后。     

骨髓微环境与骨髓增生异常综合征

骨髓增生异常综合征 （MDS） 是一组起源于造血干细胞 （HSC） 的异质性克隆性疾病, 特点是髓系细胞一系或多系发育异常, 表现为无效造血、 外周血细胞减少, 高风险向急性髓系白血病 （AML） 转化。MDS的发病、 造血功能改变及预后与骨髓微环境密切相关。骨髓微环境是一个复杂的网络系统, 其中基质细胞包括间充质干细胞的形态和功能异常、 成骨细胞分化受损、 血管内皮细胞数量增加、 单核/巨噬细胞数量减少都会促进MDS发病; 细胞因子如肿瘤坏死因子-α （TNF-α） 过表达、 血管内皮生长因子 （VEGF） 及基质细胞衍生因子-1 （SDF-1） 表达异常也与MDS发病密切相关; 基因如Dicer1低表达、 AURKA高表达、 SPINT2低表达均会促进MDS发病; Wnt/β-catenin信号通路的异常激活、 异常的PI3K/AKT及Hh信号通路也参与MDS的发病、 进展。对MDS和骨髓微环境相互作用的研究, 将进一步阐明该病的发病机制、 进展和预后, 并有助于靶向治疗的发展。本文就MDS中骨髓微环境基质细胞、 细胞因子、 基因、 信号通路异常的研究进展进行综述。     

小檗碱联合miR-328-3p对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化能力的影响

摘要：目的:探讨小檗碱对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响及可能机制。方法:体外培养人骨髓间充质干细胞,分为对照组、不同剂量（低、中、高）小檗碱组、miR-NC组、miR-328-3p组、高剂量+anti-miR-NC组和高剂量+anti-miR-328-3p组,细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测各组细胞增殖情况,实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）法检测miR-328-3p表达,蛋白质印迹法检测增殖相关蛋白细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）和细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A（p21）的表达及成骨分化相关蛋白碱性磷酸酶（AKP）、骨钙素（OCN）和骨桥蛋白（OPN）的表达。结果:与对照组比较,不同剂量小檗碱组骨髓间充质干细胞光密度（OD）值、细胞中Cyclin D1、AKP、OCN和OPN的蛋白表达及miR-328-3p表达升高（P<0.05）,而p21蛋白表达降低（P<0.05）,且呈剂量依赖性。与miR-NC组比较,miR-328-3p组骨髓间充质干细胞OD值及细胞中Cyclin D1、AKP、OCN和OPN蛋白表达升高（P<0.05）,而p21蛋白表达降低（P<0.05）。与高剂量+anti-miR-NC组比较,高剂量+anti-miR-328-3p组骨髓间充质干细胞OD值及细胞中Cyclin D1、AKP、OCN和OPN蛋白表达降低（P<0.05）,而p21蛋白表达升高（P<0.05）。结论:小檗碱可能通过上调miR-328-3p表达促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化。     

p16抑癌基因在大肠癌组织中的表达及其意义

目的：探讨抑癌基因p16在大肠癌组织中的表达及其表达与肿瘤的分化程度、临床分期的关系。方法：采用免疫组化SP方法对45例大肠癌组织中p16基因进行检测.结果：45例大肠癌组织中p16基因表达的阳性率为62．2％，在高分化、中分化、低分化大肠癌中p16基因的阳性率分别为84．1％、53．4％和29．3％。DukesA、B期大肠癌p16基因的阳性率明显高于DukesC、D期（P＜0．05）。结论：p16基因表达缺失与大肠癌的发生有关，且p16基因的表达与大肠癌的分化程度、临床分期有关。     

胃癌组织中p16基因mRNA和蛋白的表达及其与生物学行为的关系

目的：研究p16基因在胃癌组织中的表达及其与胃癌生物学行为的关系。方法：采用免疫组化和原位杂交方法检测10例正常胃粘膜，30例胃癌组织中p16基因和蛋白的表达，并结合其临床资料进行分析。结果：p16基因和蛋白阳性表达率，在正常胃粘膜均为90％，而胃癌分别为43．33％和36．67％，胃癌与正常对照组间差异均有显著意义（P＜0．05），p16基因和蛋白与胃分化程度，淋巴结转移与否，远上转移与否呈一定的相关性，结论：p16基因与胃癌发生有关，其表达产物检测可能有助于胃癌预后的判断。     

miR-320-3p 调控脂肪细胞分化的研究

目的探讨miR-320-3p 对脂肪细胞分化的影响。方法分离并培养小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,并对其进行脂肪细胞诱导分化3 d,用qRT-PCR 检测miR-320-3p 在成脂分化过程中的表达水平。在骨髓基质细胞系 ST2 中转染miR-320-3p,对其进行成脂方向诱导分化,用油红O 染色和qRT-PCR 检测miR-320-3p 对ST2 成脂分化的影响。结果MSCs 向脂肪细胞分化过程中miR-320-3p 表达增加（P < 0.01）;与转染阴性对照NC mimics 相比,ST2 细胞转染miR-320-3p mimics 后油红O 染色显示脂肪细胞明显增多,脂肪细胞特异性转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、CCAAT 增强子结合蛋白α（C/EBPα）和脂肪细胞脂肪酸结合蛋白4（FABP4）基因表达显著升高,差异有统计学意义（P < 0.05）。结论miR-320-3p 可促进ST2 向脂肪细胞分化。     

p16蛋白在胆囊癌中的表达及临床意义

目的：研究p16蛋白在胆囊癌中的表达及意义。方法：应用兔抗人p16多克隆抗体，采用SP免疫组织化学染色法，检测了42例胆囊癌、20例慢性胆囊炎石蜡标本p16蛋白的表达水平。结果：p16在胆囊癌的阳性表达率为50．0％（21／42）,在慢性胆囊炎为95．0％（19／20），在统计学上有显著性差异（P＜0．05）。p16在胆囊癌的表达与病理分型及分化程度无关，而与Nevin分期及有无淋巴结转移显著相关。结论：p16蛋白表达与胆囊癌的分化程度、浸润深度及预后密切相关，可作为胆囊癌的一个生物学标记。     

阿胶有效组分对辐射损伤小鼠造血系统的保护作用研究

目的：研究阿胶有效组分A、B对放射损伤小鼠造血系统的保护作用机制。方法：小鼠3.5Gy ^137Se全身辐射造模,每日给药A（1.0g/kg和2.0g/kg）和B（0.8g/kg和1.6g/kg）,d25处死动物。检测小鼠骨髓和脾造血干/祖细胞集落红系暴增式集落形成单位（BFU-E）、红系集落形成单位（CFU-E）、粒细胞巨噬细胞集落生成单位（CFU-GM）、脾表面结节数量,荧光酶标仪检测骨髓细胞活性氧（ROS）含量,Elisa测定小鼠外周血粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IL-6、红细胞生成素（EPO）、IFN-γ、β型转化生长因子（TGF-β）和血清及肝组织匀浆内超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧物酶（GSH-Px）含量。结果：A、B组分能促进射线损伤小鼠外周血白细胞和红细胞的升高,保护骨髓和脾造血干/祖细胞集落BFU-E、CFU-E、CFU-GM,增加脾表面集落形成单位（CFU-S）数量和血清中GM-CSF、IL-6含量,降低骨髓细胞内ROS含量,提高血清内SOD、GSH-Px和肝脏内SOD含量。结论：从体外模拟人胃、肠的消化系统能够分离阿胶有效补血活性成分,这种成分保护辐射损伤小鼠造血系统的机制可能与保护贫血小鼠造血微环境、刺激机体表达相关造血细胞因子和增强机体抗自由基能力有关。