肿瘤相关胰蛋白酶原-2免疫放射分析

本文建立了肿瘤相关胰蛋白酶原-2(TAT-2)IRMA,并初步应用于临床, 以探讨其对肿瘤早期诊断的可能性.以抗TAT-2 McAb T2C和T2L分别作为捕捉抗体和标记抗体.在pH9.6的碳酸缓冲液中, 将McAb T2C包被小珠, 成为固相抗体;用氯胺T方法将McAb T2L制成125I-标记抗体;并将两株McAb与不同量的TAT-2标准品, 在pH7.5的磷酸缓冲液中保温反应, 制作TAT-2标准曲线.检测肿瘤患者及正常人血清或尿液TAT-2含量, 并作对比.结果表明, 测定的TAT-2标准曲线(N=10):Bmax/T=(22±3.2)%, Bmax/B0=689.2±35.6倍, 非特异结合率小于0.5%, 检测下限在0.5ng/mL;批内CV为(4.3±0.26)%, 批间CV为(10.6±1.2)%;平均回收率为(98.5±3.1)%和(97.9±2.3)%.正常人血清(87份)和尿(20份)TAT-2浓度为7.58±5.46ng/mL和3.11±1.62ng/mL; 胃癌患者(45例)的血清TAT-2浓度63.2±62.9ng/mL, 胰腺癌和胆管癌患者(12例)和其它各种转移癌患者(16例)尿TAT-2浓度为236.6±185.3ng/mL, 104.9±171.2ng/mL;3组癌症患者血清、尿TAT-2浓度与正常人相比, 差别非常显著(P值均小于0.001).因此, TAT-2有希望成为一项肿瘤辅助诊断指标.     

小鼠肿瘤坏死因子-α光激化学发光免疫法的建立

采用光激化学发光免疫法（LICA）建立快速定量检测小鼠mTNF-α。用两株mTNF-α不同表位的单克隆抗体（McAb）,一株McAb包被发光微粒,另一株为生物素化McAb,两者与链亲和素包被的感光微粒构建双McAb夹心法mT-NF-α-LICA。数据采用双对数函数处理程序。结果表明：方法灵敏度为0.5ng/L;ED20、ED50、ED80分别为14.96 ng/L、77.5 ng/L、401.0 ng/L;可测范围为0.5~1200 ng/L;批内和批间CV分别为7.8%和10.5%;平均回收率为100.3%。mTNF-α-LICA与ELISA有较好的相关性。本文建立的mTNF-α-LICA法是mTNF-α检测中灵敏的方法,该方法稳定性好,具有很好的应用前景。     

肝活素酶联免疫吸附分析方法的建立及应用

目的 建立肝活素(Hepassocin)酶联免疫吸附分析方法(ELISA).方法 使用两株抗体,一株包被微孔板,另外一株用HRP标记.显色系统使用TMB显色.结果 测定范围在20 ～ 1000ng/mL,最低检测限在10ng/mL,回收率在93.9％～ 103.1％之间,批内和批间变异为9.7％和7.8％,正常参考值为＜20ng/mL.结论 用1000份临床样本考核本试剂盒,与参比试剂盒有很好的临床符合性,与参比试剂盒具有同等的临床使用价值.     

液相色谱串联质谱法检测微量血维生素D含量

目的建立液相色谱串联质谱法(LC- MS/MS法)测定微量血维生素D含量的方法。方法采用非衍生处理方法,利用正离子电喷雾离子化(ESI+)、多反应监测模式(MRM)、同位素内标法检测微量血维生素D含量并进行相关方法学验证。结果 vitD2在5~100 ng/mL、vitD3在5~150 ng/mL范围内线性良好,线性相关系数分别为0.9988、0.9984。vitD2和vitD3的批内精密度和批间精密度变异系数均小于10%。vitD2低浓度回收率为87.58%,高浓度为94.68%;vitD3的低浓度回收率为92.62%,高浓度为87.65%。vitD2、vitD3的LOD分别为0.36 ng/mL和1.33 ng/mL,LOQ分别为2.5 ng/mL和2.5 ng/mL。患者样本在4℃的稳定性较好,可至少保存7d。vitD2和vitD3的携带污染分别为0.06%和 0.07%,满足要求。结论此LC- MS/MS检测法不仅样本用量少,而且操作简单,无污染,更适合临床检测分析。     

平足蛋白吖啶酯化学发光免疫分析方法的建立及在乳腺癌检测中的临床应用

目的 建立一种以活化吖啶酯标记抗人平足蛋白抗体为标记物检测人血清中平足蛋白(PDPN)的磁微粒化学发光免疫检测方法并进行在乳腺癌相关疾病方面的临床应用验证。方法 以包被链酶亲和素磁微粒-活化生物素标记抗人平足蛋白抗体为固相分离载体，生物素标记一株鼠抗人平足蛋白单克隆抗体，吖啶酯标记另一株鼠抗人平足蛋白单克隆抗体，建立人血清样本中PDPN定量免疫分析方法。结果 在线性范围1.00～800.00ng/mL内，相关系数r为0.9990,检出限为0.52ng/mL;批内重复性不超过5.0%,批间差不超过10.0%;正常参考区间为小于4.50ng/mL;测定乳腺癌临床样本，特异性为88%和灵敏度为87%。结论 建立了定量检测人血清中PDPN水平的化学发光免疫分析法，对乳腺癌的发生发展起了辅助诊断作用。     

骨碱性磷酸酶(BAP)酶联免疫吸附分析方法的建立及初步应用

目的 建立骨碱性磷酸酶（BAP）酶联免疫吸附分析方法（ELISA）.方法 使用两株抗体,一株包被微孔板,另外一株用HRP标记.显色系统使用TMB显色.结果 测定范围在5～ 120ng/mL,最低检测限在1.5ng/mL,回收率在96.4％～ 102％之间,批内和批间变异分别为5.6％和7.9％,正常参考值为＜10ng/mL,用502份临床样本考核本试剂盒,与参比试剂盒有很好的临床符合性,与参比试剂盒具有同等的临床使用价值.     

CEA电化学发光免疫分析法的建立

目的建立人癌胚抗原（CEA）的电化学发光免疫分析法（ECLIA）。方法生物素标记的CEA McAb、钌复合物标记配对的CEA McAb、链霉亲和素包被的磁性微粒组成CEA ECLIA试剂,用ECLIA仪检测CEA并做方法学评价。用本法与进口的同类ECLIA试剂对119例结直肠癌、150例肺癌、45例胃癌、32例胰腺癌和34例肝细胞癌患者的血清CEA检测结果进行分析。调查218名志愿者血清CEA正常参考值。结果本法检测CEA的批内CV为1.6%～7.1%,批间CV为2.3%～11.7%,灵敏度为0.2 ng/mL。与CA19-9和AFP无交叉反应。自建ECLIA检测CEA浓度范围为0.2～1000.0ng/mL,正常参考值低于5.6ng/mL。结论自建CEA ECLIA与进口试剂比较（r=0.9641,P〈0.05）,正常参考范围接近进口同类方法。具备产业化的潜能。     

脂肪酸结合蛋白放射免疫分析方法的建立及初步应用

用人工重组的人脂肪酸结合蛋白(FABP)多次免疫大耳白兔,获取高效价的FABP抗体.用氯胺T法制备125I-FABP,再经Sephdex G-25纯化;抗原抗体反应采用平衡一步法,4℃培养24h后,经PR试剂分离结合和游离的标记抗原.该法测定范围5-405ng/mL,最低检出量为9ng/mL,批内和批间CV分别小于6.4%和8.5%.用该法测得人血清FABP含量:健康人(45名)为15.68±2.9ng/mL;重症监护病人(46例)为72.08±32.64ng/mL;心脏病患者(73例)为78.95±24.83ng/mL,明显升高.结果表明,本法稳定,简便特异,其灵敏度适于检出人血清FABP水平的变化.     

抗人甘露聚糖结合凝集素(MBL)单克隆抗体的制备、鉴定与检测方法的建立

目的 制备抗甘露聚糖结合凝集素(MBL)的单克隆抗体(McAb),建立免疫学检测方法.方法 以纯化MBL为抗原,免疫Ualb/c小鼠,制备单克隆抗体,鉴定其特性,建立并验证夹心ELISA定量检测法.结果 筛选出2株稳定分泌抗MBL的单抗杂交瘤细胞株,免疫球蛋白亚类均为IgG1.两单抗间抑制率＜50%,结合位点不同两单抗特异识别MBL.选择包被抗体B10浓度为8μg/mL,酶标抗体B3稀释度为1:500,建立夹心EIJSA定量检测法.该法检出范围为1～100 μg/mL,与其他抗原无交叉反应.重复性试验的批内批间变异均小于10%,回收率在101%～103%之间,cv小于7%.检测结果与国外试剂盒比较无显著差异.结论 制备的抗MBL单克隆抗体可用于MBL的免疫学检测.     

化学发光免疫分析血清C肽方法建立

双抗体夹心一步法建立人C肽(C-peptide) 化学发光免疫分析(CLIA)方法.方法可测范围0.15～15ng/mL,灵敏度0.02ng/mL,批内、批间变异系数(CV)分别为4.2%～6.5%和6.8%～9.3%,与胰岛素无交叉反应,与胰岛素原的交叉反应率为7.3%.本方法与国外同类试剂盒同时检测40份C-肽释放试验血清,相关系数为0.9709.本方法各项指标均满足临床检测要求,达到国外同类产品水平.     

乙肝病毒表面抗体TRFIA方法的建立及其应用

建立乙型肝炎病毒表面抗体(抗-HBs)的时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA).检测体系由纯化的HBsAg包被的微孔板、Eu3 标记的HBsAg、抗-HBs系列标准品和增强液组成,采用双抗原夹心法定量检测人血清或血浆抗HBs.测定药检所2、5、10 mIU/mL SAb血清盘均可准确检出,阴性血清(20/20)符合率为100%,CV为2.5%.测定范围为5～2000 mIU/mL,正常参考值小于10 mIU/mL.用本法与固相RIA、ELISA和ECLIA对1189份临床血样进行考核,并与参比试剂盒临床符合率一致,具有同等的临床诊断价值.     

双抗体夹心ELISA检测SEB方法的建立及在不同基质中检测的应用

目的:建立检测SEB的双单克隆抗体(mAb)夹心ELISA,并检测在多种基质中SEB的敏感性。方法:制备、纯化抗SEBmAbB4和D6。D6mAb标记辣根过氧化物酶(HRP)作为检测抗体,B4mAb作为包被抗体。结果:成功建立了敏感、特异检测SEB的ELISA方法,检测抗体稀释液和小牛血清中SEB,检测灵感度0.2μg/L,定量线性范围0.78～12.5μg/L,r2=0.992,批间变异系数(CV)<10%,回收率80%～110%。检测50g/L脱脂牛奶、尿液和自来水中的SEB,灵敏度0.39μg/L,定量线性范围0.78～25μg/L,r2=0.997。与SEA和SECl无交叉反应。结论:本方法测量准确,灵敏度高,特异性好,在食品工业和临床标本检测中有广阔的应用前景。     

快速检测游离前列腺特异性抗原 ELISA 方法的建立

 目的 建立快速检测人血清中游离前列腺特异抗原（f-PSA）的 ELISA 方法。 方法 利用抗 f-PSA 的单克隆抗体（单抗）杂交瘤细胞株，一株单抗 2D1 用于固相包被，另一株单抗2E4进行辣根过氧化物酶标记，采用二步法，建立定量测定人血清 f-PSA 的双抗体夹心ELISA法。对该法的敏感度、精密度、准确性、特异性进行了分析。应用该法与瑞典 CanAg 公司的f-PSA ELISA 试剂盒同时检测了 18 例前列腺癌和 25 例前列腺增生患者血清标本的 f-PSA 含量，进行了两种方法检测结果的相关性分析。 结果 以双抗体夹心 ELISA 法检测 f-PSA，在 f-PSA 0 ~ 20 μg/L 范围内线性良好；敏感度为 0.025 μg/L；批内变异系数为 4.5% ~ 6.2%，批间变异系数为 3.9% ~ 7.2%；回收率为 94.3% ~ 111.1%；与 α1 抗糜蛋白酶结合的结合型PSA 交叉率为 0.7 %；检测 43 份临床标本 f-PSA 含量的结果与瑞典 CanAg 公司 f-PSA 试剂盒检测结果的相关系数为 0.995。 结论 所建立的双抗体夹心 ELISA 方法是一种特异、敏感、简便实用的 f-PSA 快速检测方法，有助于在 PSA 低水平升高的重叠范围内（4 ~ 10 μg/L）鉴别前列腺增生与前列腺癌。     

表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)单链抗体亲和力检测的间接ELISA的建立及优化

目的建立检测表皮生长因子受体变体Ⅲ(EGFRvⅢ)单链抗体PD0721亲和力检测的ELISA,并且对实验条件进行优化。方法利用本课题组制备的单链抗体PD0721,建立检测PD0721单链抗体亲和力的间接ELISA,并采用棋盘滴定法对实验条件中的抗体抗原浓度、二抗浓度、包被条件等方面进行优化,对本方法的灵敏度及精密度进行考察。结果使用PBS稀释抗原至1.25 mg/L于4℃包被12 h,加入120 ng/mL PD0721单链抗体以及1∶8000的酶标抗体为最佳检测结果。优化后的结果,在PD0721单链抗体浓度为15 ng/mL~480 ng/mL范围内回归模型拟合效果良好,最低检测限为7.5 ng/mL。组内差异系数为0.11%~0.99%,组间差异系数为0.68%~3.15%。结论建立了能准确、稳定检测PD0721单链抗体亲和力的间接ELISA。     

Quantitative analysis of a prostate-specific antigen in serum using fluorescence immunochromatography

A quantitative analysis of prostate-specific antigen (PSA) in samples of human blood serum by fluorescence immunochromatography using monoclonal antibodies to PSA was developed. The fluorescence immunochromatographic analysis system is composed of anti-PSA-monoclonal antibody (mAb), fluorescence conjugates in detection solution, a immunochromatographic assay strip, and a laser fluorescence scanner. A fluorescence immunochromatographic analysis system was employed to detect PSA on the basis of the area ratio between the control line and the test line of the strip. Under optimal conditions, the area ratio was proportional to PSA concentration ranging from 0.72 to 46.0 ng/mL with a detection limit of 0.72 ng/mL.     

人血清透明质酸夹心化学发光免疫检测方法的建立

目的建立人血清透明质酸夹心化学发光免疫检测方法。方法用透明质酸结合蛋白分别进行固相载体包被和与辣根过氧物酶偶联,建立定量测定人血清透明质酸的夹心化学发光免疫检测法,并对该方法进行方法学和临床应用性评价。结果所建立血清透明质酸化学发光免疫检测法灵敏度为0.66μg/L,线性范围在1.8~1000μg/L,批内变异系数低于7.05%,批间变异系数低于8.0%,平均添加回收率为103.1%,稀释回收率为106.8%,与肝纤维化其他血清标志物IV型胶原、III型前胶原和层黏连蛋白的交叉反应率分别只有0.19%、0.16%和0.17%,样本中添加的抗凝剂及胆红素、胆固醇、甘油三酯等物质对检测结果没有影响。辽宁抚顺市传染病医院用该方法检测737份样本的临床总符合率为98.64%;检测197份样本透明质酸含量的结果与美国Corgenix试剂盒检测结果的相关性为y=0.855x+26.874(r=0.9877)。结论该方法灵敏度高、特性好、线性范围宽,有良好的准确性和重复性,完全可用于临床样本的肝纤维化检测。     

Accuracy of a high prostate-specific antigen level for prostate cancer diagnosis upon initial biopsy in Korean men

PURPOSE: This study aimed to evaluate the cancer detection rate in a Korean population with prostate-specific antigen (PSA) levels greater than or equal to 20.0 ng/mL. MATERIALS AND METHODS: A total of 174 men 50 to 79 years old (median 69) included in the study. The median prostate volume of the patients was 44.8 mL (range 14.1 to 210.0) and their serum PSA ranged from 20.0 to 9725.0 ng/mL (median 44.8). RESULTS: Of 174 men 141 (81.0%) were diagnosed with prostate cancer on initial biopsy. In the total number of patients, the positive predictive value (PPV) was 62.9% for PSA 20 to 29.9, 72.7% for PSA 30 to 39.9 and 100% for PSA 40 to 49.9 ng/mL. In patients with an abnormal digital rectal examination (DRE), the values for these PSA ranges increased to 89.5%, 91.7% and 100%, respectively. The PPV was 81.0% for PSA cutoff of 20, 89.2% for a cutoff of 30, 95.4% for a cutoff of 40, and 94.7% for a cutoff of 50 ng/mL. In conjunction with an abnormal DRE, the values for these PSA cutoffs increased to 95.9%, 98.1%, 100%, and 100%, respectively. CONCLUSION: Our data suggest the ability to predict the presence of prostate cancer reliably on initial biopsy when PSA threshold is greater than or equal to 50 ng/mL. This PSA threshold may be lowered to 40 ng/mL in the presence of an abnormal DRE. In Korean men with high PSA, the detection rate of prostate cancer on biopsy appears to be comparable to that for American men.     

卡洛芬单克隆抗体的制备

目的:制备卡洛芬单克隆抗体,为研制卡洛芬的免疫学快速检测奠定基础。方法:通过活性酯法制备了以牛血清白蛋白(BSA)为载体的免疫抗原卡洛芬-BSA(Carprofen-BSA)和以卵清白蛋白(OVA)为载体的检测抗原卡洛芬-OVA(Carprofen-OVA)。通过免疫BALB/ c 小鼠、杂交瘤技术获得稳定分泌卡洛芬单抗的细胞株51C3,并通过变异系数及添加回收率的测定初步建立了卡洛芬的ELISA 检测方法。结果:将该细胞株注射BALB/ c 小鼠制备腹水单抗。腹水纯化后效价为1 .3.2*105 ,属于IgG1 型。卡洛芬单抗的灵敏度为0.32 ng/ ml,IC50 为0.882 ng/ ml。单抗与布洛芬、酮洛芬、萘普生、非诺洛芬、吲哚洛芬、芬布芬的交叉反应率均小于0.04%。且猪肉样品中卡洛芬的添加回收率在81.4% ~ 104.4% 之间,变异系数在16.3% ~25.8%之间。结论:本研究成功制备了卡洛芬单克隆抗体,该单抗可以成功应用于卡洛芬的ELISA 快速检测,为研制卡洛芬的胶体金快速检测奠定基础。